In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur funktionellen Untersuchung der Transkription und der inhibitorischen Aktivität von antibakteriellen Wirkstoffen, die auf die bakterielle Transkription abzielen.
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Methodenartikel
In - vitro - Transkriptionsassays und ihre Anwendung in der Drug Discovery
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In - vitro - Transkriptionstests wurden seit vielen Jahren zur Untersuchung der molekularen Mechanismen , die in Transkriptions entwickelt und weit verbreitet. Dieses Verfahren erfordert Multi-Untereinheiten-DNA-abhängige RNA-Polymerase (RNAP), und eine Reihe von Transkriptionsfaktoren, die die Aktivität von RNAP während Genexpression zu modulieren wirken. Sequencing-Gelelektrophorese von radiomarkiertem Transkripte wird verwendet, auf detaillierte mechanistische Informationen zu geben, wie die Transkription und welche Parameter können sie beeinflussen. In diesem Dokument beschreiben wir das Protokoll zu untersuchen, wie die wesentliche Elongationsfaktor NusA Transkriptions Pausieren regelt, sowie ein Verfahren, ein antibakterielles Mittel Targeting Transkriptionsinitiations durch Hemmung der RNAP Holoenzym Bildung zu identifizieren. Diese Verfahren können als eine Plattform für die Entwicklung von zusätzlichen Ansätze verwendet werden, um den Wirkungsmechanismus der Transkriptionsfaktoren zu untersuchen, die noch unklar bleiben, sowie neue antibakterielle agents Targeting Transkription, die ein nicht ausgelastete Medikament Ziel in der Antibiotika-Forschung und Entwicklung ist.
Einleitung
Transcription ist der Prozess, in dem RNA von einer spezifischen DNA-Matrize synthetisiert wird. In eukaryotischen Zellen gibt drei verschiedene RNAPs sind: RNAP I transkribiert rRNA Vorläufern ist RNAP II verantwortlich für die Synthese von mRNA und bestimmte kleine nukleare RNAs, und die Synthese von 5S-rRNA und tRNA wird durch RNAP III durchgeführt. In Bakterien, gibt es nur eine RNAP, die für die Transkription aller Klassen von RNA. Es gibt drei Stufen der Transkription: Initiation, Elongation und Termination. Transcription ist eine der am stärksten regulierten Vorgänge in der Zelle. Jede Stufe in der Transkriptionszyklus stellt einen Prüfpunkt für die....
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Protokoll
Achtung: Die Experimente umfassen die Verwendung des radioaktiven Isotops 32 P und keine Arbeit sollte , bis alle entsprechenden Sicherheitsbedingungen erfüllt sind durchgeführt werden. Im Allgemeinen Personal sind verpflichtet, einen Sicherheitskurs zu besuchen und überwachten Praxis vor den Experimenten mit radioaktiven Reagenzien unterzogen werden. Bitte tragen Sie persönliche Schutzausrüstung (Thermolumineszenzdosimeter, Schutzbrille, Handschuhe, Bestrahlungsraum Kitteln, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe), wenn die Reaktion durchgeführt wird.
1. Herstellung von Assay Materials
- Besorgen Sie sich die Proteine Erforderlich f....
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Ergebnisse
Transkriptionseffizienz kann durch Messen der Strahlungspegel in den Frequenzbändern zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden. Die Pause - Test die Funktion NusA Faktor aktiviert Visualisierung der Pause, Abbruch zu testen und Run-off - Produkte (1A). In der Gegenwart des N-terminalen Domäne von NusA (NusA NTD; Aminosäurereste 1-137), Aussehen der RNA-Produkte war signifikant im Vergleich zu dem Kontrollversuch verzögert fehlt NusA. Deletion der Aminosäurereste 104-1.......
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Diskussion
In allen Organismen ist die Transkription eines stark regulierten Prozess. In vitro Transkriptionsassays eine Plattform zum Testen der Wirkung von Transkriptionsfaktoren, kleine Moleküle und Transkriptionsinhibitoren bereitzustellen , wurden entwickelt. Bei diesem Verfahren wird Papier, wurde ein Test für die allgemeine bakterielle Transkriptions beschrieben. Transkriptionsassays mit Sequenzierung Gelelektrophorese von Transkripten kombiniert sind sehr wichtig für mechanistische Studien, wie sie Visualisierung .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit würdigt ein Faculty Early Career Grant der University of Newcastle (CM).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gewinnung der für den Transkriptionsassay | |||
| ProteineE. coli RNAP | Epicentre | S90250 | |
| Herstellung von DEPC-behandeltem | |||
| (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNasefreies Wasser | |||
| Ambion Nukleasefreies Wasser | ThermoFisher | AM9937 | |
| Assistent zur Vorbereitung | |||
| Plus SV Minipreps DNA-Aufreinigungssystem, | Promega | A1330 | |
| ACCUZYME Mix | Bioline | BIO-25028 | |
| PCR-Primer, | |||
| Wizard SV Gel und PCR-Clean-Up System | Promega | A9281 | |
| NanoDrop 3300 Fluorspektrometer | Thermo Scientific | ND-3300 | |
| NTP Vorbereitung | |||
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| UTP | Sigma-Aldbsp; | U1006 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G3776 | |
| CTP | Sigma-Aldrich | C9274 | |
| rNTPs mit hoher Reinheit | GE Healthcare | 27-2025-01 | |
| α-32P UTP | PerkinElmer | BLU007C001MC | radioaktive Verbindungen |
| Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kb | Millipore | 69003 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006 | |
| Natriumchlorid | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldbsp; | M8266 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| T7 RNAP | Promega | P2075 | |
| Gelvorbereitung | |||
| Sequi-Gen GT Nukleinsäure-Sequenzierungszelle | Bio-Rad | 165-3804 | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| Harnstoff | Sigma-Aldrich | U6504 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethan | Sigma-Aldrich | ||
| Borsäure | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Sigma-Aldrich | ED | |
| 40% Acrylamid/Bis-Acrylamid | Sigma-Aldrich | A9926 | |
| Ammoniumpersulfat | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Transkriptionsassay | |||
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| Formamid | Sigma-Aldrich | F9037 | |
| Bromphenolblau | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Xylol-Cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | 84020 | |
| RNasin-Ribonuklease-Inhibitor | Promega | N2511 | |
| Transkriptionspuffer | |||
| Tris-Basis | Sigma-Aldbsp; | T1503 | |
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldbsp; | P9541 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma-Aldbsp; | M2393 | |
| DVB-Ton | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| Glycerin | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Filterpapier | |||
| Whatman 3MM Chr Chromatographie Papier | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Radioaktives Dekontaminationsmittel | |||
| Decon 90 | Decon | Decon90 | |
| Gel Treatment | |||
| Typhoon Trio+ Imager | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-89 |
Referenzen
- Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
- Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymer....
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Nachdrucke und Genehmigungen
