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Methodenartikel

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

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DOI:

10.3791/54241

⸱

17. Juli 2016

 , 
1Center for Zebrafish Research, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Center for Stem Cells and Regenerative Medicine, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Renal Verletzungen von Nephrotoxinen entstehen, die Medikamente im Bereich von Antibiotika zu Chemotherapeutika gehören, können in komplexen Erkrankungen, deren Pathogenese zur Folge bleibt unvollständig verstanden. Dieses Protokoll zeigt, wie Zebrabärbling für Krankheitsmodelle dieser Bedingungen verwendet werden, die zur Identifizierung von renoprotektive Maßnahmen angewendet werden können.

Zusammenfassung

Die Nieren sind anfällig von der Exposition zu schädigen zu Chemikalien, die sie aus dem Blut zu filtern. Dies kann mit einem raschen Rückgang der Nierenfunktion und die Entwicklung des klinischen Syndrom bekannt als akute Nierenschädigung (AKI) in Verbindung zu Organschäden führen. Pharmakologischer Mittel verwendet, um medizinische Bedingungen zur Behandlung von bakteriellen Infektionen zu Krebs reichen, wenn sie einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Wirkstoffen, kann AKI initiieren. Zebrabärbling sind ein nützliches Tiermodell die chemischen Wirkungen auf die Nierenfunktion in vivo zu untersuchen, da sie eine embryonale Niere Nephron Funktionseinheiten besteht bilden , die mit höheren Vertebraten konserviert sind, einschließlich Menschen. Ferner kann Zebrabärbling genetische und chemische Bildschirme auszuführen verwendet werden, die Möglichkeiten bieten, um die zellulären und molekularen Facetten AKI aufzuklären und therapeutischen Strategien wie die Identifizierung von Molekülen nephroprotektive entwickeln. Hier zeigen wir, wie die Mikroinjektion in dieZebrafischembryo kann als Paradigma für Nephrotoxin Studien genutzt werden.

Einleitung

AKI ist ein abrupter Verlust der Nierenfunktion , die 1 bis verheerenden gesundheitlichen Folgen führen kann. AKI ist ein bedeutendes Gesundheits Problem weltweit aufgrund seiner hohen Inzidenz von etwa 20% bei Patienten im Krankenhaus, mit noch höheren Raten von 30-50% in kritischen Pflegefälle und ältere Menschen, und die Sterblichkeitsrate von 50-70% 1-3. Leider hat sich die Prävalenz von AKI zugenommen und wird voraussichtlich weiter über die nächsten zehn Jahre zu eskalieren, zum Teil aufgrund der Vielfalt der Faktoren, die AKI auslösen können, zu denen die postoperative Belastung, Ischämie und Exposition gegenüber Nephrotoxinen wie Antibiotika und chemotherapeutischen Arzneimitteln 4.

AKI beinhaltet plötzliche Zellschäden in der Niere, die gemeinhin in Nephronen auftretenden, die die wesentlichen Funktionseinheiten sind, und aus einem Blutfilter und einer segmentierten tubule umfasst , die Urin in den zentralen Sammelrohre 1 entwässert. Wenn eine erhebliche Anzahl von Nephronen sindwährend AKI beschädigt, sind die unmittelbaren Auswirkungen einer Unterbrechung in der Abfall Clearance aus dem Kreislauf und reduziert oder außer Kraft gesetzt Fluidstrom durch Nephronen durch Obstruktion von toten und sterbenden Zellen 1. Im Laufe der Zeit können Rohr Behinderung zu einer Degeneration des gesamten Nephronen führen, die 1 Nierenfunktion reduziert dauerhaft. Physiologische Veränderungen in der Niere folgenden AKI beinhalten auch komplexe entzündliche Ereignisse , die zu chronischen Vernarbung 1 führen kann.

Trotz dieser Ergebnisse haben Nephronen gewisse Fähigkeit Regeneration nach AKI zu unterziehen, die die Tubulusepithel 5,6 rekonstituiert. Zwar gibt es eine wachsende molekulare Verständnis von nephron Regeneration gewesen ist, bleiben die Mechanismen schwer in vielerlei Hinsicht und erforderlich machen Untersuchung 7 fortgesetzt. Das Ausmaß, in dem AKI führt zu einer dauerhaften Nierenschädigung bleibt ebenfalls unbekannt. Die aktuelle Forschung deutet darauf hin, das regenerative Potenzial für die Niere ist diehöchste folgenden weniger schwere Fälle von AKI, während ausgeprägter oder wiederholte Episoden zu einer chronischen Nierenerkrankung (CKD) führen und in Nierenerkrankung im Endstadium (ESRD) , die lebensrettende Transplantation oder Dialyse erfordert 8,9 gipfeln. Darüber hinaus Personen , die bereits von CKD leiden , sind zu einem noch höheren Risiko von 8,9 eine schwere Folge von AKI Vertrags. Zusammengenommen ist es klar, dass die weitere Grundlagen- und klinische Forschung zu verstehen, von entscheidender Bedeutung ist, zu behandeln und AKI verhindern.

Forschung mit Tiermodellen hat in Würdigung der Progression der lokalen und ökologischen Veränderungen beigetragen , die während der AKI 10 auftreten. Um dieses Verständnis zu erweitern sowie die Entwicklung neuer Therapien, die Zebrabärbling Tiermodell wurde in einer Vielzahl von Möglichkeiten 11,12 eingesetzt. Die Nephronen der Zebrabärbling Niere, sowohl im Embryo und Erwachsenen zeigen einen hohen Grad an Konservierung bei Säugetieren 13-16. Ferner nephron epithelialen Verletzungen in zeFisch - ähnelt dem Prozess bei höheren Wirbeltieren, wobei die lokale Zerstörung von röhrenförmigen Zellen durch intratubulären Proliferation und Wiederherstellung der nephron Architektur 17-19 folgt. Im Embryo ist jedoch umfangreiche Röhrchens Schaden von den Nephrotoxinen wie Cisplatin im Zusammenhang mit Letalität 20,21. Zum Vergleich: überleben Zebrabärbling Erwachsene AKI und zeigen materielle regenerative Fähigkeiten in der Niere. Zum Beispiel, um das Aminoglykosid - Antibiotikum Gentamicin nach der Exposition, Zebrabärbling Röhrchens Epithelschädigung regenerieren und neue Nephron - Einheiten sowie 22-24 wachsen. Während diese Gentamicin-induzierten AKI Studien wertvolle Informationen zur Verfügung gestellt haben, Nierenschäden aus verschiedenen Nephrotoxinen Verständnis bleibt entscheidend , um die Auswirkungen und die Reaktion auf verschiedene Arten von Schäden 25 zu schätzen.

Der Zebrafischembryo, aufgrund seiner Größe, Transparenz und genetische Lenkbarkeit, hat viele Vorteile für Nephrotoxin Studien 25, wobei das Verfahren der Mikroinjektion 20,21 verwendet, um das Molekül (e) für die Untersuchung zu verabreichen. Nephron werden von 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) und beginnen zu filtern Blut von etwa 48 HPF 26,27 gebildet. Somit erleichtert die schnelle Bildung und Funktion der embryonalen Nieren experimentellen Analyse. Allerdings hat der Prozess der Mikroinjektions technischen Herausforderungen, und es kann eine steile Lernkurve zu Beherrschung der Technik sein. In diesem Video-Artikel beschreiben wir, wie Mikroinjektionen durchführen und Tipps zur Fehlerbehebung, um die Rate der erfolgreichen Injektionen bieten zu verbessern.

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Protokoll

Die Verfahren für die Arbeit mit Genaktivität in diesem Protokoll beschrieben wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der University of Notre Dame genehmigt.

1. Herstellung der Lösungen

  1. Machen Sie eine 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium durch Mischen von 73,0 g NaCl, 3,15 g KCl, 9,15 g CaCl 2 und 9,95 g MgSO 4 in 5 l destilliertem Wasser, und lagern bei RT.
  2. Für die Kultivierung von Genaktivität verdünnen 50x Stammlösung von E3 Embryo Medium Lager auf eine 1x-Arbeitslösung mit destilliertem Wasser, dann 200 ul 0,05% Methylenblau zu je 1 Liter 1x E3 hinzufügen als Fungizid zu handeln, und an einem RT.
  3. Machen Sie eine Pigmentierung Blocking-Lösung von E3 Embryo Medium mit 0,003% 1-Phenyl-2-thioharnstoff (PTU) von 40 ml des 50x E3 Lager kombiniert mit 0,06 mg PTU. Dann bringen Sie die Lautstärke auf insgesamt 2 l mit destilliertem Wasser.
  4. Rühren Sie die E3 / PTU O / N bei RT die PTU Pulver in Lösung zu erhalten. Dann speichern Sie die E3 / PTU beiRT.
    Hinweis: Die E3 / PTU eine Lagerbeständigkeit von etwa einer Woche hat und ältere Lösungen werden weniger effektiv bei der Pigmentierung Entwicklung in Zebrabärbling Larven blockieren.
  5. Machen Sie eine Anästhesielösung von 0,2% Tricaine (MS-222) durch Zugabe von 1 g Tricaine zu 500 ml destilliertem Wasser und der pH-Wert auf 7,2 mit 1 M Tris, pH-Wert 9,5.
  6. Bereiten einer 2% igen Methylcelluloselösung für die Bildgebung zu machen , indem eine Lösung von 1x E3 (kein Methylenblau) platzieren, mit 1/10 Volumen von 0,2% Tricaine bei 4 ° C zugegeben.
    Hinweis: Die Methylcellulose-Lösung eine dicke, klare Lösung ist, die sanft verwendet wird, um Live-Embryonen für die Mikroskopie stabilisieren. Nach Manipulationen die Embryonen durchgeführt werden, können in 1x E3 gewaschen werden, um die Methyl aufzulösen, ohne das Tier zu verletzen und bei den nachfolgenden Stufen in der gleichen Probe ermöglicht Mikroskopie.
  7. Wenn auf 4 ° C abgekühlt, rühren Sie die 1x E3 / Tricaine Lösung kräftig auf einer Rührplatte und nach und nach die entsprechende Menge an Methyl hinzufügenCellulosepulver während sie weiterhin kräftig zu rühren. Nach und nach das Pulver zu der Lösung, um die Bildung von unlöslichen Methyl Aggregate zu verhindern.
  8. Nachdem das gesamte Pulver in die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung gemischt wird, rühren Sie die Verbundlösung im 4 ° C kalten Raum O / N.
    Hinweis: Die kalte Temperatur für voll am besten ist es, das Pulver zu lösen. Wenn die Lösung nicht klar nach einer Nacht ist, rühren Sie für einen zusätzlichen Arbeitstag und / oder einem zweiten O / N.
  9. Um Luftblasen aus der 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung Aliquot der Mischung in 1,5 ml Röhrchen und drehen mit hoher Geschwindigkeit (12,000 × g) bei 4 ° C für 30 min oder bis zu 2 Stunden zu entfernen.
  10. Legen Sie die 2% Methylcellulose / E3 / Tricaine Lösung bei 4 ° C für die Langzeitlagerung.
    Hinweis: Vor der Verwendung sollten Aliquots für die Arbeit mit den Zebrabärbling Proben auf RT vorgewärmt werden.

2. Herstellung von Werkzeugen

  1. Bereiten Sie ein Embryo Manipulatorwerkzeug, für po verwendetsitionsang Embryonen für die Mikroinjektion, durch eine Gel-Beladungsspitze am Ende einer 5 "gerade Seziernadel Befestigung und Sicherung mit Klebeband oder superglue.
  2. Bereiten Mikroinjektionsnadeln mit einer Nadel Abzieher, indem man zuerst ein Feuer platzieren poliert 10 cm Borosilikatglas mit Filament in das Gerät und sichern Sie das Borosilicatglas durch die Griffe festziehen.
  3. Ziehen Sie das Borosilicatglas fein verjüngte Nadeln zu gestalten. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Wärme 540, ziehen 245, Geschwindigkeit 200 und Zeit 125.
  4. Platz Nadeln in einer Petrischale, so dass sie auf einem Streifen aus Knetmasse Aussetzung der Nadelspitzen zu schützen, und halten Sie die Schale bedeckt Staubansammlung zu verhindern.
  5. Vorbereitung der Nadel für Mikroinjektionen zu beenden, mit einer Rasierklinge oder einer feinen Pinzette Kante verwenden die gezogener Ende der Nadel zu schneiden eine scharfe Winkelinjektionsspitze mit einem Durchmesser von etwa 0,05 bis 0,1 mm zu schaffen.
  6. Um die Mikroinjektions Tablett machen, bereiten Sie einen 1,5% igen / E3-Lösung in einem 100 ml Erlenmeyerkolben und die Agarose aufzulösen, indem der E3 zum Kochen in der Mikrowelle erhitzt dann erlauben bei RT für etwa 10 Minuten abkühlen lassen.
  7. Gießen Sie die gekühlte Agarose / E3-Lösung in eine Petrischale ein Fundament mit einer Tiefe von etwa 0,5 cm zu machen. Wenn diese erstarrt ist mit einer Tiefe von etwa 0,3 cm eine zweite Schicht gießen und das vorgefertigte Embryo gut Formeinsatz und lassen Sie die Agarose bei RT zu verfestigen.
    Hinweis: Beim Einsetzen der Form in die Top-Agar / E3-Schicht in einem Winkel um die Form in den Agar Anordnen der Anzahl von Luftblasen zu verringern.
  8. Wenn die gesamte Mikroinjektions Tablett gesetzt hat, heben auch die vorgefertigte Embryo langsam formen und vorsichtig mit einem Spatel verwenden, dann füllen die Schale mit E3-Lösung und lagern bei 4 ° C.

3. Embryo Vorbereitung

  1. Richten Sie Zebrabärbling Paarungs Tanks durch Trennwände in entsprechende Kammern und füllen mit System Wasser kommen.
  2. Setzen Sie einen Fisch auf jeder Seite des Teilers such, dass jede Gegenkammer enthält eine weibliche und eine männliche Fische und decken jede Paarung Kammer.
  3. Am nächsten Morgen, entfernen Sie die Teiler Laich zu ermöglichen.
  4. Überprüfen Sie den Fisch nach ca. 30 min, und nach der Erwachsenen in das Aquarium zurückkehrt, sammeln ihre Embryonen, die durch den Gegentankwasser durch ein feines Drahtgitter Sieb Werkzeug vorbei.
  5. Kehren Sie die Sieb über einer Petrischale und spülen mit E3 die Embryonen zu sammeln.
  6. Inkubieren Sie die Embryonen bei 28,5 ° CO / N.
  7. Wenn die Embryonen 24-26 Somitenstufe 26 erreicht haben, dekantiert die meisten der E3 Medien und dann dechorionate von 100 ul 50 mg Addier / ml Pronase zu jeder Schale von Embryonen und die Schale bei RT (23 ° C) Inkubieren für ungefähr 15 Minute
    Hinweis: Es dauert etwa 24-25 Stunden ab dem Zeitpunkt der Befruchtung für die Embryonen, die 24-26 Somiten Stadium zu erreichen, wenn sie gesammelt werden in der beschriebenen Art und Weise und inkubiert O / N bei 28,5 ° C.
  8. Füllen Sie die Schale mitE3 und schwenken dann sanft die Chorion aus den Embryonen zu entfernen.
  9. Dekantiert die E3 / Pronase und spülen Sie die Schale mit 25 ml frischem E3. Wiederholen Sie Spülschritt alle Pronase zu entfernen.
  10. So blockieren die Entwicklung der Pigmentierung, dekantiert die E3 und ersetzen mit 25 ml frischem E3 / PTU, wenn die Embryonen 24 Stunden nach der Befruchtung erreicht.
    Hinweis: Für Experimente mehrere Tage Spanning, sobald die E3 / PTU Lösung durch frische Medien ersetzt werden täglich die Schale sauber zu halten.

4. Mikroinjektion von Nephrotoxin Lösung

  1. Am Tag der Injektion, bereiten Sie die gewünschte Nephrotoxin Lösung zusammen mit der entsprechenden Fahrzeugsteuerung.
  2. Vortex oder vorsichtig mischen das Medikament (e), um sicherzustellen, ist / sind in der Lösung, die Seiten der Röhre und die Oberseite der Wassersäule zu überprüfen.
    Hinweis: Nephrotoxin Lösungen hergestellt werden können, um Spurenmengen von fluoreszenz konjugierten Dextran enthalten Mikroinjektionseffizienz zu überwachen und auch die renale Clearance bei SUBSEQ beurteilenießend Zeitpunkten 20,28.
  3. Legen Sie eine getrimmten Mikroinjektionsnadel mit ~ 2-3 ul der Nephrotoxin durch eine feine Gel-Beladungsspitze in die Rückseite des Einfädeln und suspendieren die Nadel vertikal mit einem Stück Klebeband die Lösung zu ermöglichen, um das zugeschnittene Nadelspitze durch die Schwerkraft zu füllen.
  4. Sobald die Nadelspitze voll ist, sichern die geladene Nadel in den Mikromanipulator.
  5. Testen des Mikroinjektionsvolumen um einen Tropfen Mineralöl auf eine Mikrometer-Objektträger platziert und Injizieren in das Öl um die Tröpfchengröße zu bewerten. Einem Injektionsvolumen von 500 pl hat einen Durchmesser von 0,1 mm.
  6. Entfernen Sie die Schale von Embryonen aus dem Inkubator und betäuben durch Zugabe von etwa 5 ml 0,2% Tricaine zum Embryo Gericht.
  7. Um eine vollständige Betäubung gewährleisten, sanft berühren Embryo mit der Spitze des Embryos Manipulatorwerkzeug. Der Mangel an Bewegung gibt ausreichend anesthetization.
  8. Nach dem erfolgreichen anesthetization, übertragen Embryonen in die Spritzgießform mit einem transfer Pipette.
  9. Manövrieren Sie jeden Embryo in eine andere Vertiefung der Form, um den Kopf in den tiefsten Bereich des Bohrlochs so platzieren, dass der Stamm entlang der Vertiefung ruht und der Schwanz ragt aus der Depression auf.
  10. Legen Sie die gefüllte Nadel in den Mikromanipulator und die Position der Nadelspitze neben einem Embryo.
  11. Führen Sie vorsichtig die Nadel in den Schwanz Schiff durch den Joystick nach vorne und drücken Sie den Fußschalter Bewegen des Mikroinjektions zu liefern.
    Hinweis: Eine erfolgreiche Injektion kann durch die Beobachtung der Flüssigkeitskreislauf gelangen gemessen werden. Ferner ermöglicht Koinjektion des nephrotoxicant mit fluoreszenz konjugiertes Dextran den Forscher erfolgreiche Injektion im Anschluss an das Verfahren zu überprüfen.
  12. Ziehen Sie vorsichtig auf dem Joystick zurück, um die Nadel aus dem Embryo zu entfernen.
  13. Nach der Injektion übertragen Sie die Embryonen in eine saubere Schüssel und spülen Sie die Tricaine und ersetzen mit frischen E3 / PTU zu entfernen.
  14. Inkubieren des Embryos auf den gewünschten Zeitpunkt zu Eselns Morphologie, die durch die Fotografie in Methylmontage Medien oder Verfahren zur experimentellen Analyse dokumentiert werden kann, wie gewünscht.
    Hinweis: Erholung von Embryonen beurteilt werden sollte der Anteil der Personen mit Ödemen, um zu bestimmen, die Nierenschädigung zeigt häufig.

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Ergebnisse

Ein Mikroinjektionsstation eingerichtet umfasst eine Stereo, Mikromanipulator und Druckregler (1A). Durchleuchtung der Einspritzplatte ist bevorzugt , Proben während dieses Verfahrens (1B) anzuzeigen. Herstellung der Injektionsnadel umfasst das Ziehen des entsprechenden Borsilikatglas, gefolgt von der Kante der Vorbereitung mit Schneiden und schließlich die Nadel Backloading. Optimalerweise wird die Nadelspitze abgeschrägt anstatt stumpf (1C),

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Diskussion

Eine vielfältige Anzahl von therapeutischen Wirkstoffen wurden mit AKI 29 verbunden. Es wurden von vielen einzelnen Verbindungen, wie das Aminoglycosid Gentamicin 30 und dem weit verbreiteten chemotherapeutischen Cisplatin induzierte Schäden beim Verständnis 31,32 signifikante Fortschritte in der Forschung gewesen. Einige pathologische Veränderungen dieser Bedingungen beteiligt sind, bleiben jedoch Gegenstand der laufenden Studie. Ein entstehender Herausforderung bleibt das Verständnis ,...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH Zuschusses DP2OD008470 unterstützt. Zusätzlich RAM wurde von Fonds, die von der University of Notre Dame Graduate School zur Verfügung gestellt teilweise unterstützt. Wir danken den Mitarbeiter der Abteilung für Biologische Wissenschaften, das Zentrum für Zebrabärblinge Forschung, und das Zentrum für Stammzellen und regenerative Medizin an der University of Notre Dame. Wir danken vor allem den Mitgliedern des Labor für Diskussionen über Nieren Biologie und ihre hilfreichen Feedback zu dieser Arbeit engagieren.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NatriumchloridAmerican BioanalyticalAB01915
KaliumchloridAmerican BioanalyticalAB01652
CalciumchloridAmerican BioanalyticalAB00366
N-Phenylthioharnstoff (PTU)Aldrich ChemistryP7629
Ethyl-3-aminobenzoat (Tricain)Fluka AnalyticalA5040
BorosilikatglasSutter Instruments Co.BF100-50-10
Flammender/Brauner MikropipettenabzieherSutter Instruments Co.Mo. P097
UltraPure AgaroseInvitrogen15510-027
MagnesiumsulfatSigma-AldrichM7506
MethylenblauSigma-AldrichM9140
Falcon Einweg-Petrischale, steril, Corning:
60 mm x 15 mmVWR25373-085
100 mm x 15 mmVWR25373-100
 ( Mikroinjektionstablett) 150 mm x 15 mmVWR25373-187
Niedertemperatur-InkubatorFischer Scientific11 690 516DQ
Mikro-PräparierpinzetteRoboz Surgical Instruments Co.RS-5010
MikrometerTed Pella, Inc.Nr. 2280-24

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