Schnelle und vereinfachte Verfahren für Hochdurchsatz-Isolierung von miRNA aus Highly Purified High Density Lipoprotein

Zusammenfassung

MicroRNAs spielen eine wichtige regulatorische Rolle und werden als neue therapeutische Targets für verschiedene menschliche Krankheiten entstehen. Es hat sich gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen hoher Dichte durchgeführt werden. Wir haben ein vereinfachtes Verfahren entwickelt, um schnell gereinigter HDL für miRNA-Analyse von Humanplasma geeignet isolieren.

Zusammenfassung

Kleine nicht-kodierende RNAs (miRNAs) wurden mit einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten, einschließlich metabolischer Syndrome, in Verbindung gebracht. Sie können als Biomarker für die Diagnose und Prognose verwendet werden bzw. als Ziele für die Arzneimittelentwicklung dienen. Kürzlich wurde gezeigt, dass miRNAs in Lipoproteinen, insbesondere Lipoproteinen hoher Dichte (HDL), transportiert und zur Aufnahme an die Empfängerzellen abgegeben werden. Dies wirft die Möglichkeit auf, dass miRNAs eine entscheidende und entscheidende Rolle bei der Zell- und Organfunktion spielen, indem sie die Genexpression regulieren und Botenstoff für die Zell-Zell-Kommunikation und die Kommunikation zwischen Organen sind. Aktuelle Methoden zur miRNA-Isolierung aus gereinigtem HDL sind unpraktisch, wenn kleine Proben in großem Maßstab verwendet werden. Dies ist vor allem auf die zeitaufwändigen und mühsamen Methoden zurückzuführen, die für die Isolierung von Lipoproteinen verwendet werden. Wir haben einen vereinfachten Ansatz entwickelt, um gereinigtes HDL, das für die miRNA-Analyse geeignet ist, schnell aus Plasmaproben zu isolieren. Diese Methode soll Untersuchungen zur Rolle von miRNAs bei Gesundheit und Krankheit erleichtern und insbesondere neue Erkenntnisse über die Vielfalt der biologischen Funktionen außerhalb des reversen Cholesterintransports liefern, die HDL zugeschrieben werden. Auch die miRNA-Spezies, die in HDL vorhanden sind, können wertvolle Informationen über klinische Biomarker für die Diagnose verschiedener Krankheiten liefern.

Einleitung

MicroRNAs sind endogene nicht-kodierende winzige RNA-Spezies, die hochkonserviert sind und als Schlüsselakteure bei der Regulation verschiedener biologischer Prozesse gelten, indem sie spezifische Ziel-Boten-RNAs abbauen oder unterdrücken¹. Da miRNAs intrazellulär wirken, wurden sie als gewebeabgeleitete Biomarker erforscht, was zur Entdeckung gewebespezifischer Funktionen dieser miRNA führte. miRNAs kommen aber auch extrazellulär vor, entweder in Verbindung mit Proteinen oder in Exosomen/Mikrovesikeln, die sie effektiv vor dem Abbau durch extrazelluläre RNasen schützen können². Neuere Studien haben gezeigt, dass die schützende Wirkung von HDL mö....

Protokoll

1. Entnahme von Blutproben

1. Sammeln peripheren Fasten Blutproben in einem 10 ml-Plastikröhrchen mit Antikoagulans (EDTA) durch Standard venipuncture einer prominenten Vene in der Ellenbeuge (die mehrere Vorteile gegenüber anderen Antikoagulantien hat).
2. Zentrifugieren der Blutproben bei 1.600 xg für 20 min bei 4 ° C in einer Tischzentrifuge Plasma frei von roten Blutkörperchen und geringe Mengen an RNA zu erhalten.
3. zentrifugieren sequentielles der Überstand bei 3.000 g (4 ° C) in einem Schwingbecher-Rotor für 10 min zu entfernen WBC & Platelets und dann weitere 15 min jeweils verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen.
4. Messen der Di....

Ergebnisse

Isolierung von High Density Lipoprotein Nach Entfernen von Exosomen
MiRNA aus hochgereinigtem HDL zu erhalten , ist es notwendig , Exosomen zu entfernen , die eine Quelle der Verschmutzung miRNA ⁷ darstellen. Dies wurde vor der Dichtegradient Ultrazentrifugation mit einem im Handel erhältlichen Kits durchgeführt. Für praktische Zwecke ein Drei - Stufen - Standarddichte - Ultrazentrifugation Protokoll , das von kommerziellen Unternehmen .......

Diskussion

Identifizierung neuer Biomarker aus Blut werden in der klinischen Diagnose und Prognose von verschiedenen Krankheiten unterstützen. MicroRNAs sind bekannt , alle Qualitäten von Biomarkern zu besitzen und haben in verschiedenen Studien ^14-17 gezeigt. In dieser Studie haben wir eine schnelle und einfache einfache Methode zur Isolierung miRNA aus Plasma-HDL demonstriert. Herkömmliche Dichtegradient Ultrazentrifugation Verfahren zur Isolierung von VLDL, LDL und HDL , hängt von genauen Abtastung von Plasma, präzis.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kunststoff Vacutainer Lavendel K2EDTA Röhren	Becton, Dickinson and Company	366643
Zentrifuge	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densito 30PX Densito Densitometer	Mettler Toledo	MT51324450
ExoQuick Lösung	Invitrogen	4484451
dickwandiges Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 Ultrazentrifuge	Thermo Scientific	46902
Fettrot 7B	Sigma-Aldrich	201618
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 Zentrifugalfiltergeräte 10K	Millipore	UFC901008
Amicon UltraZentrifugalfiltergeräte 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo Kit	Helena Laboratorien	3344,3544T
Humane Lipoproteinstandards für VLDL, LDL und HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Vorbereitungspuffer	Helena Laboratorien	3100
RNeasy MinElute Spin-Säulen	Qiagen
NanoDrop 1000 Analysator	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
CFX96 Touch Echtzeit-PCR-Nachweissystem	BioRad
miRNeasy Serum/Plasma Kit	QIAGEN	217184
miScript Primer Assays	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma-Spike-In-Steuerung	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
480878 0,20 µ M steriler Spritzenvorsatzfilter	SIGMA-ALDRICH	Z227536

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