Verfahren zur Aufzucht von Drosophila melanogaster unter axenic und gnotobiotischer Bedingungen vorgestellt. Fly Embryonen werden in Natriumhypochlorit, aseptisch in sterile Ernährung dechorionated und aufgezogen in geschlossenen Behältern. Impfen Ernährung und Embryonen mit Bakterien führt zu gnotobiotischer Verbänden und bakterielle Präsenz wird durch Plattierung Ganzkörper- Drosophila Homogenate bestätigt.
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Erratum-Hinweis
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Der Einfluss von Mikroben auf unzählige Eigenschaften und Verhaltensweisen von Tieren wurde in den letzten Jahren zunehmend erkannt. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Modell zum Verständnis mikrobieller Interaktionen mit tierischen Wirten, das durch Ansätze zur Aufzucht großer Stichprobengrößen von Drosophila unter mikroorganismenfreien (axenischen) Bedingungen oder mit definierten mikrobiellen Gemeinschaften (gnotobiotisch) erleichtert wird. Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Entnahme von Drosophila-Embryonen, zur Hypochlorit-Dechorionierung und -Sterilisation und zur Überführung in die sterile Nahrung. Sterilisierte Embryonen werden in 50-ml-Zentrifugenröhrchen steril gefüttert, und die sich entwickelnden Larven und erwachsenen Tiere bleiben bis zum Öffnen der Fläschchen frei von exogenen Mikroben. Alternativ können Fliegen mit einer definierten Mikrobiota aufgezogen werden, indem steriles Futter und Embryonen mit mikrobiellen Spezies von Interesse geimpft werden. Wir beschreiben die Einführung von 4 Bakterienarten, um eine repräsentative gnotobiotische Mikrobiota in Drosophila zu etablieren.Schließlich beschreiben wir Ansätze zur Bestätigung der Zusammensetzung der Bakteriengemeinschaft, einschließlich der Prüfung, ob axenische Drosophila bis ins Erwachsenenalter bakterienfrei bleiben.
Einleitung
Die meisten Tiere sind eng mit Bakterien ( 'Mikrobiota') von der Geburt bis zum Tod 1 verbunden. Vergleiche von Mikroorganismen frei ( 'axenic') und Mikroorganismen verbunden sind ( "konventionelle") Tiere haben Mikroben verschiedene Aspekte der Tiergesundheit beeinflussen gezeigt, einschließlich Stoffwechsel, Ernährung, Kreislauf-, Leber-, Atemwegserkrankungen, immunologische, endokrine und neurologische Funktion 2. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein Schlüsselmodell für 3,4 in Gegenwart von Mikroben viele dieser Prozesse verstehen und Mikrobiota Einfluss auf die Tiergesundheit 5,6 für....
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Protokoll
1. Kultur Bakterien (Start ~ 1 Woche vor der Eier Picking)
- Bereiten modifizierten MRS 20 (MMRs) -Platten und Brühe Rohre (Tabelle 1). Gießen Sie 20 ml MMRS Agar in jede 100 mm Petrischale und erlauben / trocken über Nacht abkühlen, oder 5 ml MMRS Brühe in 18 mm-Teströhrchen.
- Streak Acetobacter pomorum, A. tropicalis, Lactobacillus brevis und L. plantarum auf MMRS Agarplatten. Inkubieren Acetobacter über Nacht bei 30 ° C. Inkubieren Lactobacillus anaerob durch die Platten in einem luftdichten Behälter und Flutung mit Kohlendioxid Platzierung vor dem Versiegeln. über ....
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Ergebnisse
Erfolgreiche Aufzucht von axenic Fliegen wird durch Isolierung ohne KBE von Ganzkörper - Homogenisierungen von D. bestätigt melanogaster Erwachsenen (Abbildung 1). Alternativ, wenn das plattierte Homogenat Kolonien ergibt, werden die Vials kontaminiert und muss entsorgt werden. Für gnotobiotischen Fliegen wurden jeden der vier Bakterien Isolate aus Pools von 5 erwachsenen Männchen getrennt, Unterschiede in Gesamtkeim CFUs demonstrieren mit erwachsenen F.......
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Diskussion
Das hier beschriebene Verfahren ist eines von mehreren Ansätzen für Embryo dechorionation 8,11,18,25,26,27, zusammen mit alternativen Methoden der axenic Fliegen Aufzucht, einschließlich der seriellen Übertragung von axenic Erwachsene 18,27 oder Antibiotika - Behandlung 13,18. Andere dechorionation Methoden schließen Ethanol wäscht und reduzieren 11,25,26 oder 8 Hypochlorit Behandlung verlängern. Verschiedene Waschschritte helfen können verschiedene Fliegen Ge.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Einige Details dieses Protokoll wurden mit Unterstützung von Dr. Adam Dobson optimiert, der auch hilfreiche Kommentare zum Manuskript zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wurde von der Stiftung für die National Institutes of Health (FNIH) Gewährungsnummer R01GM095372 (JMC, A (CN) W, AJD und AED) unterstützt wurde. FNIH Gewährungsnummer 1F32GM099374-01 (PDN) und Brigham Young University Startfonds (JMC, MLK, MV). Publikationskosten wurden von der Brigham Young University College of Life Sciences und Department of Plant and Wildlife Sciences unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Bierhefe | MP Biomedicals, LLC. | 903312 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=02903312 |
| Glucose | Sigma Aldrich | 158968-3KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/158968?lang=en®ion=US |
| Agar | Fisher--Lab Scientific | fly802010 | https://www.fishersci.com/shop/products/drosophila-agar-8-100mesh-10kg/nc9349177 |
| Welch's 100% Traubensaftkonzentrat | Walmart oder andere Lebensmittelgeschäfte | 9116196 | http://www.walmart.com/ip/Welch-s-Frozen-100-Grape-Juice-Concentrate-11.5-oz/10804406 |
| Käfig: 32 oz. Durchscheinender runder Feinkostbehälter | Webstaurant Store | 999L5032Y | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-sd5032y-32-oz-translucent-round-deli-container-24-pack/999L5032Y.html |
| durchscheinender runder Feinkostbehälterdeckel | Webstaurant Store | 999YNL500 | http://www.webstaurantstore.com/newspring-delitainer-ynl500-translucent-round-deli-container-lid-60-pack/999YNL500.html |
| Lagerflaschen | Genesee Scientific | 32-130 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=32-130 |
| Droso-Plugs | Genesee Scientific | 49-101 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=49-101 |
| Nylon Mesh | Genesee Scientific | 57-102 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/715/?product=57-102 |
| Kunststoff-Buchse | Home Depot | 100404002 | http://www.homedepot.com/p/Carlon-1-in-Non-Metallic-Terminal-Adapter-E943FR-CTN/100404002 |
| Kunststoff-Buchsenkappe | Home Depot | 100153897 | http://www.homedepot.com/p/1-1-4-in-starr-Kunststoff-isolierte-Buchse-2-Pack-27529/100153897 |
| Probenbecher | MedSupply Partners | K01-207067 | http://www.medsupplypartners.com/covidien-specimen-containers.html |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Manual-Liquid-Handling-44563/Dispensers--Burettes-44566/Repeater-M4-PF-44619.html |
| 50 ml Zentrifugenröhrchen | TrueLine Zentrifugenröhrchen | TR2003 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=TR2003 |
| Food Boxen | USA Wissenschaftlich | 2316-5001 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=2316-5001 |
| Lysing Matrix D Bulk | MP Biomedicals, LLC. | 116540434 | http://www.mpbio.com/search.php?q=6540-434&s=Search |
| Filter-Pipettenspitzen, 300 μ l | USA Scientific | 1120-9810 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1120-9810 |
| Verkauf von Petrischalen Laborprodukten | M089303 | https://www.lpsinc.com/Catalog4.asp?catalog_nu=M089303 | |
| Ethanol | Decon Laboratories, INC. | 2701 | http://www.deconlabs.com/products.php?ID=88 |
| Pinsel | Walmart | 5133 | http://www.walmart.com/ip/Chenille-Kraft-5133-Acrylic-Handled-Brush-Set-Assorted-Sizes-colors-8-Brushes-set/41446005 |
| Pinzette | Fisher | 08-882 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-medium-pointed-forceps-3/p-128693 |
| Haushaltsbleiche (6-8% Hypochlorit) | Walmart | 550646751 | http://www.walmart.com/ip/Clorox-Concentrated-Regular-Bleach-121-fl-oz/21618295 |
| Universal Pepton | Genesee Scientific | 20-260 | https://geneseesci.com/shop-online/product-details/?product=20-260 |
| Hefeextrakt | Fisher Scientific | BP1422-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisher-bioreagents-microbiology-media-additives-yeast-extract-3/bp1422500?matchedCatNo=BP1422500 |
| Dikaliumphosphat | Sigma Aldrich | P3786-1KG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=P3786-1KG&interface=All& N=0& mode=match%20partialmax& lang= DE& region=US& focus=product |
| Ammonium Citrat | Sigma Aldrich | 25102-500g | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=25102-500g&interface=All&N =0& mode=match%20partialmax& lang= DE& region=US& focus=product |
| Natriumacetat | VWR | 97061-994 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=97061-994 |
| Magnesiumsulfat | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?matchedCatNo=M63500 |
| Mangansulfat | Sigma Aldrich | 10034-96-5 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search?term=10034-96-5&interface=CAS%20No.&N=0&mode=match %20partimax& lang=de& region =US& focus=product |
| MRS Powder | Sigma Aldrich | 69966-500G | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/69966?lang=en®ion=US |
| 96 Well Plate Reader | BioTek (Epoch) | NA | http://www.biotek.com/products/microplate_detection/epoch_microplate_ spectrophotometer.html |
| 1,7 ml Zentrifugenröhrchen | USA Scientific | 1615-5500 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1615-5500 |
| Filter-Pipettenspitzen, 1.000 μm; l | USA Scientific | 1122-1830 | http://www.usascientific.com/search.aspx?find=1122-1830 |
| 96-Well-Platten | Greiner Bio-One | 655101 | https://shop.gbo.com/en/usa/articles/catalogue/article/0110_0040_0120_0010/ 13243/ |
| Keramikperlen | MP Biomedicals, LLC. | 6540-434 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116540434 |
| Gewebe-Homogenisator | MP Biomedicals, LLC. | 116004500 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=116004500 |
| BioSicherheitswerkbank Klasse 1 | Thermo Scientific | Modell 1395 | http://www.thermoscientific.com/en/product/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-packages.html |
Referenzen
- McFall-Ngai, M. J. Giving microbes their due--animal life in a microbially dominant world. J Exp Biol. 218, (Pt 12) 1968-1973 (2015).
- Smith, K., McCoy, K. D., Macpherson, A. J. Use of axenic animals in studying the adaptation of mammals to their co....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions
Posted by JoVE Editors on 8/18/2020. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions. The Protocol was updated.
Step 6.1.4.2 of the Protocol was updated from:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.052), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.056), L. plantarum (0.077).
to:
If using the 4 species described here, normalize cells to equivalent colony forming unit (CFU)/ml densities (OD600 to CFU conversion determined previously20) using this equation:
E = ((O-B) x V x D)/C
where E = volume to resuspend pellet in (μl), O = OD600 bacteria, B = OD600 blank media, D = fold-dilution, V = µl bacterial culture prior to centrifugation, C = OD600 of predetermined constant. See Supplemental Code File for examples of calculations using these equations. For spectrophotometers that automatically blank, use "O" in place of "O-B".
Note: The predetermined constants (units OD600, normalized to 107 CFU ml-1, constants derived in20) are as follows: A. tropicalis (0.053), A. pomorum (0.038), L. brevis (0.077), L. plantarum (0.056).
