Wir zeigen eine speicherbare, transportierbar Lipid-Doppelschicht Bildungssystem. Eine Lipid-Doppelschicht-Membran kann mit mehr als 80% Erfolgsquote innerhalb von 1 h gebildet werden, wenn eine gefrorene Membran Vorläufer auf Umgebungstemperatur gebracht wird. Dieses System wird mühsamen Prozesse reduzieren und Know-how mit Ionenkanälen verbunden.
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Methodenartikel
Automatisierte Lipid Bilayer Membrane Formation eines Polydimethylsiloxans Dünnschicht unter Verwendung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine künstliche Lipiddoppelschicht oder schwarze Lipidmembran (BLM) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, Ionenkanäle und Protein-Wechselwirkungen, sowie für Biosensor-Anwendungen für die Untersuchung. Jedoch weisen herkömmliche BLM Bildungstechniken mehrere Nachteile, und sie erfordern häufig spezifische Know-how und eine aufwendige Arbeit. Insbesondere leiden herkömmliche BLMs von niedrigen Bildung Erfolgsraten und inkonsistent Membranbildung Zeit. Hier zeigen wir eine speicherbare und transportierbare BLM Erzeugungssystem mit kontrolliertem Ausdünnungs Zeit und verbesserte BLM Bildungsrate von üblicherweise verwendeten Folien ersetzt (Polytetrafluorethylen, Polyoxymethylen, Polystyrol) zu Polydimethylsiloxan (PDMS). In diesem Experiment wird ein poröser strukturierte Polymer wie PDMS-Dünnfilm verwendet. Zusätzlich, im Gegensatz zu konventionell verwendeten Lösungsmitteln mit niedriger Viskosität, erlaubt die Verwendung von Squalen eine kontrollierte Ausdünnungs Zeit über langsame Lösungsmittelabsorption durch PDMS, Membranlebensdauer verlängert wird. In der Werbunghinaus, indem eine Mischung aus Squalen und Hexadecan verwendet wurde, wurde der Gefrierpunkt der Lipidlösung erhöht (~ 16 ° C), außerdem wurden Membranvorläufern hergestellt, die auf unbestimmte Zeit gelagert werden können und ohne weiteres transportiert werden. Diese Membranvorstufen BLM Bildungszeit von reduzierten <1 h und erreicht eine BLM-Bildungsrate von ~ 80%. Außerdem zeigten Ionenkanal Gramicidin A Versuche mit der Durchführbarkeit des Membransystems.
Einleitung
Künstliche Lipiddoppelschichtmembran oder schwarze Lipidmembran (BLM), ist ein wichtiges Werkzeug für die Mechanismen von Zellmembranen und Ionenkanäle, sowie für das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Ionenkanälen und Ionen / Moleküle. 1-7 Obwohl der Patch-Clamp - Methode Aufklären künstrekonstruierte Membranen Lipid - Doppelschicht als Alternative Werkzeuge für die Ionenkanal - Studien wird häufig der Goldstandard für die Zellmembran Studien betrachtet, ist es mühsam ist und hoch qualifizierten Operatoren für Ionenkanal - Messungen erfordert. 8 Während entstanden sind, sind 9,10 sie auch mit mühsamen assoziiert Prozesse und s....
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Protokoll
1. Herstellung der Lösung
- Herstellung der Pufferlösung:
- Formulierung Pufferlösung aufzulösen 1 M KCl (Kaliumchlorid), 10 mM Tris-HCl (Tris-Hydrochlorid) und 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in destilliertem Wasser und pH-Einstellung auf 8,0.
- Filtern Sie die Lösung, die ein 0,20 um-Filter. Zu sterilisieren, autoklaviert die Lösung bei 121 ° C für 15 min.
- Herstellung von Lipid-Lösung für Pre-Malerei:
- Um die Lipidlösung für Vorlackierung formulieren, lösen sich 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- sn - glycero-3-Phosphatidylcholin) Lipid (w: v) in einer Mischung von 2: 8 n decan und Hexadecan (v:....
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Ergebnisse
Optimierung der MPES Lösung Zusammensetzung
Verschiedene Zusammensetzungen von Lipiden und Lösungsmittel wurden getestet, um erfolgreich Lipid-Bilayer-Membranen aus MPES rekonstituieren. Das MP - System mit einem Gemisch aus n- Decan und Hexadecan , enthaltend 3% DPhPC 14 zeigte eine geringe Erfolgsrate der Membranbildung (~ 27%). Zusätzlich kann, wie kontinuierlich Lipidlösung extrahiert die PDMS-Film war es erforderlich, die Lösungsmittelzusa.......
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Diskussion
Unsere BLM-Formationstechnik bietet ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Zellmembranen und Ionenkanälen, im Gegensatz zu herkömmlichen Techniken, die nur ein begrenztes Potenzial für den industriellen Einsatz haben. Wir entwickelten einen Membranvorläufer unter Verwendung einer PDMS-Dünnschicht und entwickelten einen gefrorenen Membranvorläufer mit beschleunigter Selbstorganisation.
Im Gegensatz zu herkömmlichen Membranbildungsmethoden mit hydrophoben Filmen, bei denen die Me.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Pioneer Research Center Program (NRF-2012-0009575) und National Research Foundation Grants (NRF-2012R1A1B4002413, NRF-2014R1A1A2059341) von der National Research Foundation of Korea. Diese Arbeit wurde teilweise auch durch das Inha University Research Grant unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Kaliumchlorid | Sigma-Aldrich | P9333 | Für Pufferlösung |
| Tris-Hydrochlorid | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | Für Pufferlösung |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | Für Pufferlösung |
| n-Decan | Sigma-Aldrich | 44074-U | Für Lipidlösung |
| Hexadecan | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | Für die Lipidlösung |
| Squalen | Sigma-Aldrich | S3626 | Für die Lipidlösung |
| Gramicidin A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | Membranprotein |
| 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | Für die Membrae-Bildung |
| Sylgard 184a und 184b Elastromer-Kit | Dow Corning Asia | Zur Herstellung von PDMS-Dünnschichten | |
| 0,2 μ m Filter | Satorius stedim | 16534----------K | Zum Filtern von Pufferlösung |
| Rotator | FinePCR | AG | Zum homogenen Auflösen von Lipiden |
| Autoklav | Biofree | BF-60AC | Zum Sterilisieren von Pufferlösung |
| Spin Coater | Shinu Mst | SP-60P | Zum Verteilen des PDMS-Prepolymers |
| Vaccum Dessikkator | Welch | 2042-22 | Zum Entfernen von Luftblasen in PDMS Prepolymer |
| 500 μ M Stanze | Harris Uni-Core | 0.5 | Zum Erstellen einer Apertur auf der PDMS-Dünnschicht-CNC-Maschine |
| SME Trading | SME 2518 | Zur Herstellung einer Membranbildungskammer | |
| Halogenfaseroptischer Strahler | Motic | MLC-150C | Zur Beleuchtung der Apertur des PDMS-Dünnfilms für die optische Betrachtung |
| Digitalmikroskop | Digital blau | QX-5 | Zur optischen Betrachtung der Lipid-Doppelschichtmembran Bildung |
| Elektrode | A-M Systeme | Zur elektrischen Beobachtung der Membranbildung | |
| Mikroelektrodenverstärker (Axopatch-Verstärker) | Axon Instruments | Axopatch 200B Verstärker | Zur Messung der Kapazität der Membran (im Manuskript als Mikroelektrodenverstärker beschrieben) |
Referenzen
- Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
- Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999). ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
