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Methodenartikel

Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

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DOI:

10.3791/54252

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8. Oktober 2016

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1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 + CD34 - Perizyten und CD34 + CD146 - Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Zusammenfassung

Multipotente mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) wurden konventionell durch ihre plastische Adhärenz aus primären Gewebedigesten isoliert, während ihre anatomische Gewebelokalisation unklar blieb. Die jüngste Entdeckung der definierten perivaskulären und MSC-Zellmarkerexpression durch perivaskuläre Zellen in mehreren Geweben durch unsere Gruppe und andere Forscher hat die Möglichkeit geboten, spezifische homogene Subpopulationen multipotenter perivaskulärer Vorläuferzellen prospektiv zu isolieren und zu reinigen. Wir haben bereits die Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Aufreinigung von mikrovaskulären CD146+CD34-Perizyten und vaskulären CD34+CD146-Adventitialzellen aus der menschlichen Skelettmuskulatur demonstriert. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung dieser beiden perivaskulären Zelluntergruppen aus humanem Myokard mittels FACS, basierend auf der Expression eines definierten Satzes von Zelloberflächenmarkern für positive und negative Selektionen. Diese Methode stellt somit zwei spezifische Subpopulationen von multipotenten kardialen MSC-ähnlichen Vorläuferzellen für den Einsatz in der Grundlagenforschung und/oder therapeutischen Untersuchungen zur Verfügung.

Einleitung

Das Herz ist seit langem ein post-mitotischen Organ betrachtet worden. Allerdings haben die jüngsten Studien , die die Anwesenheit von begrenzter Kardiomyozyten Umsatz in erwachsenen menschlichen Herzen zeigten 1. Einheimische Stamm- / Vorläuferzellen mit Kardiomyozyten Differenzierungspotential haben auch im Myokard bei erwachsenen Nagetieren und die Herzen der Menschen, einschließlich Sca-1 +, c-kit +, cardiosphere bildende und zuletzt, perivaskuläre Vorläuferzellen 2,3 identifiziert worden. Diese Zellen stellen attraktive Kandidaten für Therapien zur Verbesserung der Herz Reparatur / Regeneration durch Zelltransplantation oder Stimulation der Proliferation in-situ gerichtet.

Mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) wurden aus fast jedem menschlichen Gewebe 4,5 Klinische Studien der therapeutischen Anwendungen von MSC durchgeführt wurden für mehrere pathologische Zustände wie Herz - Kreislauf - Reparatur 6, Graft-versus-host-Krankheit 7 isoliert Und Leberzirrhose 8. Positive Effekte wurden auf die Fähigkeit von MSCs zu zugeschrieben: die Heimat von Entzündungsherden 9; Differenzierung in verschiedene Zelltypen 10; sezernieren pro-reparative Moleküle 11; und modulieren Wirtsimmunantworten 12. Die Isolierung von MSCs ist traditionell auf ihre bevorzugte Einhaltung von Kunststoffsubstraten verlassen. Jedoch ist die sich ergebende Population von Zellen typischerweise deutlich heterogenes 13. Durch die Verwendung von Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung (FACS) mit einer Kombination von Schlüssel perivaskuläre Zellmarker, konnten wir eine multi MSC artigen Vorläuferpopulation (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) zur Isolierung und Reinigung von mehrere menschliche Gewebe einschließlich der Erwachsenenskelettmuskulatur und weiße Fett 14.

Perivaskuläre Zellpopulationen in verschiedenen Nicht-Herzgewebe haben ein gezeigt, Stamm- / Vorläuferzelleigenschaften habennd werden für den klinischen Einsatz in der Herz-Kreislauf-Einstellung untersucht. Perizyten, einer der bekanntesten perivaskulärem Zell - Subpopulationen, sind eine heterogene Population , die 15 in der Entwicklung neuer Schiffe , darunter mehrere pathophysiologische Rolle spielen, die Regulation des Blutdrucks 16 und Aufrechterhaltung der vaskulären Integrität 17,18. Wie in vielen Geweben gezeigt, spezifische Teilmengen von Perizyten nativ MSC Antigene exprimieren und ihre MSC-ähnliche Phänotypen in Primärkultur nach FACS Reinigung 14 aufrecht zu erhalten. Außerdem halten diese Zellen stabil ihre langfristigen Phänotypen in der Kultur und zeigen Multi-Linie Differenzierungspotential, ähnlich wie MSCs 19,20. Diese Ergebnisse legen nahe , dass Perizyten sind einer der Ursprünge der schwer fassbaren MSC 14. Das therapeutische Potential von Perizyten wurde mit einer Verringerung der myokardialen Vernarbung und verbesserte Herzfunktion nach der Transplantation nachgewiesen in ischämisch verletztHerzen 21. Vor kurzem haben wir Perizyten aus dem humanen Myokard erfolgreich gereinigt und zeigten ihre MSC-ähnliche Phänotypen und Multipotenz (Adipogenese, Chondrogenese und Osteogenese) mit dem Fehlen von Skelett myogenesis 3. Darüber hinaus zeigte myokardialen pericytes Differential kardiomyogenen Potential und angiogene Kapazitäten im Vergleich zu Kollegen aus anderen Organen gereinigt.

Eine zweite Population von multipotenten perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzellen, die adventitiellen Zelle, hat sich von menschlichen Saphenavenen auf der Grundlage der positiven CD34 - Expression 22 isoliert. Venöse adventitiellen Zellen wurden clonogene Potenzial, mesodermalen Differenzierungsfähigkeit und proangiogenic Potential in vitro haben gezeigt. Transplantation dieser Zellen in die ischämisch verletzten Herzen von Mäusen führte zu einer Verringerung der interstitiellen Fibrose, einer Zunahme der Angiogenese und myokardiale Blutfluß reduziert ventrikulären dilation und erhöhte Herzauswurffraktion 23. Interessanterweise haben adipöse adventitiellen Zellen wurden mit Stimulation 24 gezeigt CD34 - Expression verlieren und upregulate CD146 - Expression in Kultur als Reaktion auf Angiopoietin II Behandlung, was auf die Annahme eines pericyte Phänotyp. Innerhalb des Herzens, jedoch hat die Adventitia-Zellpopulation noch nicht durch FACS und / oder gut charakterisiert prospektiv gereinigt. Unter Verwendung der Zellisolierungsverfahren in den folgenden Abschnitten beschrieben, charakterisieren wir derzeit myokardialen adventitiellen Zellen und untersuchen ihr Potential für die regenerative Anwendungen.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zwei Subpopulationen von perivaskulären Stamm- / Vorläuferzellen aus menschlichen fötalen oder erwachsenen Myokard zu isolieren und zu reinigen. Diese prospektive Zellisolierungsverfahren ermöglichen es den Forschern zu isogenen perivaskulären Stammzellen / Vorläuferzelluntergruppen aus menschlichem Herz-Biopsien für vergleichende Studien und furthe erhaltenr erkunden ihr therapeutisches Potential in verschiedenen Herz pathologischen Zuständen.

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Protokoll

1. Verarbeitung von menschlichem Herz Probe

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten, Behälter, Instrumente, und der speziellen Einsatzgebiet sind steril.
  2. Platzieren Sie die Herzgewebeprobe (beschafft von der Gewebebank oder chirurgische Team) in dem Speichermedium, bestehend aus gekühltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis für den Transport 3.
  3. Entfernen Sie die Herzprobe aus dem Speichermedium und Waschen mit einem Waschmedium, bestehend aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), supplementiert mit 2% FBS und 1% P / S. Wenn das Probenhandling, benutzen feine gespitzte Pinzette große Gefäße oder Herzbeutel zu erfassen und zu minimieren des Myokard zerdrücken.
  4. Tauchen Sie die Probe in Waschmedium in einer Petrischale und entfernen Sie den Herzbeutel, Endokard und großen Blutgefäße mit sterilisiertem Iris Schere und fein kippte Zange als 3 beschrieben.
  5. Schneiden Sie die restlichen myocardium in kleine Stücke von etwa 1 mm 3 eine einzelne Seite Rasierklinge oder ein Paar scharfe Iris Schere. Hinweis: Das höchste Zellausbeuten erzielt werden, wenn die Proben sofort verarbeitet werden. Wenn eine Verzögerung unvermeidbar ist, Speicherung des verarbeiteten Herzgewebe in der frischen Speichermedium (> 5 ml pro 1 cm 3 Gewebe) bei 4 ° C für bis zu 72 Stunden ist möglich, jedoch vermutlich mit einem zugehörigen Abnahme der Zellausbeute.

2. Die Verdauung des Gewebes und Isolierung von Zellen

  1. Make-up Frisch die Verdauung Lösung, die 1,5 ml jeweils von Kollagenase I, Kollagenase II und Kollagenase IV (alle bei 0,5 mg / ml in DMEM) und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad.
    Hinweis: Volumen und die Konzentration von Kollagenase für Proben von etwa 1 cm 3 geeignet sind.
  2. Filtern Sie die suspendierten Gewebestücke durch ein 100 & mgr; m Sieb und waschen zweimal mit PBS. Übertragen Sie die Gewebestücke in einen sterilen 30 ml-Behälter mitein dicht verschlossenen Deckel.
    Hinweis: Kurze breite Töpfe anstatt hohen, schmalen Röhren zu besseren Ergebnissen führen. Alternativ dazu können Sie Gewebestücke in einer sterilen 50-ml-Röhrchen und horizontal platzieren, wenn ein 30-ml-Behälter nicht zur Verfügung steht.
  3. Fügen Sie die alle Aufschlüssen (4,5 ml gesamt) und stellen Sie den Behälter in einem verschlossenen Plastikbeutel in einem 37 ° C geschüttelten Wasserbad auf 120 Umdrehungen pro Minute. Alternativ dichten den Behälter mit Paraffinfilm und in einem beheizten Orbitalrüttler bis 120 Umdrehungen pro Minute eingestellt.
  4. Nach 15 Minuten, zu entfernen und den Topf dreimal umdrehen, bevor sie für weitere 15 min zu ersetzen. Entfernen und löschen Sie die Kollagenasen mit 5 ml DMEM mit 20% FBS und 1% P / S.
  5. Man reibt den Digest durch vorsichtiges Pipettieren zehn bis zwanzig Mal mit einer 10 ml serologische Pipette alle Gewebe Klumpen aufzubrechen. Filtern der Suspension nacheinander durch 100 & mgr; m, 70 & mgr; m und schließlich 40 & mgr; m Zellfilter auf unverdaute Materialien zu entfernen und erhalten, die eine Einzelzellsuspension.
    Hinweis:Nicht ausspülen zwischen Zelle strainers Zelle durch das Enzym Verdauung debrisgenerated zu vermeiden.
  6. Zentrifugiere die Zellsuspension bei 200 × g für 4 min, den Überstand vorsichtig dekantiert und erneut zu suspendieren, das Pellet in 1 ml des roten Zellenpuffer für 2 min bei Raumtemperatur zu lysieren, bevor mit 4 ml Waschmedium verdünnt.
  7. Wiederholen der Zentrifugationsschritt und resuspendieren das Pellet in 1 ml Waschmedium. Gut mischen und nehmen 10 & mgr; l der Zellsuspension zur Zellzählung.
  8. Mischungs 10 & mgr; l der Zellsuspension mit 10 ul Trypanblau-Färbung und stellen 10 & mgr; l der Mischung auf einem Standard-Zählkammer zur Zellzählung. Zählen Sie die Anzahl der hellen, runden Zellen, die in den vier Eckquadrate (jeweils in sechzehn kleine Quadrate unterteilt) und dividieren durch 4, um den Mittelwert pro Eckquadrat erhalten. Multiplizieren den Mittelwert von 2 bis Konto für den Faktor stain Verdünnung und dann von 10 4 bis die Gesamtzahl der Zellen pro 1 ml Probe erhalten.

3. Zell Kennzeichnung und Sortierung

  1. Je 50 ul Mausserum zu der Zellsuspension und Inkubieren bei 4 ° C für 20 min nicht spezifische Antikörperbindung zu blockieren.
  2. Zentrifugiere die Zellsuspension mit Mausserum bei 200 × g für 4 min, entfernen Überstand und resuspendiere in Waschmedium in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro 100 & mgr; l.
  3. 50 ul Aliquot jeder der Zellsuspension für den Isotyp und ungefärbten Kontrollen in zwei Polystyrol-Rundbodenröhrchen cytometry fließen dann die verbleibende Volumen in ein drittes Rohr für den Mehrfarbenfärbung schalten.
  4. In CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5 und CD146-AF647-Antikörper (alle 1: 100) in die Einzelzellsuspension für den Mehrfarbenfärbung. Für die Isotyp-Kontrolle, fügen äquivalente Volumina von PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- und AF647-konjugierte Isotyp-Antikörper. Sanft Pipette 20, die Antikörper mit den Zellen und inkubiere alle Röhrchen bei 4 ° C zu mischen,min im Dunkeln.
  5. Bereiten Sie Kompensationssteuer Perlen durch Zugabe von einem Tropfen positive Perlen auf 100 & mgr; l Waschmedium in fünf Polystyrol-Rundboden Durchflusszytometrie Rohre. Hinzufügen CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, PerCP CD144--Cy5.5 und CD146-AF647-Antikörper (alle 1: 100) einzeln mit jedem der fünf Rohre. Inkubieren Alle Röhrchen bei 4 ° C für 20 min im Dunkeln.
  6. Während der Inkubation vorbereiten Röhren Zellsammlung mit jeweils 500 ul Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) Kulturmedium und bei 4 ° C.
  7. Nach Antikörper Inkubation mit 5 ml Waschmedium Zellen und Perlen zu waschen, um ungebundenen Antikörper zu entfernen. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen bei 200 g für 4 min. Wiederholen Sie die Wasch- und Zentrifugationsschritt. Vorsichtig dekantieren vorsichtig den Überstand und Pipette, wenn die Zellen erneut suspendieren.
  8. Resuspendieren in Waschmedium in einer Konzentration von etwa 1 x 10 6 Zellen pro 250 & mgr; l. Re-suspend die Perlen in 100 ul Wasch mittel.
  9. Transportieren alle Zell- und bead Suspensionen Zellsortierers auf Eis im Dunkeln. 1 Tropfen negativen Perlen auf die positiven Wulst Kompensationssteuerrohre und verwenden diese die Fluoreszenzkompensation einzustellen.
  10. Führen Sie ungefärbten Kontrollzellen gemäß den Anweisungen des Herstellers die Hintergrundfluoreszenz und legen Sie die Spannungen an den folgenden herzustellen: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. Führen Isotypen steuert den Anweisungen des Herstellers entsprechend die Hintergrundfluoreszenz Schwellenwerte unspezifische Bindung Zusammenhang herzustellen. Führen Sie die mehrfarbigen gefärbten Probe und sammeln die pericyte und adventitiellen Zellpopulationen in die Sammelröhrchen (Abbildung 1).
    HINWEIS: Optimale Lebendzellausbeuten sind etwa 3% der gesamten lebenden Zellen Dissoziation für pericytes und 4% für adventitiellen Zellen.

4. Zellkultur

  1. Wählen Sie geeignete Größe Kulturplatten nach dem Ergebnis der FACS-Sortierung. In 100 ul sterilem 0,2% Gelatinelösung pro cm 2 Wachstumsbereich und agitieren manuell die gesamte Brunnen zu beschichten. Inkubiere Platten bei 4 ° C für 10 min und Gelatinelösung vollständig zu entfernen. Halten gesammelten Zellen auf Eis während der Vorbereitung Kulturplatten.
    Hinweis: Frisch sortiert Perizyten und Adventitia - Zellen wachsen gut , wenn sie in einer Dichte von 30.000 bis 40.000 Zellen / cm 2 auf Gelatine-beschichteten Kulturoberfläche beimpft.
  2. Zentrifugieren frisch gesammelten Zellen bei 200 g für 4 min und vorsichtig resuspendieren das Zellpellet in einer geeigneten Menge EGM-2.Seed die Zellen auf Gelatine-beschichteten Platten.
    Hinweis: Die tatsächliche Anzahl der Zellen pro Vertiefung und der Menge des EGM-2 beimpft hinzugefügt werden auf der Platte Auswahl abhängen wird. Beispielsweise 0,5 ml und 1 ml EGM-2 werden pro Well benötigt für 48- und 24-Well-Platten sind.
  3. Wechsel EGM-2 für perivaskuläre Zellwachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 20% FBS und 1% P / S) für beide Perizyten und Adventitia-Zellen einmal Zellen an der Platte (nach mindestens 72 Stunden angesiedelt und geklebt). Ändern Sie die Medien alle 72 Stunden von da an. Führen Sie Anfangs- und alle nachfolgenden Inkubationen in 5% CO 2 und bei 37 ° C.
  4. Dissoziieren Zellen 0,05% Trypsin EDTA verwendet, wenn Perizyten und Adventitia-Zellen erreichen 80 bis 90% Konfluenz. Gequenscht mit 20% FBS in PBS, Zentrifugation bei 200 × g für 4 min, resuspendieren in perivaskulären Zellwachstumsmedium und dann Durchgang der Zellen bei einem Verhältnis 1: 3 auf unbeschichteten Polystyrol-Kulturplatten. Von Passage 2 ab, passage Zellen bei einer 1: 5 - Verhältnis (oder bei etwa 7.000 Zellen / cm 2) zu unbeschichteten Polystyrol - Kulturplatten oder Flaschen.

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Ergebnisse

Einzelzellen wurden von Schutt und Dubletts auf der Basis von Vorwärts- und Seitenstreuverteilungen unterscheiden. Lebende Zellen wurden durch ihr Versagen identifiziert den DAPI Farbstoff aufzunehmen. Die Gating - Strategie wurde auf der Grundlage der Isotyp - Kontrolle Kennzeichnung dieser Live, Vollherz Zelldissoziationsmedium (Abbildung 1) gewählt. Von den lebenden Zellen wurden CD45 + Zellen zuerst gated out, durch CD56 + -Zellen , gefolgt. CD1...

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Diskussion

Zunehmende Beweise unterstützt eine begrenzte Regenerationsfähigkeit des erwachsenen menschlichen Herzens nach einer Verletzung. Identifizierung und Charakterisierung von nativen Vorläuferzellen verantwortlich für solche regenerative Reaktionen in verletzten Herzen sind beide entscheidend für das Verständnis der damit verbundenen Mechanismen und Signalwege und die Entwicklung von Ansätzen, diese Zellen therapeutisch zu nutzen.

Vorherige Protokolle haben die Isolierung von perivaskulären Vorl...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Konflikt offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi und Will Ramsay von der University of Edinburgh sowie Alison Logar und Megan Blanchard von der University of Pittsburgh für ihre fachkundige Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Wir möchten uns auch bei Anne Saunderson und Lindsay Mock für ihre Hilfe bei der Gewinnung von menschlichem Gewebe bedanken. Herzgewebeproben von Menschen bei Erwachsenen und Föten wurden mit voller Ethikgenehmigung des NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics bzw. des NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) beschafft. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Medical Research Council (BP), der British Heart Foundation (BP), des Commonwealth of Pennsylvania (BP), des Children's Hospital of Pittsburgh (BP), des National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP) und des Henry J. Mankin Stiftungslehrstuhls an der University of Pittsburgh (JH) unterstützt. JEB wurde durch einen Promotionspreis des British Heart Foundation Centre of Research Excellence (RE/08/001/23904) unterstützt. WC wurde teilweise durch ein Predoctoral Fellowship der American Heart Association (11PRE7490001) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
AbC Anti-Maus Bead KitMolekulare SondenA-10344
Kollagenase IGibco17100-017Rekonstituieren Sie das Pulver nach Bedarf und filtern Sie Sterilisator
Kollagenase IIGibco17101-015
Kollagenase IVGibco17104-019
Anti-Human-CD34-PEBD Pharmingen555822Steril halten
Anti-Human-CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833Steril aufbewahren
Anti-Human-CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747Steril aufbewahren
Anti-Human-CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Steril halten
Anti-Human-CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Steril aufbewahren
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162Zur Entnahme von Zellen und Kulturen bis zur Einhaltung DMEM
, hohe Glukose, GlutaMAX ohne NatriumpyruvatThermoFischer Scientific10566-016
Fötales RinderserumThermoFischer Scientific10500-064In Aliquoten einfrieren und steril halten
GelatineSigma AldrichG1393Mit sterilem Wasser verdünnen
IgG1k-PEBD Pharmingen559320
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873
BD Pharmingen557872
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Steril halten
MausserumSigma AldrichM5905Aufbewahren
steriler Paraffinfilm - Parafilm MSigma AldrichP7793
Penicillin-StreptomycinGibco15979-063In Aliquoten einfrieren und steril halten
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4ThermoFischer Scientific10010-023Steril halten
Lysing Buffer für rote Blutkörperchen Hybri-MaxSigma AldrichR7757
Trypan steril halten Blaue LösungSigma AldrichT8154
Trypsin-EDTA 0,5%(10x)Invitrogen15400-054
  FACSARIA FUSIONBD PharmingenFluoreszenz-aktivierter Zellsortierer
IgG1k-PE-Cy7

Referenzen

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