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Bioengineering

स्वचालित लिपिड bilayer झिल्ली गठन के एक Polydimethylsiloxane पतला फिल्म का उपयोग

Published: July 10, 2016 doi: 10.3791/54258
Automatic Translation
1,3, 1,3, 1,3, 2,3,4, 1,3,4
1Department of Biological Engineering, Inha University, 2Department of Mechanical Engineering, Inha University, 3Biohybrid Systems Research Center (BSRC), Inha University, 4Convergent Research Center for Metabolism and Immunoregulation (CRCMI), Inha University

Summary

हम एक संग्रहणीय, परिवहनीय लिपिड bilayer गठन सिस्टम प्रदर्शित करता है। एक लिपिड bilayer झिल्ली 80% से अधिक सफलता दर के साथ 1 घंटा के भीतर का गठन किया जा सकता है जब एक जमे हुए झिल्ली अग्रदूत परिवेश के तापमान के लिए लाया जाता है। इस प्रणाली श्रमसाध्य प्रक्रिया और आयन चैनल के साथ जुड़े विशेषज्ञता कम हो जाएगा।

Abstract

एक कृत्रिम लिपिड bilayer, या काले लिपिड झिल्ली (BLM), आयन चैनल और प्रोटीन बातचीत का अध्ययन, साथ ही biosensor अनुप्रयोगों के लिए के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। हालांकि, पारंपरिक BLM गठन तकनीक कई कमियां हैं और वे अक्सर विशिष्ट विशेषज्ञता और श्रमसाध्य प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, पारंपरिक BLMs कम गठन सफलता दर और असंगत झिल्ली गठन के समय से पीड़ित हैं। यहाँ, हम polydimethylsiloxane (PDMS) के लिए इस्तेमाल किया पारंपरिक फिल्मों (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) की जगह से नियंत्रित पतले होने के बाहर समय और बढ़ाया BLM गठन दर के साथ एक संग्रहणीय और परिवहनीय BLM गठन सिस्टम प्रदर्शित करता है। इस प्रयोग में, इस तरह के PDMS पतली फिल्म के रूप में एक झरझरा संरचित बहुलक प्रयोग किया जाता है। इसके अलावा, के रूप में कम चिपचिपापन साथ पारंपरिक प्रयोग सॉल्वैंट्स के लिए विरोध किया, squalene का उपयोग एक नियंत्रित पतले होने के बाहर समय धीमी गति से विलायक अवशोषण के माध्यम से PDMS द्वारा अनुमति, झिल्ली जीवन भर के समय को बढ़ाने। विज्ञापन मेंप्रत्यर्पण, squalene और hexadecane का एक मिश्रण का उपयोग करके, लिपिड समाधान की हिमांक (~ 16 डिग्री सेल्सियस), वृद्धि की गई थी इसके अलावा, झिल्ली व्यापारियों का उत्पादन किया गया है कि अनिश्चित काल के लिए भंडारित किया जा सकता है और आसानी से पहुँचाया है। ये झिल्ली व्यापारियों <1 घंटा की BLM गठन के समय कम और ~ का 80% एक BLM गठन दर हासिल की है। इसके अलावा, gramicidin एक साथ आयन चैनल प्रयोगों झिल्ली प्रणाली की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया।

Introduction

कृत्रिम लिपिड bilayer झिल्ली, या काले लिपिड झिल्ली (BLM), कोशिका झिल्ली और आयन चैनल, के तंत्र elucidating के लिए के रूप में अच्छी तरह से आयन चैनल और आयनों / अणुओं के बीच बातचीत को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। हालांकि 1-7 पैच दबाना विधि अक्सर कोशिका झिल्ली के अध्ययन के लिए स्वर्ण मानक माना जाता है, यह श्रमसाध्य है और आयन चैनल के मापन के लिए अत्यधिक कुशल ऑपरेटरों की आवश्यकता है। 8 कृत्रिम रूप से पुनर्गठित लिपिड bilayer झिल्ली आयन चैनल के अध्ययन के लिए वैकल्पिक उपकरण के रूप में उभरा है, वहीं 9,10 वे भी श्रमसाध्य साथ जुड़े रहे हैं प्रक्रियाओं और विशिष्ट विशेषज्ञता। इसके अलावा, झिल्ली यांत्रिक perturbations लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। इसलिए, लिपिड bilayer प्रौद्योगिकियों तारीख करने के लिए शुरू की गई सीमित है व्यावहारिक अनुप्रयोगों। 11

आदेश में मजबूती और लिपिड bilayer झिल्ली, कॉस्टेलो एट अल। 12, और आईडीई और Yanagida की लंबी उम्र बढ़ाने के लिए एट अल। 14 अंतरंग हाइड्रोजेल लिपिड bilayer संपर्क के साथ एक हाइड्रोजेल समझाया झिल्ली (हेम) तैयार कर लिया, (कई दिनों तक) बढ़ाया लंबी उम्र में हो जाती है। आगे हेम के जीवनकाल बढ़ाने के लिए, Malmstadt और Jeon एट अल। हाइड्रोजेल लिपिड में सीटू सहसंयोजक विकार (cgHEM)। 15 के माध्यम से बाध्यकारी दोनों प्रणालियों में से एक हाइड्रोजेल समझाया झिल्ली बनाई गई, झिल्ली जन्मों में काफी वृद्धि हुई (> 10 दिन) । हालांकि, झिल्ली गठन सिस्टम पर्याप्त रूप से मजबूत नहीं थे, और जमा नहीं किया जा सकता है या जन्म दिया जहां लिपिड bilayers के उपयोग के लिए विशेषज्ञता को आजाद कराने की आवश्यकता है।

एक लिपिड bilayer मंच के विकास के लिए मुख्य रूप से बढ़ती मजबूती और BLMs की लंबी उम्र के आसपास घूमती है। BLMs की लंबी उम्र सु किया गया हैbstantially बढ़ाया हाल ही में, अपने आवेदन पत्र transportability और storability की कमी के कारण सीमित कर दिया है। इन मुद्दों पर काबू पाने के लिए, Jeon एट अल। एक संग्रहणीय झिल्ली प्रणाली बनाया है और एक झिल्ली अग्रदूत (मध्य प्रदेश)। 16 पेश किया एक सांसद का निर्माण करने के लिए, वे युक्त 3% DPhPC (1,2-diphytanoyl- एन decane और hexadecane का एक मिश्रण तैयार एस.एन. -glycero-3-phosphatidylcholine) लिपिड समाधान ऐसी है कि यह ~ 14 डिग्री सेल्सियस (कमरे के तापमान से नीचे, ऊपर ठेठ रेफ्रिजरेटर के तापमान) में स्थिर होगा की हिमांक को नियंत्रित करने के। इस प्रयोग में, सांसद एक polytetrafluoroethylene (PTFE) फिल्म पर एक छोटा सा छेद में फैला हुआ था और बाद में 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में जमे हुए। सांसद कमरे के तापमान के लिए लाया गया था, सांसद thawed और एक लिपिड bilayer स्वचालित रूप से गठन किया गया था, विशेषज्ञता आम तौर पर झिल्ली गठन के साथ जुड़े को नष्ट करने। हालांकि, BLM की सफलता की दर से सांसद बने के रूप में ~ 27%, और झिल्ली रचना के रूप में कम थाn समय, असंगत (30 मिनट 24 घंटा के लिए) था इसके व्यावहारिक अनुप्रयोगों सीमित।

इस अध्ययन में, एक polydimethylsiloxane (PDMS) पतली फिल्म (एक) नियंत्रण निर्माण समय और (ख) BLM गठन की सफलता की दर बढ़ाने के लिए एक पारंपरिक हाइड्रोफोबिक पतली फिल्मों (PTFE, polyoxymethylene, polystyrene) के बजाय प्रयोग किया जाता है के रूप में पहले रयु द्वारा रिपोर्ट एट अल। 17 के साथ साथ, झिल्ली गठन PDMS की झरझरा प्रकृति के कारण सॉल्वैंट्स की निकासी के द्वारा मदद की थी, और समय झिल्ली गठन के लिए आवश्यक सफलतापूर्वक इस अध्ययन में नियंत्रित किया गया था। इस प्रणाली में, के रूप में लिपिड समाधान PDMS पतली फिल्म में समाहित किया गया था, एक सुसंगत झिल्ली गठन के समय हासिल की थी। इसके अलावा, झिल्ली जीवन भर PDMS पतली फिल्म, लिपिड समाधान करने के लिए squalene के अलावा का एक परिणाम में सॉल्वैंट्स की धीमी गति से अवशोषण के कारण लंबे समय तक किया गया था। हम सत्यापित करने के लिए है कि इस तकनीक का उपयोग का गठन झिल्ली मैं के लिए उपयुक्त हैं ऑप्टिकल और बिजली के माप का आयोजनचैनलों पढ़ाई पर।

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Protocol

1. समाधान तैयार

  1. बफर समाधान की तैयारी:
    1. बफर समाधान तैयार, 1 एम KCl (पोटेशियम क्लोराइड), 10 मिमी Tris एचसीएल (Tris-हाइड्रोक्लोराइड), और आसुत जल में 1 मिमी EDTA (ethylenediaminetetraacetic एसिड) को भंग करने और 8.0 पीएच को समायोजित करने के लिए।
    2. समाधान के लिए एक 0.20 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर। बाँझ करने के लिए, 15 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर समाधान आटोक्लेव।
  2. पूर्व चित्रकला के लिए लिपिड समाधान की तैयारी:
    1. पूर्व चित्रकला के लिए लिपिड समाधान तैयार करने के लिए, DPhPC (1,2-diphytanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphatidylcholine) लिपिड (डब्ल्यू: वि) 3% भंग 2 का एक मिश्रण में: 8 N -decane और hexadecane (वी: v)। रात भर हलचल एक रोटेटर का उपयोग कर।
  3. झिल्ली गठन के लिए लिपिड समाधान की तैयारी:
    1. झिल्ली गठन के लिए लिपिड समाधान तैयार करने के लिए, 0.1% DPhPC (1, 2-diphytanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphatidylcholine) लिपिड भंग (डब्ल्यू: वि) 2 का एक मिश्रण में: 8 वर्गualene और hexadecane (v: वि)। रात भर हलचल एक रोटेटर का उपयोग कर।

2. एक PDMS पतला फिल्म के गठन

  1. एक मिश्रण का कप में 1 (डब्ल्यू / डब्ल्यू) अनुपात PDMS prepolymer के लिए फार्म: एक 9 में PDMS और इलाज एजेंट मिलाएं। PDMS prepolymer के 5 ग्राम एक पेट्री डिश में जोड़े PDMS पतली फिल्म (मोटाई 200 - 250 माइक्रोन) के रूप में। 10 सेकंड के लिए 800 rpm पर एक स्पिन coater का उपयोग कर एक पतली फिल्म बनाने के लिए बिखरा पूर्व बहुलक PDMS।
  2. 2 घंटे के लिए 100 mTorr के दबाव में एक निर्वात desiccator में पेट्री डिश की जगह हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए। 70 डिग्री सेल्सियस पर 5 घंटे के लिए एक ओवन में पूर्व बहुलक पतली फिल्म, सेंकना भाजन करने के लिए।
  3. आदेश में एक वर्ग PDMS पतली फिल्म बनाने के लिए, में 2 एक्स 2 सेमी 2 चौकों polymerized PDMS पतली फिल्म से काट दिया। PDMS पतली फिल्म के केंद्र में एक छेद बनाने के लिए एक 500 माइक्रोन सूक्ष्म पंच का प्रयोग करें। 8 एन decane और hexadecane: 3% DPhPC लिपिड समाधान 2 में मिश्रित के साथ प्री-रंग छिद्र।

3. चैंबर निर्माण और Assembly

  1. BLM चैम्बर बनाना, 4 सेमी x 1.5 सेमी एक्स 1 सेमी और 1.5 सेमी x 1.3 सेमी x 0.8 सेमी 17 के भीतरी अच्छी तरह आयामों के बाहरी आयामों के साथ 3 डी ड्राइंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर चैम्बर के डिजाइन दो सममित ब्लॉकों।
  2. चैम्बर एक सीएनसी मशीन के साथ एक PTFE ब्लॉक का उपयोग शिल्प और निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

4. कक्ष विधानसभा

  1. चैम्बर को इकट्ठा करने के लिए, दो PTFE ब्लॉकों के बीच पूर्व चित्रित-PDMS पतली फिल्म जगह ऐसी है कि PDMS पतली फिल्म पर एपर्चर कक्ष में छेद के साथ गठबंधन किया है।
  2. चैम्बर तेल के साथ एक कवर कांच (ऑप्टिकल अवलोकन सुविधा के लिए) का उपयोग कर के बाहरी किनारों को सील। इकट्ठे चैम्बर नट और बोल्ट का उपयोग कर स्थिर।
    नोट: सुनिश्चित करें कि चैम्बर अच्छी तरह से सील किया जाता है ताकि कोई तरल रिसाव है।

शीघ्र आत्म विधानसभा गठन के साथ झिल्ली अग्रदूत के 5. गठन (MPES)

  1. एक पिपेट का उपयोग करना, जमा 0.58 N -decane: 0.1% DPhPC लिपिड में 2 मिश्रित की μl PDMS पतली चैम्बर के साथ इकट्ठे फिल्म के एपर्चर पर hexadecane।
  2. , का उपयोग एक फ्रीजर या 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे एक रेफ्रिजरेटर में चैम्बर स्टोर करने के लिए पहले।

6. झिल्ली गठन और सत्यापन

  1. MPES के साथ एक BLM फार्म करने के लिए, रेफ्रिजरेटर से चैम्बर वापस लेने और चैम्बर के प्रत्येक पक्ष में बफर समाधान के 2 मिलीलीटर निलंबित। <10 मिनट के लिए अलग कक्ष सेट तक जमे हुए झिल्ली अग्रदूत thaws।
  2. एक micromanipulator पर चैम्बर जगह ठीक प्रकाश स्रोत और माइक्रोस्कोप के संबंध में ऊंचाई को नियंत्रित करने के। एक हैलोजन फाइबर ऑप्टिक प्रकाशक का उपयोग कर PDMS BLM गठन की प्रक्रिया की निगरानी के लिए ऑप्टिकल पतली फिल्म के एपर्चर रोशन करने के लिए एक प्रकाश स्रोत के रूप में चैम्बर के एक तरफ रोशन।
  3. दूसरी ओर, प्रकाश स्रोत के संबंध में खड़ी एक डिजिटल माइक्रोस्कोप जगह BLM गठन का पालन करने के लिए (20 से बढ़ाना0 x)।
  4. BLM गठन की पुष्टि, एपर्चर जहां रंग वलय की तुलना में उज्जवल हो जाता है की केंद्र निरीक्षण करते हैं।

7. बिजली रिकॉर्डिंग

  1. बिजली के माप के लिए,> 1 मिनट के लिए एक 208 माइक्रोन मोटी चांदी के तार और सोडियम हाइपोक्लोराइट में ब्लीच का उपयोग एजी / सीएल इलेक्ट्रोड तैयार करते हैं। एजी / सीएल इलेक्ट्रोड चैम्बर काफी गहरे तक के प्रत्येक पक्ष में रखें बफर समाधान में डूबा जा सके।
  2. microelectrode एम्पलीफायर के लिए इलेक्ट्रोड कनेक्ट करें। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, एक वर्ग तरंग हासिल करने के लिए झिल्ली भर में एक ± 10 एम वी त्रिकोणीय तरंग लागू होते हैं। तीर V_clamp (एम वी) पर संकेत क्लिक करके वोल्टेज लगाने सेट करें।
  3. रिकॉर्ड बटन (लाल डॉट आइकन) पर क्लिक करके रिकॉर्ड झिल्ली के बिजली के गुणों। रिकॉर्डिंग के साथ आगे बढ़ें जब तक एक समान वर्ग तरंग मनाया जाता है। काले वर्ग आइकन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग से बाहर निकलें।

8. आयन चैनल निगमन

नहींई: Gramicidin एक (गा) समावेश के रूप में गा लिपिड समाधान के लिए सीधे जोड़ा जाता है, BLM के गठन पर सहज होता है।

  1. गा चैनल गतिविधियों का निरीक्षण करने के लिए, झिल्ली के संभावित पकड़े मापने के लिए 5 किलो हर्ट्ज का एक नमूना दर पर झिल्ली भर में 100 एम वी लागू होते हैं। तीर V_clamp (एम वी) पर संकेत क्लिक करके वोल्टेज लगाने सेट करें।
  2. रिकॉर्ड बटन (लाल डॉट आइकन) पर क्लिक करके रिकॉर्ड गा समावेश के बिजली के गुणों। रिकॉर्डिंग के लिए आगे बढ़ें तक मौजूदा कूदता मनाया जाता है। काले वर्ग आइकन पर क्लिक करके रिकॉर्डिंग से बाहर निकलें।
  3. बिजली के डाटा अधिग्रहण के बाद, एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 100 हर्ट्ज पर एक कम पास फिल्टर के साथ बेसल डेटा फ़िल्टर।
  4. (0.15 एन एस प्रत्येक वर्तमान कूद, ~, एक गा आयन चैनल का dimerization प्रतिनिधित्व करता है) छान संभावित डेटा पकड़ में वर्तमान कूदता का निरीक्षण गा समावेश सत्यापित करने के लिए।

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Representative Results

MPES समाधान रचना के अनुकूलन
लिपिड और सॉल्वैंट्स के विभिन्न रचनाओं को सफलतापूर्वक MPES से लिपिड bilayer झिल्ली पुनर्गठित करने के लिए परीक्षण किया गया। एन decane और hexadecane 3% से युक्त DPhPC 14 का एक मिश्रण के साथ सांसद प्रणाली झिल्ली गठन (~ 27%) की एक कम सफलता दर का प्रदर्शन किया। इसके अलावा, जैसा PDMS फिल्म लगातार लिपिड समाधान निकाले, यह आवश्यक है एक अक्षुण्ण लिपिड bilayer झिल्ली बनाए रखने के लिए विलायक रचना अनुकूलन करने के लिए किया गया था। इसलिए, स्क्वैलीन, जो सी 18 से 20 डिग्री पर 12 सी.पी. की चिपचिपाहट है एन decane के बजाय प्रयोग किया गया था, जो 20 डिग्री सेल्सियस। 19 में 0.92 सी.पी. की चिपचिपाहट है जब squalene इस्तेमाल किया गया था, दोनों स्थिरता और दीर्घायु एक की वजह से बढ़ PDMS द्वारा विलायक अवशोषण की दर कम हो गई। तालिका 1 पतले होने के बाहर समय, जीवन भर, और सफलता के विभिन्न विलायक रचनाओं के साथ झिल्ली की दर है।

जब एन decane इस्तेमाल किया गया था, झिल्ली गठन असंगत था और झिल्ली अक्सर PDMS पतली फिल्मों से विलायक का तेजी से अवशोषण के कारण, समय की एक छोटी अवधि के भीतर उठी। दूसरी ओर, जब squalene इस्तेमाल किया गया था, पर झिल्ली फटने के समय में देरी हुई। इसके अलावा, झिल्ली गठन के समय अधिक सुसंगत हो गया, झिल्ली गठन सुधार हुआ है, और झिल्ली की लंबी उम्र की सफलता की दर में वृद्धि हुई।

झिल्ली अग्रदूत से झिल्ली गठन (सांसद)
एक सांसद है कि कमरे के तापमान पर विगलन पर आसानी से प्रयोग करने योग्य हो जाता है लिपिड समाधान की जमी रूप है। लिपिड एक में एक छोटा सा छेद में एन decane और hexadecane का एक मिश्रण युक्त समाधान पतली फिल्म के नीचे जमा देता है 16 डिग्री सेल्सियस, और अनिश्चित काल के लिए संग्रहणीय और जमे हुए फार्म में परिवहनीय है PDMS। चित्रा 1 दिखाता है एक एक PTFE के साथ पतली फिल्म PDMS की विधानसभा चाएक सांसद के उत्पादन के लिए mber। उपयोग करने से पहले, PTFE झिल्ली चैम्बर गठन के लिए फ्रिज में से वापस ले लिया गया। इस के साथ साथ, PDMS पतली जमे हुए लिपिड समाधान युक्त फिल्म PTFE कक्षों के दो हिस्सों के बीच रखा गया था। बफर समाधान बाद में कमरे के तापमान पर चैम्बर के दोनों ओर करने के लिए जोड़ा गया था, लिपिड bilayer झिल्ली अनायास जमे हुए झिल्ली अग्रदूत (मध्य प्रदेश) के विगलन पर गठन किया था।

विगलन पर, लिपिड समाधान चित्रा 2 में वर्णित के रूप में बाहर thinned। जब जमी झिल्ली अग्रदूत thawed, बफर और लिपिड समाधान के बीच इंटरफेस के साथ दो monolayers संपर्क। में 20 लाया गया झिल्ली के गठन के बाद, गा monomers कि पूर्व मिश्रित थे लिपिड में समाधान चैनल गतिविधियों दिखाया।

झिल्ली के ऑप्टिकल अवलोकन
आदेश ऑप्टिकली झिल्ली गठन को सत्यापित करने के लिए हमखेतों में प्रेषित प्रकाश झिल्ली कल्पना करने के लिए। झिल्ली गठन करने पर, झिल्ली thinning-बाहर प्रक्रिया की वजह से वातावरण की तुलना में उज्जवल दिखाई दिया, और एपर्चर (झिल्ली गठन का स्थान) के केंद्र वलय से चमक रहा था। चित्रा 3 झिल्ली गठन डिजिटल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मनाया पता चलता है। झिल्ली सफलतापूर्वक विगलन पर पतला-out।

एक लिपिड bilayer के बिजली के माप
हम झिल्ली मोटाई की गणना करने के लिए एक एम्पलीफायर का उपयोग कर झिल्ली भर विद्युत धाराओं मापा। एजी / AgCl इलेक्ट्रोड बिजली के माप के लिए दोनों कक्षों में डूबे हुए थे। 10 एम वी चोटी से पीक त्रिकोण की लहर झिल्ली भर में लागू किया गया था, त्रिकोण की लहर एक परिणाम के रूप में लिपिड bilayer झिल्ली (एक संधारित्र के रूप में अभिनय) की विशेषता के कारण वर्तमान का एक वर्ग तरंग को परिवर्तित कर दिया गया। 21, हम थे झिल्ली की मोटाई का अनुमान करने में सक्षमनिम्न समीकरण का उपयोग:

Equation1

जहां मैं (टी) विद्युत धारा का प्रतिनिधित्व करता है और सी झिल्ली भर में समाई का प्रतिनिधित्व करता है। वी एप्लाइड चोटी से पीक वोल्टेज (0.0625 सेकंड के लिए 20 एम वी) का प्रतिनिधित्व करता है। इस के साथ साथ, सी, के साथ व्यक्त किया जा सकता मुक्त अंतरिक्ष (8.85 x 10 12 एफ / 2 मीटर), लिपिड की निरंतर ढांकता हुआ (2.1), 22 ए, झिल्ली के क्षेत्र (~ 1.29 x 10 -7 मीटर के permittivity 2), और डी, bilayer की मोटाई। चित्रा 3 और बिजली के डेटा में ऑप्टिकल डेटा के साथ, हम झिल्ली की मोटाई गणना ~ 4 एनएम होने के लिए। इसके अलावा, पुनर्गठन झिल्ली एक giga ओम स्तर मुहर (> 1 GΩ) है, जो आम तौर पर आयन चैनल के अध्ययन के लिए आवश्यक है से संतुष्ट हैं। 23

Gramicidin ए के आयन चैनल गतिविधियां (गा)
लिपिड bilayer सांसद से गठन के साथ आयन चैनल स्क्रीनिंग की व्यवहार्यता को सत्यापित करने के लिए, हम गा, झिल्ली के गठन की पुष्टि करने के लिए सबसे अक्सर इस्तेमाल किया आयन चैनलों में से एक में शामिल किया। दो अलग-अलग यूनिटों के रूप में झिल्ली है कि बाद में dimerize में Gramicidin एक को शामिल किया गया। 7 आयन चैनल के रूप गा के dimerization पर, और आयनों गा आयन चैनल के माध्यम से तर। चित्रा 4 समावेश और गा के dimerization को दिखाता है। गा dimerization पर, गा चैनल प्रवाहकत्त्व का स्तर 28 पीएस, पिछली रिपोर्टों के परिणामों के साथ संगत कर रहे थे। 3

लिपिड एकाग्रता विलायक Thinning-आउट समय (मिनट) लाइफटाइम (न्यूनतम) सफलता दर
0.1% 2: 8
squalene: hexadecane 		50.6 (± 30.9) 52.4 (± 30.9) 77.8%
0.1% 2: 8
n -decane: hexadecane 		13.2 (± 12.3) 10.8 (± 7.8) 75.2%
1% 2: 8
n -decane: hexadecane 		15.8 (± 8.8) 26.2 (± 25.3) 69.3%
1% 2: 8
n -decane: hexadecane 		13.8 (± 13.3) 23.6 (± 30.1) 55.6%
1% 2: 8
n -decane: hexadecane 		13.6 (± 10.3) 8.9 (± 3.0) 50.0%

तालिका 1 MPES समाधान संरचना का अनुकूलन। लिपिड समाधान के 0.5 μl एक PDMS पतली फिल्म एपर्चर (500 माइक्रोन व्यास) पर निलंबित कर दिया गया था। यहाँ, हम लिपिड एकाग्रता, विलायक की रचना, और पूर्व चित्रकला विविध। 17। रयु, एच एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित। 7

आकृति 1
चित्रा 1. झिल्ली गठन प्रणाली के योजनाबद्ध आरेख। चैम्बर के प्रत्येक हिस्सों के बाहरी आयाम 4 सेमी x 1.5 सेमी एक्स 1 सेमी था, और भीतरी अच्छी तरह के आकार 1.5 सेमी x 1.3 सेमी x 0.8 सेमी था। भीतरी अच्छी तरह से काफी बड़े बफर समाधान के 2 मिलीलीटर समायोजित करने के लिए किया गया था। प्रत्येक PTFE ब्लॉक पर वहाँ बफर समाधान के साथ PDMS पतली फिल्म संपर्क किया है छेद थे। दूसरी तरफ BLM के ऑप्टिकल अवलोकन के लिए एक गिलास को कवर के साथ बंद हुआ था। अंत में, चैम्बर ब्लॉकों बोल्ट और पागल तरल रिसाव से बचने के साथ मजबूत बनाया गया था।4258 / 54258fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
शीघ्र आत्म विधानसभा (MPES) गठन। PDMS पतली फिल्म एपर्चर एक अनिश्चित अवधि के लिए जमा किया जा सकता है पर लिपिड समाधान के साथ जमे हुए झिल्ली अग्रदूत के चित्रा 2. योजनाबद्ध आरेख। जमे हुए झिल्ली अग्रदूत पिघलना करने के लिए कमरे के तापमान में लाया गया था, लिपिड bilayer गठन PDMS पतली फिल्म में हाइड्रोफोबिक विलायक की निकासी के कारण मदद की है। के रूप में गा monomers सीधे लिपिड समाधान में जोड़ा गया था, गा आयन झिल्ली गठन के बाद तुरंत गठन चैनलों। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन = "/ Files / ftp_upload / 54258 / 54258fig3.jpg" />
चित्रा 3. thinning-बाहर की प्रक्रिया के सूक्ष्म आरेख। MPES और हाइड्रोफोबिक सॉल्वैंट्स के बाद के अवशोषण की विगलन पर, पतले होने से बाहर प्रक्रिया PDMS पतली फिल्म के एपर्चर पर मदद की थी, और झिल्ली विगलन के बाद दो मिनट के भीतर का गठन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. gramicidin ए वर्तमान के समावेश पर विद्युत माप पर समावेश और गा के dimerization झिल्ली में दिखाया गया है कूदता है। की ~ 28 PS एक आयाम (100 एम वी संभावित पकड़े, 100 हर्ट्ज बेसल कम पास फिल्टर) गा monomers के dimerization पर मनाया गया।rget = "_blank"> कृपया यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9333 For buffer solution
Tris-hydrochloride Sigma-Aldrich 1185-53-1 For buffer solution
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 60-00-4 For buffer solution
n-decane Sigma-Aldrich 44074-U For lipid solution
Hexadecane Sigma-Aldrich 544-76-3 For lipid solution
Squalene Sigma-Aldrich S3626 For lipid solution
Gramicidin A Sigma-Aldrich 11029-61-1 Membrane protein
1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids, Inc. 850356 For membrae formation
Sylgard 184a and 184b elastromer kit Dow Corning Asia To produce PDMS thin film
0.2 μm filter Satorius stedim 16534----------K To filter buffer solution
Rotator FinePCR AG To dissolve lipid homogeneously
Autoclave Biofree BF-60AC To sterilize buffer solution
Spin coater Shinu Mst SP-60P To spread PDMS prepolymer
Vaccum dessiccator Welch 2042-22 To remove air bubble in PDMS prepolymer
500 μm  punch Harris Uni-Core 0.5 To create an aperture on the PDMS thin film
CNC machine SME trading SME 2518 To fabricate membrane formation chamber
Halogen fiber optic illuminator Motic MLC-150C To illuminate the aperture of PDMS thin film for optical observation
Digital microscope Digital blue QX-5 To optically observe lipid bilayer membrane formation
Electrode A-M Systems To electrically observe membrane formation
Microelectrode amplifier (Axopatch amplifier) Axon Instruments Axopatch 200B Amplifier To measure capacitance of the membrane (described as microelectrode amplifier in the manuscript)

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References

  1. Hanke, W., Schulue, W. Planar lipid bilayers: methods and applications. , Academic Press. (2012).
  2. Mirzabekov, T. A., Silberstein, A. Y., Kagan, B. L. Use of planar lipid bilayer membranes for rapid screening of membrane active compounds. Methods Enzymol. 294, 661-674 (1999).
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  4. Fang, Y., Lahiri, J., Picard, L. G protein-coupled receptor microarrays for drug discovery. Drug. Discov. Today. 8 (16), 755-761 (2003).
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स्वचालित लिपिड bilayer झिल्ली गठन के एक Polydimethylsiloxane पतला फिल्म का उपयोग
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Choi, S., Yoon, S., Ryu, H., Kim, S. M., Jeon, T. J. Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film. J. Vis. Exp. (113), e54258, doi:10.3791/54258 (2016).

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