Isolierung von Perivaskuläre multipotenten Vorläuferzellpopulationen aus menschlichem Herzgewebe

Summary

Menschliche Herzgewebe birgt multi perivaskuläre Vorläuferzellpopulationen, die für myokardiale Regeneration geeignet sein können. Die hier beschriebene Technik ermöglicht die gleichzeitige Isolierung und Reinigung von zwei multi stromalen Zellpopulationen , die mit nativem Blutgefäße, dh CD146 ⁺ CD34 ^- Perizyten und CD34 ⁺ CD146 ^- Adventitia - Zellen aus dem menschlichen Herzmuskel.

Abstract

Multipotente mesenchymale Stamm-/Stromazellen (MSC) wurden konventionell durch ihre plastische Adhärenz aus primären Gewebedigesten isoliert, während ihre anatomische Gewebelokalisation unklar blieb. Die jüngste Entdeckung der definierten perivaskulären und MSC-Zellmarkerexpression durch perivaskuläre Zellen in mehreren Geweben durch unsere Gruppe und andere Forscher hat die Möglichkeit geboten, spezifische homogene Subpopulationen multipotenter perivaskulärer Vorläuferzellen prospektiv zu isolieren und zu reinigen. Wir haben bereits die Verwendung von fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Aufreinigung von mikrovaskulären CD146⁺CD34-Perizyten und vaskulären CD34⁺CD146-Adventitialzellen aus der menschlichen Skelettmuskulatur demonstriert. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Verfahren zur gleichzeitigen Isolierung dieser beiden perivaskulären Zelluntergruppen aus humanem Myokard mittels FACS, basierend auf der Expression eines definierten Satzes von Zelloberflächenmarkern für positive und negative Selektionen. Diese Methode stellt somit zwei spezifische Subpopulationen von multipotenten kardialen MSC-ähnlichen Vorläuferzellen für den Einsatz in der Grundlagenforschung und/oder therapeutischen Untersuchungen zur Verfügung.

Introduction

Das Herz ist seit langem ein post-mitotischen Organ betrachtet worden. Allerdings haben die jüngsten Studien , die die Anwesenheit von begrenzter Kardiomyozyten Umsatz in erwachsenen menschlichen Herzen zeigten ^1. Einheimische Stamm- / Vorläuferzellen mit Kardiomyozyten Differenzierungspotential haben auch im Myokard bei erwachsenen Nagetieren und die Herzen der Menschen, einschließlich Sca-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere bildende und zuletzt, perivaskuläre Vorläuferzellen ^2,3 identifiziert worden. Diese Zellen stellen attraktive Kandidaten für Therapien zur Verbesserung der Herz Reparatur / Regeneration durch Zelltransplantatio....

Protocol

1. Verarbeitung von menschlichem Herz Probe

1. Stellen Sie sicher, dass alle Flüssigkeiten, Behälter, Instrumente, und der speziellen Einsatzgebiet sind steril.
2. Platzieren Sie die Herzgewebeprobe (beschafft von der Gewebebank oder chirurgische Team) in dem Speichermedium, bestehend aus gekühltem Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), das 20% fötales Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (P / S) auf Eis für den Transport ^3.
3. Entfernen Sie die Herzprobe aus dem Speichermedium und Waschen mit einem Waschmedium, bestehend aus phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), supplementiert mit 2% FBS und 1% P / S. Wenn das Probe....

Results

Einzelzellen wurden von Schutt und Dubletts auf der Basis von Vorwärts- und Seitenstreuverteilungen unterscheiden. Lebende Zellen wurden durch ihr Versagen identifiziert den DAPI Farbstoff aufzunehmen. Die Gating - Strategie wurde auf der Grundlage der Isotyp - Kontrolle Kennzeichnung dieser Live, Vollherz Zelldissoziationsmedium (Abbildung 1) gewählt. Von den lebenden Zellen wurden CD45 ⁺ Zellen zuerst gated out, durch CD56 ⁺ -Zellen , gefolgt. CD1.......

Discussion

Zunehmende Beweise unterstützt eine begrenzte Regenerationsfähigkeit des erwachsenen menschlichen Herzens nach einer Verletzung. Identifizierung und Charakterisierung von nativen Vorläuferzellen verantwortlich für solche regenerative Reaktionen in verletzten Herzen sind beide entscheidend für das Verständnis der damit verbundenen Mechanismen und Signalwege und die Entwicklung von Ansätzen, diese Zellen therapeutisch zu nutzen.

Vorherige Protokolle haben die Isolierung von perivaskulären Vorl.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AbC Anti-Maus Bead Kit	Molekulare Sonden	A-10344
Kollagenase I	Gibco	17100-017	Rekonstituieren Sie das Pulver nach Bedarf und filtern Sie Sterilisator
Kollagenase II	Gibco	17101-015
Kollagenase IV	Gibco	17104-019
Anti-Human-CD34-PE	BD Pharmingen	555822	Steril halten
Anti-Human-CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	Steril aufbewahren
Anti-Human-CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	Steril aufbewahren
Anti-Human-CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	Steril halten
Anti-Human-CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	Steril aufbewahren
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	Zur Entnahme von Zellen und Kulturen bis zur Einhaltung DMEM
, hohe Glukose, GlutaMAX ohne Natriumpyruvat	ThermoFischer Scientific	10566-016
Fötales Rinderserum	ThermoFischer Scientific	10500-064	In Aliquoten einfrieren und steril halten
Gelatine	Sigma Aldrich	G1393	Mit sterilem Wasser verdünnen
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	557873
	BD Pharmingen	557872
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	Steril halten
Mausserum	Sigma Aldrich	M5905	Aufbewahren
steriler Paraffinfilm - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15979-063	In Aliquoten einfrieren und steril halten
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung pH 7,4	ThermoFischer Scientific	10010-023	Steril halten
Lysing Buffer für rote Blutkörperchen Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757
Trypan steril halten Blaue Lösung	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0,5%(10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierer