Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

11.2K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/54227

⸱

24. Oktober 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Adaptive Evolution und Isolationstechniken sind beschrieben und gezeigt , Derivate von Scheffersomyces stipitis - Stamm NRRL Y-7124 zu erhalten , die der Lage sind, schnell Hexose und Pentose - Zuckern in gemischten Enzym verbrauchen verzuckert undetoxified Hydrolysate und über 40 g / l Ethanol zu akkumulieren.

Zusammenfassung

Lignozellulosehaltige Biomasse ist ein reichlich vorhandener, erneuerbarer Rohstoff, der für die Herstellung von Ethanol und anderen Bioprodukten in Kraftstoffqualität nützlich ist. Bei der Vorbehandlung und der Enzymverzuckerung werden Zucker freigesetzt, die von der Hefe fermentiert werden können. Herkömmliche Industriehefen fermentieren keine Xylose (die bis zu 40 % Pflanzenzucker enthält) und sind nicht in der Lage, in konzentrierten Hydrolysaten zu funktionieren. Konzentrierte Hydrolysate werden benötigt, um eine wirtschaftliche Ethanolrückgewinnung zu unterstützen, aber sie sind mit giftigen Nebenprodukten beladen, die bei der Vorbehandlung entstehen. Entgiftungsmethoden können Hydrolysate zwar fermentierbar machen, sind aber kostspielig und verursachen Verbindlichkeiten bei der Abfallentsorgung. In dieser Arbeit werden adaptive Evolutions- und Isolationstechniken beschrieben und demonstriert, um Derivate des nativen Scheffersomyces stipitis-Stammes NRRL Y-7124 zu erhalten, die in der Lage sind, Hydrolysate trotz widriger Kulturbedingungen effizient in wirtschaftlich gewinnbares Ethanol umzuwandeln. Verbesserte Individuen werden in einer sich entwickelnden Population unter Verwendung von Mehrfachselektionsdruck angereichert, der auf der natürlichen genetischen Vielfalt der S. stipitis-Population beruht, und Mutationen, die durch Exposition gegenüber zwei verschiedenen Hydrolyzaten, Ethanol oder UV-Strahlung, induziert werden. Kulturen der Endevolution werden verdünnt, um vorherrschende Isolate zu ernten, während Zwischenpopulationen, die in verschiedenen Stadien der Evolution in Glycerin eingefroren wurden, auf selektiven Medien unter Verwendung geeigneter Stressgradienten angereichert werden, um die vielversprechendsten Isolate durch Verdünnungsbeschichtung zurückzugewinnen. Die Isolate werden auf verschiedene Hydrolysattypen gescreent und mit einem neuartigen Verfahren eingestuft, das dimensionslose RPI-Transformationen (Relative Performance Index) der Xylose-Aufnahmerate und der Ethanolausbeutedaten umfasst. Unter Verwendung des statistischen RPI-Parameters wird ein relativer Leistungsdurchschnitt berechnet, um die Isolate auf der Grundlage mehrerer Faktoren zu bewerten, einschließlich der Kulturbedingungen (unterschiedlich in Bezug auf Nährstoffe und Inhibitoren) und der kinetischen Eigenschaften. Durch die Anwendung dieser Techniken wiesen Derivate des Elternstamms die folgenden verbesserten Eigenschaften in enzymverzuckerten Hydrolysaten bei pH 5-6 auf: reduzierte anfängliche Verzögerungsphase vor dem Wachstum, reduzierte diauxische Verzögerung während des Glukose-Xylose-Übergangs, signifikant verbesserte Fermentationsraten, verbesserte Ethanoltoleranz und Akkumulation auf 40 g/l.

Einleitung

Schätzungsweise jährlich 1,3 Milliarden trockenen Tonnen Lignocellulose - Biomasse könnte die Ethanolproduktion und damit die USA zu verringern , seine Erdölverbrauch um 30%. 1 Obwohl pflanzliche Biomasse Hydrolyseausbeuten Zuckermischungen reich an Glucose und Xylose, Fermentationsinhibitoren erzeugt werden durch die chemische Vorbehandlung unterstützen notwendig Hemicellulose zu brechen und zu entlarven Cellulose für einen enzymatischen Angriff. Essigsäure, Furfural und Hydroxymethylfurfural (HMF) sind gedacht, Schlüsselkomponenten unter vielen Inhibitoren zu sein, die während der Vorbehandlung bilden. Um die Lignocellulose äthanolindustrie vorwärts zu bewegen, Forschung und Verfahren, um die Entwicklung von Hefestämmen zu ermöglichen, überlebensfähig und effizient sowohl Hexose und Pentose-Zuckern in Gegenwart solcher inhibitorischen Verbindungen nötig sind, um die Verwendung funktionieren. Eine signifikante zusätzliche Schwäche der traditionellen industriellen Hefestämmen, wie Saccharomyces cerevisiae, ist die Unfähigkeit , effizient ferment die Xylose in Hydrolysaten pflanzlicher Biomasse.

Pichia stipitis Typ - Stamm NRRL Y-7124 (CBS 5773), die vor kurzem umbenannt Scheffersomyces stipitis, ist eine native Pentose gärenden Hefe , die gut bekannt ist , Xylose zu Ethanol zu vergären. 2,3 Die Entwicklung der Stamm NRRL Y-7124 wurde hier verfolgt , weil es wurde dokumentiert von mehr als 40 g / l mit dem Nebenprodukt wenig Xylit haben das größte Potenzial von nativen Hefestämme wirtschaftlich gewinnbaren Ethanol zu akkumulieren. 4,5,6 bei optimalen Medien, S. stipitis - Stamm NRRL Y-7124 produziert 70 g / L Ethanol in 40 Stunden (1,75 g / L / h) bei einer Ausbeute von 0,41 ± 0,06 g / g in hochdichten Zellkulturen (6 g / l Zellen). 7,8 Resistance Fermentationsinhibitoren Ethanol, Furfural und HMF hat auch 9 und S. berichtet worden stipitis wurde unter vielversprechendsten nativen Pentose-fermentierenden Hefen für kommerziellen Maßstab Ethanol productio Platzn aus Lignocellulose. 10 Unser Ziel war es diverse undetoxified Lignocellulose - Hydrolysaten und Ethanol Selektionsdruck anwenden zu zwingen Entwicklung hin zu einem robusteren Derivat von Stamm NRRL Y-7124 geeignet für industrielle Anwendungen. Die wichtigsten unter verbesserten Features waren gesucht schneller Zucker Aufnahmeraten in konzentrierter Hydrolysate, reduziert diauxy für effizientere Mischzuckerverwertung und höhere Toleranzen von Ethanol und Inhibitoren. Die Anwendung von S. stipitis zu undetoxified Hydrolysate war ein Schwerpunkt der Forschung den zusätzlichen Betriebskosten mit Hydrolysat Entgiftungsprozesse, wie overliming assoziiert zu beseitigen.

Zwei industriell vielversprechende Hydrolysate wurden zu zwingen Evolution angewandt. Enzym verzuckerten Ammoniak Faser Expansion vorbehandelten Maisstroh - Hydrolysat (AFEX CSH) und Säure vorbehandelt Switchgrass- Hydrolysat Lauge (PSGHL) verdünnen 11,12 AFEX Vorbehandlungstechnologie entwickelt wird , umdie Herstellung von Fermentationsinhibitoren zu minimieren, während verdünnte Säurevorbehandlung stellt praktiziert die aktuelle niedrigsten Kosten-Technologie am häufigsten Zellulose-Biomasse zur enzymatischen Verzuckerung zu belichten. PSGHL ist trennbar von der Cellulose nach der Vorbehandlung verbleibenden und ist charakteristisch reich an Xylose aus dem hydrolysierten Hemicellulose, aber wenig Glukose. AFEX CSH und PSGHL Zusammensetzungen unterscheiden sich voneinander in wichtigen Aspekten, die die Evolutionsprozess zu verwalten ausgebeutet wurden. AFEX CSH niedriger in furan Aldehyde und Essigsäure Inhibitoren aber höher in Aminosäuren und Ammoniak Stickstoffquellen im Vergleich mit PSGHL (Tabelle 1). PSGHL stellt die zusätzliche Herausforderung von Xylose die vorherrschende Zucker zur Verfügung stehen. So ist PSGHL angemessen speziell in Hydrolysaten für verbesserte Xyloseverwertung zu bereichern, eine Schwäche kommerzielle Nutzung der verfügbaren Hefe zu verhindern. Auch unter den einheimischen Pentose gärenden Hefen, die das Vertrauen auf die suboptimale Zucker Xylose Zellwachstum zu unterstützen und die Reparatur wird noch schwieriger in Hydrolysaten wegen einer Vielzahl von Gründen. Nährstoffmangel, Inhibitoren große Schäden verursachen strukturelle Integrität zu Zelle und Unterbrechung Metabolismus aufgrund redox Ungleichgewichten 9 Stickstoffergänzung, insbesondere in Form von Aminosäuren können eine erhebliche Betriebskosten für Gärungen darstellen. Die Auswirkungen der Stickstoff-Supplementation auf Isolat Screening und Ranking wurde mit Switchgrass Hydrolysate erforscht.

Verbesserte Personen wurden in einer sich entwickelnden Bevölkerung mit mehreren Selektionsdruck angewiesen auf natürliche genetische Vielfalt des S. angereichert stipitis Bevölkerung und von Forderungen an zwei unterschiedlichen Hydrolysate induzierte Mutationen, Ethanol oder UV - Strahlung. Selektionsdruck wurden parallel und in Serie angewandt , um die Evolution Fortschritt von S. zu erkunden stipitis in Richtung gewünschten Derivate der Lage zu wachsen und effizient in Hydrolysaten gären(Abbildung 1). Die wiederholte Kultivierung von funktionellen Populationen in zunehmend herausfordernden Hydrolysate wurde erreicht, in Mikrotiterplatten einer Verdünnungsreihe von entweder 12% Glucan AFEX CSH Einsatz oder auch PGSHL bei 20% Feststoffbeladung hergestellt. Die Anwendung von Ethanol-herausgefordert Wachstum auf Xylose in einer kontinuierlichen Kultur weiter verbessert AFEX CSH angepasst Populationen von für Phänotypen Anreicherung demonstriert weniger Anfälligkeit Unterdrückung der Xyloseverwertung zu Ethanol. Letztere Funktion wurde vor kurzem als problematisch Pentose Nutzung durch den Stamm NRRL Y-7124 gezeigt folgenden Glucosevergärung. 8 Anreicherung auf PSGHL wurde neben Hydrolysat Funktionalität zu erweitern sucht.

Vermeintliche verbesserte Derivate von S. stipitis NRRL Y-7124 wurden von jeder Phase des Evolutionsprozesses isoliert Plattierung durch gezielte Anreicherung unter Stressbedingungen und Verdünnung Kolonien von den am weitesten verbreiteten Bevölkerung zu holen. dimensionslos relativPerformance-Indizes (RPI) wurden verwendet, um Stämme basierend auf die Gesamtleistung Rang, wo kinetische Verhalten auf den verschiedenen Hydrolysat-Typen und Nahrungsergänzungsmittel angewendet wurde bewertet. Auch wenn die Erfolge der verschiedenen Anpassungsverfahren die Funktionalität von S. zu verbessern stipitis in Lignocellulose - Hydrolysate wurden bereits dokumentiert, Zerrungen wirtschaftliche Ethanolproduktion auf undetoxified Hydrolysate zeigen bisher nicht berichtet worden. 13-17 die Evolutionsverfahren Verwendung näher visualisiert werden hier Slininger et al. 18 Stämme entwickelt , die deutlich verbessert werden über der Elternstamm NRRL Y-7124, und sind in der Lage von> 40 g / L Ethanol in AFEX CSH zu produzieren und verzuckerten Switch Hydrolysat (SGH) entsprechend ergänzt mit Stickstoffquellen Enzyms. Diese neuen Stämme sind von zukünftigen Interesse für die Entwicklung von Lignocellulose-Ethanol-Industrie und als Gegenstand weiterer Genomik Studien Gebäudeauf denen der zuvor Stamm sequenziert NRRL Y-11545. 19 während der verschiedenen Phasen der Evolution Eine Genomik Studie der Top - Stämme in Abbildung diagramed 1 erzeugt würde die Geschichte von genetischen Veränderungen aufzuklären , die während der Entwicklung als Auftakt fiel Stammverbesserung Forschung fördern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Bereiten Sie Materialien und Geräte für Tests starten

  1. Bereiten Sie Hydrolysate mit 18 bis 20% anfängliche Biomassetrockengewicht in der Vorbehandlungsreaktion für den Einsatz in der Entwicklung, Isolation und Ranking-Verfahren. Siehe Slininger et al. 2015 18 für die detaillierten Methoden AFEX CSH, PSGHL und SGH mit Stickstoff Ergänzungen N1 oder N2 in der Evolution, Isolation oder das Ranking verwendet vorzubereiten. Siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung jedes Hydrolysat - Typ.
    HINWEIS: Nitrogen Befestigungen von SGH wurden als SGH-N1 oder SGH-N2 bezeichnet wie folgt definiert: SGH-N1 = SGH bis 42 befestigte: 1 molar Kohlenstoff zu Stickstoff-Verhältnis (C: N) mit Stickstoffquellen einschließlich Harnstoff, Vitamin-freie Amino- Säuren, die aus Casein, D, L-Tryptophan, L-Cystein und Vitamine aus definierten Quellen (so dass ~ 15% der molar Stickstoff N ist primären Aminostickstoff (PAN) und ~ 85% N von Harnstoff); 1: C: SGH-N2 = SGH bis 37 befestigte N mit Harnstoff und Sojamehl als den niedrigsten Kosten kommerzielle Quelle of Aminosäuren und Vitamine, die Bereitstellung ~ 12% N von PAN und 88% als Harnstoff.
  2. Erwerben Sie eine gefriergetrocknete Kultur des Elternstamm Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 (CBS 5773) von der ARS Culture Collection (Nationales Zentrum für landwirtschaftliche Nutzung Forschung, Peoria, Illinois), und bereiten Kulturen Glycerolstammlösung wie verwiesen. Pflegen Stammkulturen der Mutter Hefe und seine Derivate in 10% Glycerin bei -80 ° C.
    1. Streak Glycerin Aktien Hefe Malz Pepton Dextrose (YM) Agarplatten (3 g / l Hefeextrakt, 3 g / l Malzextrakt, 5 g / l Pepton, 10 g / l Dextrose, 20 g / l Agar) und Inkubation 48- 72 Stunden bei 25 ° C. 8 entwickelten Platten können bei 4 ° C bis zu einer Woche gelagert werden vor als flüssige Vorkultur Inokula zu verwenden.
  3. Bereiten Optimal Defined Medium (ODM), ein synthetisches Medium kompatibel mit Industrieformulierungsverfahren 20 , die zuvor für die optimale Umwandlung von Xylose zu Ethanol von der Mutter str entwickelteain Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124. 7 Verwenden Sie den definierten Medium in allen Vorkulturen und Kulturen für Gärleistung Biotests und auch für Ethanol in Frage gestellt, Xylose-fed kontinuierliche Kultur Evolution. ODM - Zusammensetzung wird als Referenz in Tabelle 2 aufgeführt.
  4. Wie zuvor beschrieben, 18 Zellbiomasse unter Verwendung eines cuvette- oder Mikroplattenlese - Spektralphotometer, gegebenenfalls analysieren, Kultur Extinktion bei 620 nm (A 620) zu messen. Quantifizieren Zuckern, Ethanol, Furfural, Hydroxymethylfurfural (HMF) und Essigsäure in Kulturproben Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Roboter enzymatische Bestimmung von Glucose und Xylose für höheren Durchsatz.

2. Bereichern Robust Derivate bei der seriellen Übertragung auf AFEX CSH

  1. Impfen eine Vorkultur von Stamm NRRL Y-7124. Übertragungszellen von YM Agar zu 75 ml ODM + 150 g / L Xylose zu erhalten, die Fähigkeit, unter o wachsensmotic Stress. Inkubieren Vorkulturen in 125 ml-Flaschen geschlossen mit Silizium Schwamm 24 Stunden unter Schütteln (150 Umdrehungen pro Minute, 1 "Orbit) bei 25 ° C eingesteckt wird.
  2. Tauen gefrorenen Teilmengen von 6-12% Glucan AFEX CSH in kaltem Wasser für den Einsatz. PH-Wert auf 5, wenn nötig und Filter sterilisieren vor einer Verdünnungsreihe in Herstellung 96-well Mikrotiterplatten.
  3. Füllen Sie Mikrotiterplatten mit 50 ul pro Vertiefung und 8 Vertiefungen pro Hydrolysat Verdünnung, dann impfen mit wenigen Mikrolitern Vorkultur pro Vertiefung eine anfängliche Absorption (620 nm) A 620 ≥0.1 zu ermöglichen. Inkubieren Platten statisch 24-48 Stunden bei 25 ° C in einem Kunststoffkasten mit einem nassen Papiertuch für Feuchtigkeit.
  4. Unter Verwendung der am stärksten konzentrierten Hydrolysats Verdünnungs die sichtbar zu A 620 wuchs> 1 ist , Transfer 1-5 & mgr; l in jede Vertiefung einer neuen Serie Hydrolysat Verdünnungsanfangs A 620 ≥0.1 zu erreichen.
  5. Überwachen Wachstumskultur A 620 in Mikrotiterplatten mit einem Spektralphotometer. Eine ungeimpften Verdünnungsreihe serves als Steuer- und leer. Teller Deckel sind links auf die während der Kontamination zu verhindern überwachen und die Messwerte entsprechend angepasst.
  6. Bereiten Glycerinstammanpassungs Kulturen regelmäßig für die anschließende Isolierung von verbesserten Stämmen oder zur Verwendung in reinoculating die kontinuierliche Hydrolysat Verdünnungsreihe. Zur Vorbereitung Aktien, Pool vier Brunnen (200 ul) der größte Hydrolysat Konzentration besiedelt. Mix 1: 1 mit 20% sterilem Glycerol in Kryoröhrchen, Zellen in 10% Glycerol bei -80 ° C zu gefrieren.
  7. Wiederholen Sie die Schritte 2,3-2,6, bis das Wachstum bei 12% Glucan AFEX CSH durchweg sichtbar bei 24 Stunden ist.

3. Isolieren Single Cell Tolerant Derivate nach Anreicherung auf AFEX CSH

  1. Streak ausgewählt Glycerinstammanpassungs Kulturen zu YM Agar und Verwendung Streifen zu impfen 50 ul 3% oder 6% Glucan AFEX CSH (pH 5) in jeder der drei Mikrotitervertiefungen (Initiale A 620 ~ 0.1). Inkubieren Mikrotiterplatten 24 Stunden, wie in Schritt 2.3. Pool Replikte kolonisiert Brunnen auf dem höchsten Hydrolysat Stärke mit einem starken Wachstum und Verdünnungsplatte oder 6% Glucan AFEX CSH Agar YM. Bereiten Sie die letztere als ein 1: 1-Mischung von Filter 12% Glucan AFEX CSH mit warmem autoklaviert 30 g / l Agar-Lösung sterilisiert.
  2. Wählen Sie 5 Einzelkolonien von der höchsten Verdünnungsplatte zeigt das Wachstum nach 24-48 h Inkubation bei 25 ° C als Glycerin-Stammkulturen einzufrieren. Streak jede Kolonie auf einer YM Platte. Inkubiere 24 Stunden. Mit einer sterilen Schleife, übertragen eine entwickelte Streifen von Zellen auf ein kleines Volumen von 10% Glycerin, mischen Zellen zu suspendieren und zu verteilen, um 2-3 Kryovials für bei -80 ° C einfrieren.

4. Bewerten Leistung von AFEX CSH Tolerant Derivate im Vergleich zu Eltern

  1. Test-Isolat in Einfache 6% Glucan AFEX CSH Batch-Kulturen.
    1. Transfer - Zellen von 48 h - Platten ausgestrichen aus Glycerinstamm auf pH 7 Kaliumphosphat - Puffer (0,4 mM) Zellsuspensionen mit A 620 = 10. Mit 1 ul vorzubereitenJede Suspension zu jeder von vier Vertiefungen von 50 & mgr; l 3% Glucan Hydrolysat inokulieren A 620 = 0,2 bis initial. Inkubieren Mikrotiterplatten 24 Stunden, wie in Schritt 2.3. Bereiten Sie die 3% Glucan AFEX CSH bei pH 5 um 12% Glucan AFEX CSH 1 Verdünnung: 3 mit sterilem Wasser.
    2. Übertragen zwei 24-Stunden-Mikrotitervertiefungen 25 ml Vorkulturen bei 50% der vollen Stärke verwendet pH 5 12% Glucan AFEX CSH zu impfen. Inkubieren Vorkulturen in 50 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse für 24 Stunden bei 25 ° C, ~ 150 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) Bereiten Sie die Halb Stärke 12% Glucan AFEX CSH durch das Hydrolysat 1 verdünnt. 1 mit sterilem Wasser.
    3. Verwenden halber Stärke - Hydrolysat Vorkulturen ähnlich 25 ml Wachstumskulturen zu impfen A 620 = 0,1 bis paraphieren. Inkubieren der Wachstumskulturen wie oben (4.1.2) und Probe täglich (0,2 ml). Monitor Anhäufungen von Biomasse (A 620) und die Konzentrationen von Zuckern und Fermentationsprodukte (HPLC).
  2. Alternativ repitch (dh Ernte und reuse) Populationen von 6% Glucan AFEX CSH wachsene Hefe zum Testen in 8% Glucan Hydrolysat Batch - Kulturen, wie zuvor beschrieben. 18
  3. Alternativ weitere Testpopulationen repitched 6% Glucan CSH Kulturen AFEX indem sie mit 12% Glucan Hydrolysat Einspeisen, wie dies zuvor beschrieben ist . 18
  4. Testen Sie diauxischen Verzögerung der Isolate in Batch-Kulturen von ODM mit gemischten Zucker.
    1. Impfen Vorkulturen von 75 ml ODM mit 150 g / l Xylose in 125 ml-Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse durch Schleifenübertragung von YM Glycerin Streifen. Inkubiere 24 h, wie in Schritt 2.1.
    2. Verwenden Vorkulturen auf ähnliche 75 ml Testkulturen Beimpfen mit ODM, enthaltend 75 g / l Glucose und 75 g / L Xylose bei pH 6,5. Schüttelkolben bei 25 ° C, 150 Upm. Probieren Sie täglich.
    3. Alternativ testen Sie die Auswirkungen von 0-15 g / l Essigsäure auf diauxy während der Fermentation von Glucose und Xylose durch ein ähnliches Protokoll, mit der Ausnahme anfängliche pH-Wert bei 6,0 ± 0,2 in Testkulturen eingestellt ist pH-Wert aufrechtzuerhalten 6-7 duEssigsäure Verbrauch Ring, wie zuvor beschrieben. 18

5. Tragen Sie kontinuierlichen Kultur zu wählen für Ethanol-herausgefordert Xyloseverwertung

  1. Bereiten ODM als kontinuierliche Kultur Zufütterungsmedium mit 60-100 g / L Xylose, 20-50 g / L Ethanol bei pH 6,3 ± 0,2. Wählen Kombinationen von Xylose und Ethanol die partielle Fermentation von 150 g / L Xylose zu simulieren, eine potentielle Ausbeute von ~ 0,5 g Ethanol / g Xylose vorausgesetzt, und das Potential für 50-70 g / L Ethanol aufzunehmen auftreten. 8
  2. Um die kontinuierliche Kultur Inokulum vorzubereiten, übertragen eine repräsentative AFEX CSH-tolerante Kolonie (analog zu Colony 5 in Beispiel 1) durch die Schleife von einer 48 Stunden YM Platte bis 75 ml des ethanolfreiem ODM (100 g / l Xylose, in diesem Fall) in 125 ml-Kolben. Inkubieren bei 25 ° C, 150 rpm (1 "Umlaufbahn) für 24 h. Wählen Sie die Vorkultur ODM Xylose-Konzentration, die der anfänglichen kontinuierlichen Kultur Haltevolumen anzupassen.
  3. Beimpfen einer kontinuierlichen Kultur Haltevolumen von ODM bei pH 6,3 ± 0,2 mit 100 g / L Xylose + 20 g / l Ethanol mit ~ 5-10 ml einer Vorkultur Konzentrat eines AFEX CSH-tolerant Isolat (analog Colony 5, 1 ) 100 ml bei der ersten A 620 ~ 0,5 zu erhalten. Pflegen Sie die Kultur Haltevolumen (V R), bei 25 ° C in einem ummantelten 100 ml Rührkolben bei 200 Umdrehungen pro Minute und ausgestattet mit sterilisierbar pH - Elektrode, pH - Regler und temperaturgesteuerte zirkulierendes Wasserbad gerührt.
  4. Zunächst wird, da das Zellwachstum aufgrund der Ethanolexposition langsam sein, setzen Sie das Fördermedium bis zu dosieren einen pH-betätigten Pumpe. Stellen Sie die Pumpe pH-6,3 ODM mit 100 g / l Xylose und 50 g / L Ethanol, wenn die Kulturfermentation sinkt der pH-Wert auf 5,4, damit das Anhalten weiterer pH-Abfall zuzuführen. Pflegen Sie das Volumen auf 100 ml mit einer Abwasserpumpe die Kulturoberfläche kontinuierlich Skimming. Folglich steigt Ethanolkonzentration mit fort Metabolismus und Fütterung.
  5. Messen Sie Abwasser und ziehen Proben (1-2 ml) aus kontinuierlichen Kulturen alle 48-72 Stunden für die Analyse der Lebendzellkonzentration, Produkte und Substrate, wie zuvor beschrieben. 18 , um Lebendzellkonzentration, machen serienmässigen 1:10 Verdünnungen von Proben finden in Puffer (siehe 4.1.1) und Ausstrichverfahren die Verdünnungen auf YM-Agar (1.2.1 sehen). Basierend auf Abwassersammelraten (Q), die Berechnung der Verdünnungsrate (D) (Q / V R), und in dem Beispiel von S. stipitis, es variiert von 0 bis 0,01 h -1.
  6. Sparen Glycerinstamm regelmäßig durch von Lebensfähigkeit Platten gepufferte Probenverdünnungen Isolierung 30-100 Kolonien bilden, was am weitesten verbreitete robuste Kolonisten damals mit der Anreicherung. Flood-Platten mit ca. 5 ml 10% Glycerol Herstellung von doppelten Kryoröhrchen zu ermöglichen. Für die Wartung oder eine Ruhepause, die kontinuierliche Kultur zu stoppen und neu zu starten, da die meisten aktuellen (resistent) Glycerolstammlösung (en) benötigt werden.
  7. Zum Neustart Streifen die Glycerolstammlösung (n) von den meistenresistente Populationen auf YM-Agar und übertragen 24-48 hr Zellen durch Schleife zu einer Vorkultur wie oben für die Inkubation ethanolfreiem ODM. Mit einem Konzentrat der vorkultiviertem Hefe beimpft und die 100 - ml - Volumen von ODM Holding A 620 0,5 Erstausbildung und lassen Sie die Kultur chargenweise bis zur stationären Phase zu wachsen , bevor das Fördermedium Fluss neu gestartet wird.
  8. Wenn die Kulturen bei stetig wachsen> 0,01 h -1 auf Xylose in Gegenwart von> 25 g / l Ethanol, starten Sie die kontinuierliche Kultur - Feed (ODM + 60 g / l Xylose + Ethanol im Bereich von 30 bis 50 g / l) bei einer niedrigen Verdünnungsrate ~ 0,01 h -1 bis die 100 ml Haltevolumen (anfänglich ODM + 60 g / l Xylose + 20 g / l Ethanol). Im Laufe der Zeit erhöhen das Ethanol in der Beschickung zu 50 g / L. Nehmen Sie erweiterte Populationen in Glycerin Aktien.
    HINWEIS: die niedrige Verdünnungsrate Aufrechterhaltung Bildung einer ausreichend hohen Zellkonzentration ermöglicht die Sauerstoffverfügbarkeit und Unterstützung Gärung zu reduzieren.
  9. Wahlweise gelten ultraviolettem (UV) irradiatIon monatliche Dauerkulturen reinoculate verwendet Lager Populationen zu Glycerin.
    1. Resuspendieren Kolonien von Glycerolstammlösung Streifen in 10 ml ODM (wie in Vorkulturen) mit 60 g / l Xylose und bündeln alle Bestände in einem einzigen sterilen Kolben. Tragen Sie die gepoolten Zellsuspension bei ~ 5 x 10 8 lebensfähige Zellen / ml nur die Böden von 4-5 Petrischalen mit 6 ml / Platte abzudecken. Zur Erzielung 6 ml Abdeckung einer Standard-Einweg-Petrischale, verzichtet werden 15 ml Oberflächenspannung zu überwinden, und entfernen Sie dann 9 ml.
    2. Expose jede offene Kulturplatte von der Lichtquelle in einem biologischen Sicherheitsschrank mit UV. Stellen Sie die UV-Belichtungszeit oder Entfernung die gewünschte Tötungsrate von> 90% zu erhalten. Hier aussetzen für 45 Minuten bei etwa 56 cm von der Quelle.
    3. Verdünnter Plattenzellsuspensionen vor und nach Bestrahlung. Estimate Tötungsrate auf koloniebildenden Einheiten basieren. Für die S. stipitis Beispiel war die Mortalitätsrate ~ 97%.
    4. Übertragung der UV-exponierten Kulturen (24-30 ml) bis zu einer folien covbei 25 ° C und 150 rpm auf ca. 1 x 10 8 lebensfähigen S. Ered 50 ml - Kolben und Inkubieren für 24 h die kleiner Prozentsatz der lebensfähigen Zellen zu ermöglichen , wieder zu bevölkern stipitis / ml Zellen. Durch die Verhinderung Foto Reaktivierungen, die Folienabdeckung bewahrt Mutationen während Kulturen inkubiert werden.
    5. Verwenden Sie die repopulated mutagenisierten Kultur kontinuierliche Kulturen ~ 1 x 10 7 lebensfähige Zellen / ml zu impfen. Starten Sie den Ethanol angereicherte ODM + 60 g / l Xylose Mittelzuführung, den Auswahlprozess fortzusetzen.

6. Werten Glycerolstammlösung Populations und identifizieren Diejenigen mit verbesserter Xylose Fermentation in Gegenwart von Ethanol

  1. Streak ausgewählt Glycerinstammkulturen auf YM-Agar als ersten Schritt in dem Bildschirm für die beste Wachstum und die Fermentation von Xylose in Gegenwart von Ethanol.
  2. Bringen Sie jede entwickelte Bevölkerung werden von Agar-Streifen zu 75 ml Vorkulturen in ODM mit 150 g / l Glukose gesiebt und brüten 96 in 125 ml-Flaschenh vor der Verwendung als Inokula für Testkulturen. Die großen Glucose gewachsenen Populationen Induktion von Enzymen für Xyloseverwertung erfordern.
    1. Um Induktion zu testen, jede Kultur ernten, zu suspendieren Zellen zu 30 ml, Initiale A 620 von 40 in ODM 60 g / l Xylose + 30-45 g / l Ethanol und Inkubation bei 25 ° C, 150 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) in 50 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse. zeichnen Proben zweimal täglich zur Überwachung von Xylose-Aufnahme durch HPLC-Analyse.
  3. Alternativ kann , wie in Slininger et al., 18 Wachstum auf Xylose in Gegenwart von Ethanol zu bewerten, die durch das Schleifen Transfer auf 75 ml ODM mit 150 g / L Xylose in 125 ml - Kolben Vorkulturen jeder entwickelten Population herzustellen, und Inkubieren 96 h bei 25 ° C, 150 rpm (1 "Umlaufbahn). Testkulturen auf einen niedrigen Anfangs A 620 von 0,1 in 25 ml ODM + 60 g / L Xylose + 30-45 g / L Ethanol in 125 ml - Kolben beimpft. Inkubiere Kolben bei 25 ° C, 300 Upm, 1 "Umlaufbahn und Probe.

7. Isolieren Einzel-Zell-Kolonien, die Xylose in PSGHL nutzen, wenn Ethanol vorhanden ist

  1. Basierend auf den Ergebnissen von Schritt 6, wählen Populationen Glycerolstammlösung zeigt überlegene Fähigkeit Xylose in Gegenwart von Ethanol zu wachsen und fermentieren. Verwenden Sie diese Streifen Platten. Die Streifen Platten verwendet werden , um dichte, gepufferte Zellsuspensionen von A 620 = 5. Dann Zellsuspensionen verwendet werden , bereiten Vorkulturen in 96-Well - Platten tief zu A 620 = 0,5 bis impfen. Impfen 1 ml Vorkulturen auf PSGHL 1: 1 gemischt mit ODM + 50 g / l Xylose (kein Ethanol). Inkubieren Vorkulturen in 96-well, Deep Well Platten mit belüfteter niedrige Verdampfungsabdeckungen für 48 Stunden bei 25 ° C, 400 Umdrehungen pro Minute, 1 "Orbit. Separate verschiedenen Glycerolstammlösung Populationen durch leere Brunnen.
  2. Unter Verwendung jedes Vorkultur impfen sechzehn 1 - ml - Kulturen replizieren A bis initial 620 ~ 0,5 in 1: 1 PSGHL: ODM + 50 g / l Xylose mit 20, 30 oder 40 g / l Ethanol zu tolerant Kolonisten bereichern. Inkubieren Bereicherung cultures ähnlich Vorkulturen.
  3. Für jede unterschiedliche Glycerolstammlösung, ernten die Kulturvertiefungen mit höchsten Ethanolkonzentration, um ein Wachstum und Xylose Verwendung. Platte jede Zelllinie zu YM Agar zu weit verbreitet einzelne Kolonien erhalten in Glycerin zu erhalten. Wählen Sie zehn Kolonien pro Zelllinie und Streifen jeweils auf einer YM-Agar-Platte für Glycerin Stoffaufbereitung.

Bereichern 8. Weitere Robust Evolved Dehnungen während der seriellen Übertragung auf PSGHL, wie für AFEX CSH

  1. Bereiten Vorkulturen von NRRL Y-7124 (parent), AFEX CSH-tolerant entwickelt isolieren und kontinuierlicher Kultur entwickelt Population mit verbesserten Fähigkeit Xylose in Gegenwart von Ethanol zu verwenden. Impfen 75 ml ODM + 150 g / L Xylose durch Schleife aus Streifen Glycerolstammlösung wie oben (Schritt 2.1) für die AFEX CSH-Hydrolysat Anpassungsprozess beschrieben.
  2. Verdünnte PSGHL mit Wasser eine Reihe von ansteigenden Konzentrationen bereitzustellen. Bereiten Sie eine 96-Well-Mikroplatte für jeden der drei Zelllinien von jedem unter VerwendungPSGHL Verdünnung 8 Vertiefungen mit 50 & mgr; l zu füllen. Verwenden Sie Vorkultur je 50 & mgr; l Mikrokultur der Verdünnungsreihe zu impfen A 620 ~ 0,1-0,5 zu paraphieren.
    1. Weiterhin die Entwicklung der Hefe in Stärken PSGHL Erhöhung des gleichen Verfahrens wie das AFEX CSH Hydrolysat Anpassung unter Verwendung der oben detailliert (Schritt 2) bis zu Kulturen der Lage sind , in der vollen Stärke - Hydrolysat zu wachsen auf einem stabilen 14-d durchschnittliche Verhältnis von & Dgr; A 620 pro Δtime als serielle Übertragungen werden weitere vier Monate fortgesetzt.

9. Isolieren Einzelzellkolonien Mit PSGHL Gradients mit oder ohne Ethanol Herausforderung

  1. Erhalten Einzelzelle direkt aus voller Kraft PSGHL endgültige Anpassung Platten durch Verdünnungsausstrichtechnik auf YM-Agar isoliert. Wählen Sie zehn große Kolonien für jede der drei Zelllinien und Bar Streifen zu YM-Platten Glycerinstamm herzustellen, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.2).
  2. Optional früheren Zeitpunkten in der erkundenEvolutionsprozess von aus gespeicherten Glycerin Bestände der drei Zelllinien zu isolieren.
    1. Impfen eine Vorkultur für jede Zelllinie durch die Schleife von Glycerolstammlösung Streifen und Inkubation 24 Stunden auf 30 ml ODM + 50 g / l Xylose (50 ml Fläschchen, 25 ° C, 150 Umdrehungen pro Minute).
    2. Challenge - Zellen von Vorkulturen auf Wachstum in Hydrolysat von 50 ul 50% PSGHL in Mikrotitervertiefungen Inokulation auf einen Anfangs A 620 ~ 0,2 und statisch 48 Stunden inkubiert.
    3. Verteilt 0,1 ml jeder angereicherten Kultur auf PSGHL Gradienten-Agar-Platten im Bereich von 0 bis 50% ige Hydrolysat (Abgabe ~ 300-400 lebende Zellen pro Platte), und wählen Sie 10 einzelne Kolonien pro Zelllinie aus dem höchstmöglichen Hydrolysat Konzentrationsbereich des Gradienten 21. Streak nahm Kolonien auf YM für Glycerin Stoffaufbereitung , wie in Schritt 3.2.
    4. Als Alternative 9.2.3 zu Schritt, anstatt die Gradienten - Agar - Platten von Impfen, impfen Wells von 96-Well - Mikroplatten A 620 ~ 0,2 bis paraphieren, where die Vertiefungen werden entworfen, um eine Reihe von Hydrolysat Konzentrationen von 50 bis 100% ige und Ethanol 10-40 g / L enthält. In diesem Fall werden Mikroplatten 72-96 hr entwickeln und ansonsten wie in Schritt 2.3. Isolieren zehn einzelne Kolonien aus Brunnen der härtesten Hydrolysat-Ethanol-Kombinationen zeigt das Wachstum über Verdünnungsausstrichtechnik und bereiten Glycerin Bestände wie in Schritt 3.2.

10. In einem primären Screen, beseitigen Inferior Isolaten von Performances auf PSGHL an zwei Nährstoffbedingungen Vergleich und Bewertung

  1. Tragen Sie einen hohen Durchsatz Deep - Well - Platte Bildschirm PSGHL Leistung Bildschirm fünf Sätze von dreißig Isolate zusammen mit NRRL Y-7124 Eltern und AFEX CSH-tolerante Isolat (analog zu Colony 5 der Abbildung 1 Evolution Beispiel) als Kontrollen sechs Top - Stämme zu wählen (20%) von jedem Satz an den sekundären Screening-Ebene passieren (Schritt 12).
  2. Führen Sie den Bildschirm in Deep Well Platten gefüllt 1 ml pro Vertiefung und bedeckt with Edelstahldeckel mit schwarzem Silikon niedrigen Verdampfungs Dichtungen. Klemmen Sie alle Platten in den Vorstand des Inkubators / Schüttler und den Betrieb bei 25 ° C und 400 Umdrehungen pro Minute (1 "Schüttler Orbit). Entwurf alle tief Well-Platte und Füllmustern Trennung von verschiedenen Isolaten von offenen Brunnen zu ermöglichen.
  3. Beginnen Kultivierungen, einen Wulst von Zellen aus Glycerin Streifen aufzunehmen, hergestellt aus 30 Isolaten erhalten wie oben beschrieben (in den Schritten 3, 7 und 9) zu duplizieren Vertiefungen ODM + 50 g / l Xylose und 48 Stunden inkubieren.
  4. Als Herausforderung Medium Isolate für Vorkultur, bereiten 50% PSGHL durch PSGHL 1 Mischen: 1 mit ODM + 10 g / l Glukose + 50 g / l Xylose. Bei Screening-30-Isolate und zwei Kontrollstämme, 2 Platten mit 2 Vertiefungen pro jeweils 16 Isolate gefüllt sind, leere Brunnen zwischen den verschiedenen Isolaten zu verlassen.
  5. Für Herausforderung Kulturen, zu übertragen, ein 50 & mgr; l Volumen von ODM Vorkulturen (A 620 ~ 10) zu jedem der zwei 50% PSGHL Herausforderung Kulturvertiefungen für jedes der Isolate und steuert einen initi zu erhaltenal A 620 ~ 0,5 und 72 Stunden inkubiert.
  6. Verwenden Sie zwei Testmedien unterschiedlicher Ernährungs Reichtum für das Screening-Isolaten: 60% PSGHL + ODM Nährstoffe; und 75% PSGHL + ODM + YM Nährstoffe. ODM Nährstoffe (ohne Zucker) bei der Hälfte der Stärke als Standard für die ODM mit 50 g verwenden / L Zucker (Schritt 1.3). YM Nährstoffe (ohne Zucker) bei der Hälfte der Standardstärke von 3 g / l Hefeextrakt, 3 g / l Malzextrakt, 5 g / l Pepton Wie bezeichnet, hinzuzufügen.
  7. Impfen Testkulturen um 50 & mgr; l von 72 Stunden 50% PSGHL Herausforderung Vorkulturen Übertragung von 1.000 & mgr; l zu impfen A 620 ~ 0.5 in fünf Tiefbrunnen für jeden von zwei Testmedien zu paraphieren.
  8. Probieren Sie jeder täglich zu isolieren. Pipettieren den Inhalt eines gut auf einem Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere (5533 xg, 15 min) zu erhalten Überstand für Ethanol, Glucose und Xylose-Hochdurchsatzanalysen. Messung der Biomasse als 620 in 96-Well - Mikroplatten (200 ul / Vertiefung) mit einem Spektralphotometer.
  9. Innerhalb jeder Satz von 30olates getestet (5 Sätze für S. stipitis NRRL Y-7124 - Stämme entwickelt), die relative Performance - Indizes berechnen (RPI) als 11 unten in Schritt beschrieben und verwenden , um jeden Stamm Rang basierend auf Ethanolausbeute (maximal Ethanol pro anfänglichen Zucker akkumulierten geliefert) und Xylose-Aufnahmerate (Xylosekonzentration pro anfänglichen 96 Stunden verbraucht) an beiden Testmedien.

11. Rang Trennt im primären PSGHL Bildschirm mit Relative Performance Index (RPI)

  1. Im Anschluss an das primäre Screening berechnen dimensionslose relative Performance Indizes (RPI), um die 30 - Isolate in jedem der fünf verschiedenen Experimenten auf Rang zu Bildschirm auf PSGHL Isolate mit zwei unterschiedlichen Nährstoffformulierungen pro Experiment, das heißt, 60% und 75% PSGHL PSGHL.
  2. Berechnen Sie die statistischen Parameter F für den Einsatz in Ranking - Isolat Leistung innerhalb einer Gruppe von Isolaten in einem bestimmten Experiment getestet: F = (XX avg) / s. Hier X ist die Leistungsparameter, wie zum Beispiel Ausbeute (Y)oder die Rate (R), für jedes einzelne Isolat beobachtet, während X avg und s der Mittelwert und die Standardabweichung sind jeweils von X beobachtet für alle in einem gegebenen Experiment isoliert. Für Normalverteilungen, -2
  3. Für jede in einem Experiment zu isolieren, auf Preis kann jetzt höher die relative Performance berechnen, RPI R = (2 + F R) × 100/4, und in ähnlicher Weise die relative Performance auf Ertrag, RPI Y = (2 + F Y) × 100/4 Basis berechnen . Der Wert des RPI liegt im Bereich von ~ 0 bis 100 Perzentil (steigend). Berechnen Dann RPI Mittelwerte für jede in einem gegebenen Hydrolysat Experiment isolieren wie folgt: RPI avg = (RPI Y + RPI R) / 2, wobei Ausbeute und Rate Beiträge gleicher Gewichtung in dieser Anmeldung angegeben sind.
    Beachten Sie, dass im Allgemeinen, die Ausbeute und Rate-Parameter können gewichtet werden, wenn ungleiche Bedeutung angesehen.
  4. Berechnen Sie RPI insgesamt über die n Arten von Hydrolysaten getestet: RPI Gesamt = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n. Betrachten Sie jedes Isolat in einer experimentellen Gruppe von 30 Isolaten und 2 Kontrollen. Während primären Ranking der ~ 150 Einzelkolonie - Isolate angepasst zu Xylose-reiche PSGHL, die RPI insgesamt für Preise und Renditen in den beiden PSGHL Formulierungen in das Sieb aufgebracht berechnet wird, dh 60% PSGHL und 75% PSGHL, wobei n = 2.
  5. Basierend auf RPI insgesamt in jedem Experiment, wählen Sie den oberen Anteil der Isolate auf dem sekundären Bildschirm zu übergeben. In diesem Beispiel werden die oberen 20% der Stämme ausgewählt , um durch (dh 30 von 150 getestet).

12. In einem zweiten Bildschirm, Vergleichen Sie Top primären Screen Darsteller auf mehrere komplette Hydrolysate (> 100 g / l Misch Sugars) Höchste Funktionierende Robust Stämme zu Reveal

  1. Vergleichen Sie Top PSGHL Darstellern auf 6% Glucan AFEX CSH und SGH geändert mit zwei Ebenen von Stickstoff, SGH-N1 und SGH-N2 (Zusammensetzungs , wie in Tabelle 1) für die endgültige Platzierung. Bildschirm , um die 30 - Isolate , die die Top - Performer in der primären Deepwellplatte Bildschirm von PSGHL waren (Schritte 10 und 11) und die beiden Kontrollen (Elternstamm NRRL Y-7124 und AFEX CSH-tolerante Isolat (analog zu Colony 5, Abbildung 1 Beispiel ).
  2. Beginnen Kultivierungen durch einen Wulst von Zellen aus Glycerin Streifen picking Tiefbrunnen von 1 ml ODM + 50 g / L Xylose zu duplizieren, wie zuvor und inkubiere 48 Stunden in dem tiefen Well-Platte-System (Schritt 10.2). Dann Transfer 50 ul ODM Vorkulturen auf 50% SGH Herausforderung Kulturen, und Inkubation für 72 Stunden in der tiefen Well - Platte - System A 620 bei ~ 10) zu erhalten. Bereiten Sie die 50% SGH durch SGH 1 Mischen: 1 mit sugarless ODM + 50 g / l Xylose (pH 5,6).
  3. Für jedes der Isolate, ein 16 ml Aliquot von SGH-N1 oder SGH-N2 mit dem Zellpellet (15 min, 2.711 x g) von drei Vertiefungen Belastungskultur inokulieren anfänglichen Testkultur A 620 ~ 2,0 zu ergeben. Inkubieren Testkulturen bei 25 & #176;. C, 180 Umdrehungen pro Minute (1 "Orbit) in 25 ml Flaschen mit Silikonschwamm Verschlüsse Probenflaschen täglich und zu analysieren, pro der PSGHL Bildschirm.
  4. Ebenso Bildschirm isoliert wie in den Schritten 12.2 und 12.3, aber diesmal Ersatz SGH-N1 und SGH-N2 mit 6% Glucan AFEX CSH bei pH 5,2 für den Einsatz in der Herausforderung, Kulturmedium und Testkulturmedium vorbereitet. Für die 50% Kulturen Stärke Herausforderung, verwenden Sie 6% AFEX CSH 1: 1 verdünnt mit Wasser, da sie Stickstoff ausreichend ohne Änderung ist.
  5. Wiederholen Sie die Schritte 12,1-12,4 Ergebnisse zu duplizieren.

13. Rang die Performances von Isolaten in dem zweiten Bildschirm Mit RPI insgesamt zu bewerten Verwendung mehrerer komplette Hydrolysate

  1. Berechnen Sie die relative Performance Indizes (RPI), um jede der oberen 20% der Isolate auf Rang (~ 30 von 150) aus dem primären Bildschirm, der in dem zweiten Bildschirm auf Enzym getestet wurden verzuckerte Hydrolysat Formulierungen von Nahrungsreichtum variieren.
  2. Ergebnis jeIsolat, welches in dem zweiten Bildschirm auf Basis von Xylose-Aufnahmerate und die Ethanolausbeute durchgeführt auf drei Enzym-verzuckert vorbehandelte Hydrolysat Formulierungen laufen in zweifacher Ausfertigung, einschließlich AFEX CSH (i = 1 und 2), SGH-N1 (i = 3 und 4) und SGH getestet -N2 (i = 5 und 6).
  3. Berechnen Sie insgesamt die RPI für jedes Isolat, und wenden Sie diese Ranking - Parameter , um die Liste der überlegenen Isolate winnow: RPI Gesamt = Σ i = 1, n [(RPI Y + RPI R) / 2] i / n, wobei n = 6 .
    HINWEIS: Demonstrieren Kinetik von höchster Isolate in SGH-N2 Hydrolysate in Kolbenkulturen durch Befolgen der Verfahren in Slininger et al 18.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

S. stipitis wurde mit Kombinationen von drei Auswahlkulturen entwickelt, die AFEX CSH enthalten, PSGHL und Ethanol-herausgefordert Xylose-fed kontinuierlichen Kultur. Figur 1 zeigt die schematische Darstellung der zusammen mit den Isolaten durchgeführt Evolutionsexperimenten gefunden entweder am effektivsten durchzuführen insgesamt oder am effektivsten auf einen der getesteten Hydrolysate. Tabelle 3 zeigt die NRRL - Zugangsnummern dieser superior Isolate und fasst die Anpassung...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Wurden mehrere Schritte für den Erfolg des Evolutionsprozesses entscheidend. Erstens ist es Schlüssel geeigneten Selektionsdruck zu wählen, die Bevölkerung Entwicklung hin zu der gewünschten Phänotypen zu fahren, die für die erfolgreiche Anwendung benötigt werden. Die folgenden punktuelle Belastungen wurden für S. gewählt stipitis Entwicklung und zu geeigneten Zeiten angewendet Bereicherung für die gewünschten Phänotypen zu führen: Erhöhung der Stärken von 12% Glucan AFEX CSH (das Wachstum und die Ferm...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten Dr. Kenneth Vogel, Dr. Robert Mitchell und Dr. Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE, unseren aufrichtigen Dank für ihre freundliche Lieferung von Rutenhirse für dieses Projekt aussprechen. Wir danken auch dem US-Energieministerium für die Finanzierung von VB durch den DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Cellic Ctec, Enthält Xylanase (Endo-1,4-)NovozymeKeine Artikelnummerwww.novozymes.com, 1-919-494-3000
Cellic Htec, Enthält Cellulase und XyalanaseNovozymeKeine Artikelnummerwww.novozymes.com, 1-919-494-3000
Geröstetes Nutrisoy-MehlArcher Daniels Midland Co. (ADM)63160ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 (Tenside)Sigma-AldrichP1300Sigma-Aldrich
Difco Vitamin Assay CasaminosäurenBecton Dickinson and Company228830mehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, VWR, Daigger
D,L-tryptophan Sigma-AldrichT3300mehrere Lieferanten: z.B. , Fisher Scientific, VWR, Daigger
L-cystein Sigma-AldrichC7352mehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, Sigma-Aldrich
Bacto AgarBecton Dickinson and Company214010mehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto Malt ExtractBecton Dickinson and Company218630mehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Bacto HefeextraktBecton Dickinson and Company212750mehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Pepton Typ IV aus SojabohneFlukaP0521-500gmehrere Lieferanten: z.B., Fisher Scientific, VWR, Daigger
Adenine, >99% PulverSigma-AldrichA8626CAS 73-24-5. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Cytosine, >99%Sigma-AldrichC3506CAS 71-30-7. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Guanine, SigmaUltraSigma-AldrichG6779CAS 73-40-5. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Thymine, 99%Sigma-AldrichT0376CAS 65-71-4. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Uracil, 99%Sigma-AldrichU0750CAS 66-22-8. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC
Dextrose (D-Glucose), wasserfrei, zertifiziert ACSFisher ChemicalD16-500CAS 50-99-7. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
D-Xylose, Assay >99%Sigma-AldrichX1500CAS 58-86-6. Könnte auch andere Marken gebrauchen. Mehrere Lieferanten: z.B. , Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich
96-Well, FlachbodenplattenBecton Dickinson Falcon351172mehrere Lieferanten: z.B. , Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Wypall L40 WiperKimberly-ClarkHandtuch in Mikroplattenboxen zur Aufnahme von Wasser zur Befeuchtung; mehrere Lieferanten z.B. , Thermo-Fisher, Uline, Daigger
Corning graduierter Pyrexkolben, 125 ml, schmale Öffnung (Stopfen #5)Corning Life Science Glas4980-125Diverse Anbieter: z.B., Thermo-Fisher, VWR, Daigger
Innova 42R Shaker/Inkubator, 2,5 cm (1") RotationNew Brunswick Scientific (1-800-631-5417)M1335-0016mehrere Anbieter: z.B. , Eppendorf, Thermo-Fisher. Es könnten auch andere Schüttler/Inkubatoren mit einer Wurfweite von 2,5 cm (1") verwendet werden.
Duetz Abdeckklemme für 4 Deep-Well-MTP-PlattenApplikon BiotechnologyZ365001700applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System Sandwich-Abdeckung für 96 Deep-Well-PlattenApplikon BiotechnologyZ365001296applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396
Duetz System Silikondichtung (0,8 mm schwarz low evap) für 96 Deep-Well-PlattenabdeckungApplikon BiotechnologyV0W1040027applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
Blaue Mikrofaserschicht für Duetz System SandwichabdeckungApplikon BiotechnologyV0W1040001applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
96 Well, 2 ml quadratische Well-Pyramidenbodenplatten, natürliches PopypropylenApplikon BiotechnologyZC3DXP0240applikon-biotechnology.com (USA), 1-650-578-1396
Bellco 32 mm Silikon-Schwammstopfenverschlüsse, Packung mit 25 Stück für 125 ml KolbenBellco1924-00032Thomas Scientific, ihre Katalognummer ist 1203K27
Bellco Spinnerkolben, 1968-Glaskuppel, verschließbarer Flanschtyp, 100 ml Arbeitsvolumen. Diese Konstruktion wird nicht mehr hergestellt.Bellco1968-00100 (original Kat. Nr.)Ummantelte Behälter haben untere Einlass- und obere Auslassöffnungen für die Temperaturregelung mit zirkulierendem Wasserbad. Die Gefäße haben einen Außendurchmesser von 75 mm und eine Höhe von 200 mm. Es gibt vier seitliche Ports bei ~45° Winkel und ein oberer Anschluss. Portöffnungen in geeigneter Größe für Neoprenstopper der Größe 0 (21-22 mm Innendurchmesser an den Ports).
Mathis Labomat IR Trockner OfenMathisAgTyp-Nbr BFA12 215307Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 Zweikanal-Biochemie-Analysator
YSI Life Sciences2900D-UPwww.ysi.com, Robotersystem für schnelle Zuckerassays im 96-Well-Mikroplattenformat
PowerWave XS Mikroplatten-SpektralphotometerBio-Tek Instruments, IncMQX200Rwww.biotek.com
,

Referenzen

  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
  3. Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
  4. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
  5. Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
  6. Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
  7. Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
  8. Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
  9. Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
  10. Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
  11. Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, Humana Press, a part of Springer Science+Business Media, LLC. 61-77 (2009).
  12. Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
  13. Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
  14. Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
  15. Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
  16. Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
  17. Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
  18. Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
  19. Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
  20. Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader's Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
  21. Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
  22. Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
  23. Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
  24. Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
  25. Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
  26. Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
  27. Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
  28. Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Adaptive EvolutionVerbesserung von HefestämmenXylose-FermentationHydrolysat-ToleranzEthanolproduktionHerstellung von Glycerin-StocksVerdünnungsplattierungRelativer Performance-Indexkontinuierliche KulturselektionScheffersomyces stipitis
Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.