Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

Zusammenfassung

Protokolle für die Kultur humaner Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die transiente Transfektion von fluoreszenzmarkierten Markern des Mikrotubuli-Wachstums, die Bildgebung lebender Zellen und die automatisierte Analyse der Wachstumsdynamik von Mikrotubuli zwischen den Phasen werden detailliert beschrieben.

Zusammenfassung

Der physiologische Prozess, durch den sich aus bestehenden Gefäßen neue Gefäße bilden, erfordert spezifische Signalereignisse, die morphologische Veränderungen innerhalb einzelner Endothelzellen (ECs) auslösen. Diese Prozesse sind entscheidend für die homöostatische Erhaltung, wie z. B. die Wundheilung, und sind auch entscheidend für die Förderung des Tumorwachstums und der Metastasierung. Die EC-Morphologie wird durch die Organisation des Zytoskeletts definiert, ein streng reguliertes System der Aktin- und Mikrotubuli (MT)-Dynamik, von dem bekannt ist, dass es die EC-Verzweigung, Polarität und Richtungsmigration, wesentliche Bestandteile der Angiogenese, steuert. Um die Dynamik der MT zu untersuchen, verwendeten wir hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit einer computergestützten Bildanalyse von fluoreszenzmarkierten MT-Plus-Enden, um die Dynamik des MT-Wachstums und die Regulation der EC-Verzweigungsmorphologie und der Richtungsmigration zu untersuchen. Eine Zeitraffer-Bildgebung von lebenden humanen Nabelvenendothelzellen (HUVECs) wurde nach der Transfektion mit fluoreszenzmarkierten MT End Binding Protein 3 (EB3) und Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-spezifischen cDNA-Konstrukten durchgeführt, um die Auswirkungen auf die MT-Dynamik zu bewerten. Die PlusTipTracker-Software wurde verwendet, um EB3-markierte MT plus-Enden zu verfolgen, um die MÜ-Wachstumsgeschwindigkeiten und die Lebensdauer des MT-Wachstums in Zeitrafferbildern zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der MT-Dynamik und die Identifizierung, wie eine lokalisierte Regulation der MT-Dynamik in subzellulären Regionen zu den angiogenen Prozessen der EC-Verzweigung und -Migration beiträgt.

Einleitung

Die Angiogenese wird durch extrazelluläre Signal Cues ausgelöst, die Endothelzellen (ECs) fördern zu polarisieren, wandern mit Richtungs Spezifität und neue Gefäße in Gewebe bilden, die Blutversorgung. Dazu tragen gedacht, um die Angiogenese fahren sind Signale von der extrazellulären Matrix (ECM). Als Reaktion auf körperliche Signale erstrecken ECs neue Zweige mit Richtungsspezifität Richtungsbewegung in die Bildung des vaskulären Netzwerks ^1,2 zu führen. Die Architektur der EG - Morphologie und Verzweigung wird durch lokale Regelung der Mikrotubuli (MT) Zytoskelett in einer Weise definiert , die mit der Regulierung von ACTO-Myosin Kontraktilität ³ koordiniert wird. Damit Zweige EG, Myosin-II lokal herunter reguliert werden müssen , zu bilden, was zu einer lokalisierten Membranausstülpungen ^4. Zur gleichen Zeit und am gleichen Ort innerhalb der Zelle geworden MT Wachstumsdynamik verändert in langsame und anhaltende MT Wachstum resultierende Zweig elon zu fördernsuchung und Stabilität ^5. Diese koordinierte Zytoskelett-Regelung erlaubt ECs ihre Morphologie zu polarisieren gerichtete Migration zu erleichtern.

Die Entwicklung eines polarisierten Zellmorphologie erfordert polarisiertem MT Anordnung ^6. In der Migration Epithelzellen wachsen MTs langsam und beharrlich speziell an der Vorderkante der Zelle ^7-9; während in Neuronen erfordert die Initiierung und Dehnung von Axonen und Dendriten , dass MTs nicht nur vorhanden sind, sondern dass sie durchlaufen dynamisch die Prozesse der Montage und Demontage ^10-15. Auf diese Weise lokalisierte Steuerung der Wachstumsdynamik MT bestimmt die Architektur der Zelle und ermöglicht eine schnelle Remodellierung der Zellmorphologie als ECs durch ihre ECM navigieren.

MT Wachstumsdynamik von Familien von molekularen Motorproteinen und nicht-Motorproteine ​​reguliert werden, sogenannte Mikrotubuli assoziierte Proteine ​​oder Mikrotubuli interagierender Proteine ​​(von nun an RefeRred als MAPs). MAPs kann vor Ort aktiviert oder inaktiviert werden, in der Regel durch Signalkaskaden an der Zell-ECM - Schnittstelle ^16,17 initiiert. Sobald er aktiv ist, MAPs Funktion zum MT durch die Bindung und die Kinetik der MT Montage und Demontage zu verändern; dadurch funktioniert lokal MT Dynamik regeln , um ^{18 bis 20} Zellform und Polarität zu fördern. Mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) ist ein Kinesin-13 Familie MAP , die ^21-23 MT Demontage MT Enden und Paare ATP - Hydrolyse bindet. Diese funktionelle Rolle von MCAK ist bekannt in der mitotischen Spindel ^24-28 kritisch zu sein, wie auch während der Inter ^29,30. Innerhalb der Interphase ECs wird MCAK-vermittelte MT Demontage durch lokalisierte Aurora-A induzierte Phosphorylierung von MCAK als Reaktion auf Wundrand induzierte Aktivierung des Rac1 kleine GTPase geregelt. Das Ergebnis dieser Signalkaskade ist die Hemmung der MCAK an der Vorderkante von ECs, was zu polarisiertem MT Wachstum in Richtung leading Rand und MCAK-induzierte MT Demontage an der Hinterkante von ³¹ ECs migrieren.

Traditionelle Methoden zur MT Wachstumsdynamik Messung haben typischerweise Handverfolgung entweder fluoreszierend markierten Tubulin oder, in jüngerer Zeit, fluoreszenzmarkierte MT End binding protein 1 oder 3 (EB1 oder EB3, respectively) verwendet. Der fluoreszierende Tubulin Ansatz hat den Vorteil, dass der gesamte MT Array Beschriftung. Da jedoch die meisten mitotischen Zelltypen eine radiale Anordnung von MTs während der Inter ^8,32,33, MTs in der Nähe der Zentrosomen halten sind sehr dicht, und als Ergebnis, MT Wachstum und Abbau mit fluoreszierenden Tubulin Tracking ist in der Regel auf die Umfangs begrenzt Regionen der Zelle. Aufgrund dieser Einschränkungen, die Verwendung von fluoreszenzmarkierten EB-Proteine ​​(EB1 oder EB3) die häufigere Ansatz MT Dynamik zu messen war. Denn nur EBs die wachsenden Plus-Enden von MTs beschriften, erscheinen sie als kleine (1-3 & mgr; m), hell fluoreszierende komments, also mit sehr begrenzten Hintergrundfluoreszenz ^34-37 eine leicht unterscheidbare Marker der MT Polymerisation bereitstellt. Während die Tatsache, dass nur EBs Etikett eine Teilmenge des MT-Array eine große Stärke des Ansatzes EB darstellt, auch sie eine wichtige Einschränkung betont werden, dass nicht wachsenden MTs nicht vom EB3 Ansatz gekennzeichnet. Dennoch ist die Fähigkeit zu messen und EB3 Kometen im Laufe der Zeit zu verfolgen und MT Wachstum innerhalb subzellulärer Regionen zu visualisieren machen diesen Ansatz ideal für Anwendungen, die regionale Auswertung der MT Organisation erfordern.

Eine andere kritische Einschränkung der herkömmlichen Methoden zur Messung MT Wachstumsdynamik hat sehr große Datenmengen, und die Zeit für die Datenanalyse erforderlich. Diese Einschränkung ergibt sich aus der Notwendigkeit, das Handtracking von Hunderten von EB Kometen mit hoher Zeitauflösung. Darüber hinaus müssen diese Messungen in einer statistisch signifikanten Anzahl von Zellen und auch unter einer Vielzahl von Steuer- und Experime durchgeführt durchgeführt werdenntal Bedingungen. Vor kurzem haben diese Einschränkungen durch rechnerische Analysetechniken überwinden speziell bei Tracking EB3 Kometen mit Zeitraffer-Mikroskopie in lebenden Zellen ³⁵ gerichtet. Bei richtiger Anwendung dient diese Rechenansatz sowohl das Potential für menschliche Fehler, die mit der Hand-tracking zusätzlich zur Bereitstellung eines Hochdurchsatzverfahren zur Messung der MT Polymerisation beschränken. Rechnerische Analyse von MT Dynamik der MATLAB-basierten Software - Paket, plusTipTracker, ermöglicht Messungen von MT Wachstum von fluoreszenzmarkierten EB3 Kometen ^5,31,35,38 Tracking. Zusätzlich ermöglicht plusTipTracker Software zur Berechnung von Katastrophenereignisse MT (aka Demontage) , basierend auf dem Verschwinden des EB3 Kometen in einem wachsenden MT Spur und ermöglicht subzellulären (aka regional) Analyse der MT Wachstumsdynamik innerhalb benutzerdefinierten interessierenden Bereiche . Für unsere Studien wurden MT Wachstumsdynamik im Vergleich innerhalbverzweigte Regionen im Vergleich zu nicht-verzweigte Regionen oder im Vergleich zu Hinterzellkanten innerhalb führt. Datenausgabe von plusTipTracker Software kann auch farbcodierte Spur Overlays für einzelne Zellen verwendet werden und subzellulären Regionen zu generieren.

Hier beschreiben wir die Methode, nach der die Rolle der MCAK untersuchen bei der Modulation der Dynamik MT Wachstum und den Beitrag dieses MT Depolymeraseaktivität zur Regulierung der EG-Morphologie und gerichtete Migration Verzweigung. Unser Ansatz verwendet, um einen primären humanen Zelllinie, menschliche Endothelzellen aus der Nabelvene (HUVECs), die leicht kultiviert werden und sehr zugänglich für die Elektroporation-induzierte, transiente Transfektion von Plasmid-cDNA. Wir haben dann verwendet hochauflösende, Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie von HUVECs mit MT End transfizierten Protein Binding 3 (EB3) und mitotischen Zentromer Assoziierte Kinesin (MCAK) -spezifischen cDNA-Konstrukte Auswirkungen auf MT Dynamik zu bewerten HUVECs transfiziert. PlusTipTracker-basierte Rechenbildanalyse von EB3-markierten MT Plusenden war MT Wachstumsgeschwindigkeiten und MT Wachstum Lebensdauer im Zeitraffer Bilder, zu messen und zu vergleichen Effekte der experimentellen Manipulationen auf MT Wachstumsdynamik zu messen. Diese Methodik ermöglicht die Untersuchung der Dynamik MT und der Identifizierung, wie lokalisierte Regulierung der MT Dynamik innerhalb subzellulären Regionen trägt zu den angiogenen Prozessen der EC Verzweigung und Migration. Diese Techniken sind für Untersuchungen von jeder Karte, die fluoreszenzmarkierten und ausgedrückt in lebenden Zellen werden kann.

Protokoll

1. HUVEC Kultur und Wartung

1. Bereiten komplette endothelialen Basalmedium, indem der gesamte Inhalt des endothelialen Zellwachstumsmedium Ergänzung Paket und 5% Penicillin / Streptomycin antibiotische Mischung rot frei endothelialen Basalmedium zu Phenol (siehe Materialien / Ausrüstungsliste für weitere Details). Warm vollständige endotheliale Basalmedium bis 37 ° C in einem Wasserbad.
2. Entfernen einer HUVEC Kryoröhrchen aus flüssigem Stickstoff und Auftauen Lager rasch in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min. Wenn ~ 80-90% aufgetaut, 500 & mgr; l erwärmt vollständigen endothelialen Basalmedium zur Cryovial, mischen durch Pipettieren und Zellen verzichtet werden gleichmäßig in eine 100 mm Kulturschale aus Kunststoff Gewebe 15 ml erwärmt vollständigen endothelialen Basalmedium enthält.
3. Ortszellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO _2. Lassen Sie Zellen über Nacht anhaften. entfernen oder die Zellkulturmedium nicht zu ändern.
4. Wenn der 100-mm-Schale ist> 90% konfluent, übertragen HUVECs inin einer 75 cm ² Gewebekultur behandelt Kolben und halten bei> 60% Konfluenz zu allen Zeiten (siehe Schritt 1.5).
   Hinweis: Wenn bei einer Dichte von> 60% gehalten wird, HUVEC Verdopplungszeit konsequent 18-20 h ist.
   1. Für Situationen , in denen Passagierung der Zellen nicht erforderlich ist (dh die Dichte <90%), absaugen , das Medium und ersetzen mit frischen kompletten endothelialen Basalmedium alle 48 Stunden.
5. Wenn HUVECs erreichen> 90% Konfluenz, Spülen 2 mal mit 10 ml 1x PBS und anschließend die Zellen von der Gewebekulturschale entfernen, indem sie 1,5 ml von 0,25% Trypsin für 1-2 Minuten bei 37 ° C behandelt wird. Hinweis: Viability von HUVECs stark durch die Verlängerung der Länge von Trypsin Exposition reduziert wird.
6. Rettungs Zellen durch Zugabe von 8,5 ml kompletten endothelialen Basalmedium zur Trypsin / HUVEC-Gemisch in einem Verhältnis von 4: 1 endothelial Basalmedien vollständig: Trypsin (minimal-Verhältnis), und in einem 15 ml konischen Röhrchen sammeln.
7. Zentrifuge bei 1.400 × g für 4 min. Aspirierender Überstand.
8. Die Zellen in einen neuen 225 cm ² Gewebekulturflasche , die 25 ml des vollständigen endothelialen Basalmedium das Pellet in 2 ml komplettem endothelial Basalmedium und hinzuzufügen.

2. Coverslip Vorbereitung vor der HUVEC Kultur

1. Die Beschichtung mit Deckgläser Fibronektin Substrate.
   1. Bereiten Sie blitzsaubere 22 mm No. 1.5 Deck ³⁹ und Lagerung bei Raumtemperatur (RT) in 100% Ethanol.
   2. Verwenden Sie einen Bunsenbrenner ein Deckglas Flamme und legen Sie sie in eine 35 mm Petrischale mit einer Pinzette.
   3. Bereiten Sie eine Fibronektin / PBS Mischung von 10 ul von Fibronektin Lager Mischen (1 mg / ml) mit 990 ul PBS.
   4. Pipette 250 ul der Fibronektin / PBS Mischung auf das Deckglas in der 35-mm-Schale. Gleichmäßig verteilt die Oberfläche des Deckglases zu decken.
   5. Inkubiere die Schale für mindestens 3 Stunden bei 37 ° C und spülen 3 mal mit 2 ml 1x PBS vor der Verwendung.
2. Beschichtung mit Deckgläser Polyacrylamid (PA) Substrate.
   1. Coverslip Aktivierung
      1. Legen Sie eine 22 mm No. 1.5 Deckglas in 50% 3-aminopropyltrimethyloxysilane 10 Minuten lang auf einer Rührplatte. Nach der Inkubation, Waschen 10 mal für 2 min jeweils in doppelt destilliertem H ₂ O (ddH ₂ O).
      2. Inkubieren Sie die Deck in 0,5% Glutaraldehyd für 30 min auf einer Rührplatte. Nach der Inkubation waschen 10 - mal für 2 min in ddH ₂ O.
   2. Polyacrylamide Vorbereitung
      1. Vorbereiten eines PA - Gel mit einer Nachgiebigkeit von 0,7 Kilopascal (kPa) durch Zugabe von 3,75 ml 40% Acrylamid, 0,3 ml von 2% bis-acrylamid und 0,95 ml ddH ₂ O.
      2. Eine 10% ige Arbeits Lösung von Ammoniumpersulfat (APS) und speichern auf Eis bis zum Gebrauch.
      3. Zur Herstellung der PA - Lösung für 1 Deckglas (Gesamtvolumen = 166,7 & mgr; l), fügen 0,83 & mgr; l ddH ₂ O, 41,7 & mgr; l des bis-acrylamid - Lösung, 124 & mgr; l 10% APS (in Schritt 2.2.2.1 gemacht), und0,25 & mgr; l TEMED.
      4. Unmittelbar 15 ul PA-Lösung auf eine hydrophobe Glasobjektträger pipettieren (siehe Reagenzien List) und die Abdeckung mit einem aktivierten 22 mm No. 1.5 Deck. Lassen Sie die PA für 20 min bei RT zu polymerisieren.
      5. Entfernen Sie das Deckglas und übertragen auf eine 35-mm-Schale. Wasche 3mal mit 2 ml 1x PBS. Bewahren Sie für <2 Wochen bei 4 ° C.
      6. Um Fibronektin auf das Polyacrylamidgel binden, setzen die Polyacrylamid-beschichtete Deckgläser bis 2 mM sulfo-SANPAH mit 7500 J von UV-Licht (254 nm). Spülen Sie einmal mit ddH ₂ O.
      7. Bereiten Sie eine Fibronektin / PBS Mischung von 10 ul von Fibronektin Lager Mischen (1 mg / ml) mit 990 ul PBS.
      8. Pipette 250 ul der Fibronektin / PBS Mischung auf das Deckglas (s) in einer 35 mm Petrischale. Gleichmäßig verteilt die Oberfläche des Deckglases zu decken.
      9. Inkubiere die Schale für mindestens 3 Stunden bei 37 ° C und spülen 3 mal mit 2 ml 1x PBS vor der Verwendung.

class = "jove_title"> 3. cDNA Transfektion und HUVEC Kultur auf Coverslip

1. Führen Sie die Schritte 1,5-1,6.
2. Mit Hilfe einer Zählkammer, zählen die Zellzahl und sammeln ein Volumen enthält 100.000 Zellen / Deckglas (für Nicht-Migrationsversuche) oder 500.000 Zellen / Deckglas (für Migrationsversuche). Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1400 × g für 4 min.
   Hinweis: Migration-Protokoll ist im Abschnitt 9 unten.
3. Die Zellen, transfiziert mit 100 & mgr; l Elektroporationspuffer werden. Kombinieren Sie mit 1 ug cDNA aufnehmen und in Elektroporationsküvette. Elektroporation Zellen: DNA - Gemisch , das Programm bezeichnet für HUVEC Elektroporation (zB Programm #: A-034) verwendet wird .
4. Rescue-Zellen, die mit 500 ul kompletten endothelialen Basalmedium und Platten Zellen auf eine Fibronektin-beschichtete 22 mm No. 1.5 Deckglas (siehe Protokoll 2.1, oben). Inkubieren bei 37 ° C für 3-4 Stunden Zeit für die Expression von cDNA-Konstrukten zu ermöglichen.

le "> 4. Vorbereitung von Proben für Imaging

1. Schneiden doppelseitigem Klebeband in 2,5 cm x 0,65 cm Streifen.
2. Besorgen Sie sich einen sauberen Glasobjektträger. Nehmen Sie zwei Streifen doppelseitiges Klebeband und befestigen Sie sie horizontal entlang der oberen und unteren Rand der Folie. Hinweis: Es ist wichtig, eine kleine Menge an Raum zwischen dem Band und dem Schlitten Kante zum Abdichten der Kammer zu ermöglichen, wie in Schritt 4.5).
3. Mount Deckglas (aus Schritt 3.4; Zellseite nach unten), so daß zwei Kanten des Deckglases Rest auf dem Band. Verwenden einer Pinzette zu drücken Sie sanft das Deckglas zu sichern.
4. Mit Hilfe einer Mikropipette, dann werden 40 & mgr; l Abbildungsmedium (komplett endothelialen Basalmedium mit 25 uM HEPES ergänzt) zwischen dem Deckglas und Rutsche. Sicherzustellen, dass der Raum zwischen dem Deckglas und Objektträger vollständig mit Bilderzeugungsmedium gefüllt ist. Aspirat überschüssige Bilderzeugungsmedium (falls erforderlich).
5. Dichtung alle Kanten mit warmem VALAP (1: 1: 1 Vaseline: Lanolin: Paraffin). Prüfen Sie auf Leckagen durch gentl schiebeny auf dem Deckglas.
6. Platz montiert und versiegelt Deckglas auf vorgewärmten (37 ° C) Mikroskoptisch.

5. Mikroskopie

1. Mit Hilfe einer sich drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop mit einem 60x ausgestattet, 1,40 numerische Apertur (NA) Differentialinterferenzkontrast (DIC) -Ölimmersionsobjektiv Objektiv, ein automatisiertes Fokus Monitoring-System (PFS), elektronische Blende für Durchlichtbeleuchtung, ein X-und Y-motored Stufe Bandpassfilter in einem elektronischen Filterrad untergebracht, und eine monolithische Laser Kombinator-Modul, konzentrieren sich das Mikroskop an der Grenzfläche der Zelle / Deckglas und verwenden, um die Mikroskoptisch Joystick eine einzelne Zelle zu lokalisieren.
2. Klicken Sie auf die "Kamera-Einstellungen" in der Bild-Software-Programm. Im Rahmen der "Belichtungszeit" Drop-Down-Fenster des Panels Kameraeinstellungen, wählen Sie 400 ms.
   Hinweis: Die Belichtungszeiten können variieren und sollten empirisch ermittelt werden.
3. Klicken Sie auf das "ND Acquisition" Panel in derImage-Software-Programm. Innerhalb der Lambda (λ) Register des ND Acquisition-Panel, klicken Sie auf die Kontrollkästchen, um die 488 und 561 nm Laser auszuwählen. Im Register "Zeit" des ND Acquisition Panel, stellen Sie die Erfassungszeit auf 2 Sekunden und die Gesamtzeit bis 2 min.
4. Klicken Sie auf den "Run Now" -Button in der ND Acquisition Panel mit 2 min Zeitraffer-Bildfolge bei 2 sec Erfassungsintervallen unter Verwendung eines 400 ms Belichtungszeit zu erwerben, sowohl für die 488- und 561 nm Beleuchtung.
5. In der "Optical Config" Panel der Image-Software-Programm und mit den Kameraeinstellungen in Schritt 5.2 beschrieben, klicken Sie auf die 405 Laser-Taste nm und klicken Sie dann auf "Erfassen" ein einziges Bild des blauen fluoreszierenden Proteins zu erfassen (BFP) -markierten Proteine .
   Hinweis: Es ist generell ratsam Zellexposition (Häufigkeit der Bildaufnahme und / oder Belichtungszeit) bis 405 nm Laserbeleuchtung als dieser Wellenlänge zu begrenzen, können die Zellen im Laufe der Zeit beschädigt werden.
   1. Für MCAK-shRNA Studien eincquire ein einzelnes Bild 405 nm, die Expression des BFP-markiertem shRNA zu verifizieren.
6. In der "Optical Config" Panel der Image-Software-Programm und mit den Kameraeinstellungen in Schritt 5.2 beschrieben, klicken Sie auf die Schaltfläche DIC und klicken Sie dann auf "Acquire" ein einzelnes DIC Bild der Zelle zu erfassen für Morphologie Analyse Verzweigung (siehe Abschnitt 10 , unten).
7. Im Anschluss an die Bildaufnahme und nutzen die "Helligkeit / Kontrast" -Funktion in der Image-Software-Programm zu digital um das Bildsignal zu erhöhen.
8. Exportieren Sie die Helligkeit und den Kontrast bereinigten Bilder. Klicken Sie auf "Datei" und dann auf "Speichern unter" und anschließend auf ".tif" für die Bilddateityp auszuwählen.
   Hinweis: Dieser erzeugt typischerweise 61 .tif Bilddateien von einem einzigen 2 min Zeitraffer-Akquisition erfasst, wenn, wie in Schritt 5.4 beschrieben.

6. MT Dynamics Analysis

1. Für EB3 Tracking verwenden plusTipTracker Software ^35, eine Open-Source,Matlab-basierte Rechensoftwarepaket zur automatischen Erkennung entwickelt, Verfolgung, Analyse und Visualisierung von fluoreszenzmarkierten EBs.
2. plusTipGetTracks Graphical User Interface (GUI)
   1. Zum Zugriff auf die plusTipGetTracks GUI, Typ plusTipGetTracks.
   2. Für EB3 Komet Erkennung, verwenden Sie die GUI das übergeordnete Verzeichnis zu suchen und auszuwählen, die die .tif Bilder enthält.
   3. Innerhalb der Tracking-Parameter Panel des plusTipGetTracks GUI, geben Sie die folgenden Werte: Suchbereich Radius = 5-10; Mindestteilstreckenlänge = 3; Max Gap Länge (Frames) = 12; Max Schrumpfungsfaktor = 1,0; Maximaler Winkel vorwärts = 25; Maximaler Winkel rückwärts = 10; Fluktuations Radius (Pixel) = 2; Frame Rate (sec) = 2; Pixelgröße (um) = 110.
      Hinweis: Prüfen Sie zunächst die optimalen Tracking-Parameter mit Hilfe der plusTipParamSweepGUI auf einer repräsentativen Gruppe von .tif Bilddateien. Der Wert für die Pixelgröße eingegeben ist spezifisch für die Objektivlinse verwendet, um die Zeitraffer-Bild zu erfassen,s (siehe Schritte 5,1-5,2, oben).
   4. Für Region of Interest (ROI) Auswahl, erstellen binäre Masken der gesamten Zelle durch die Zelle manuell Kantenverfolgung der DIC Bild der Zelle mit einem Polygon zu bilden.
   5. Für Sub-Region of Interest (Sub-ROI) Auswahl, erstellen führenden und Kantenmasken Hinter durch manuell eine 2-Punkt-dicke Linie über die Wundrandzelle von Interesse unter Verwendung eines modifizierten plusTipTracker Unter ROI-Auswahl-Werkzeug zeichnen.
      Hinweis: Die Linie parallel zur Wundrand sollte auf die Position gezogen , wo die Zelle von Interesse erstreckt sich über ³¹ wund Rand benachbarten Zellen.
3. plusTipSeeTracks GUI
   1. Stellen Sie sicher, und visuell die Spur Overlays der .tif Bilder inspizieren in der "ROI" Ordner gespeichert, indem Sie auf den "Plot Tracks" in der Spur Overlays Spalte. Wiederholen Sie dies für alle Spur Overlays.
   2. Führen Sie die Datengruppierung durch die "Gruppen erstellen" in der optionalen Einstellungen Spalte klicken. Wählen Sie die Experimental Daten, die auf den Daten-Dateien durch einen Klick auf den gleichen Datenbestand gehören. Speichern Sie die Auswahl, indem sie die "Gruppe" einen Namen, der leicht identifiziert werden können (zum Beispiel "Kontrollgruppe").
   3. Für Sub-ROI MT Wachstumsdynamik Messungen, geben Sie die minimale Anzahl von Bildrahmen, die ein EB3 Komet Spur innerhalb des Unter ROI, um als "Spur" nachgewiesen werden muss zu qualifizieren und MT Wachstum Exkursionen innerhalb der Vorder- und Hinterkante ROI extrahieren nicht innerhalb der "Sub-ROIs" Panel der GUI auf "manuelle Auswahl" klicken.
      Hinweis: Verwenden Sie zum Beispiel 3 Bilder (6 sec) als die minimale Erkennungslänge als extrahiert werden "Spur". Heraus Tracks von Sub-ROIs werden innerhalb eines Teilprojektordner im ursprünglichen ROI Ordner für jede Zelle gespeichert.
   4. MT Wachstumsunterspur und Subpopulation Analyse
      1. Berechnen Sie die mittlere Wachstumsgeschwindigkeit MT und die mittlere Lebensdauer MT Wachstum für "Gruppe" Datensätze (siehe Schritt 6.3.2), für jeden ROI (siehe step 6.2.4) und für jeden Unter ROI (siehe Schritt 6.2.5).
   5. Im Quadrant Streudiagramme Spalte der plusTipSeeTracks GUI, klicken Sie auf "Gruppen auswählen" und klicken Sie auf die Gruppen (erstellt in Schritt 6.3.2) zu vergleichen.
      1. Wählen Sie "Wachstumsgeschwindigkeit" für die x-Achse Option und geben Sie den Mittelwert für Wachstumsgeschwindigkeit (aus Schritt 6.3.4) in die Box. Wählen Sie "Growth Lebenszeit" für die Y-Achse Option und geben Sie den Mittelwert für das Wachstum Lebensdauer (aus Schritt 6.3.4) in die Box.
   6. Markieren Sie das Kästchen neben "Entfernen Tracks am Anfang / Ende" und neben "Batch-Prozess auf Gruppen." Klicken Sie auf "Make Plots", um ein Verteilungsprofil für MT Wachstumsspuren für die ganze Zelle erzeugen, Vorderkanten und Hinterkanten Unter ROIs.
      Hinweis: Für die Studien hier beschrieben, werden die MT Wachstumsspuren in vier Subpopulationen verteilt: langsam und kurzlebig, langsam und langlebig, schnell und kurzlebig, und zwar schnell und langlebig.
   7. Kopieren Sie die Mittelwerte aus Schritt 6.3.4 in ein Tabellenkalkulationsprogramm und die Datei mit der Erweiterung .xls speichern.
      1. Klicken Sie auf "Data", dann klicken Sie auf "Data Analysis" aus dem Data Drop-Down-Fenster. Wählen Sie "t-Test: zwei Probe unter der Annahme gleicher Varianzen" zu vergleichen MT Wachstumsgeschwindigkeiten und MT Wachstum Lebensdauer bedeuten. Markieren Sie Datenzellen in der Tabelle, in die t-Test-Vergleiche in einem p-Wert führen <0,001.

7. Kolokalisationsanalyse

1. Für Untergrundsubtraktion, die "Zeilentool" der Imaging - Software - Programm, eine Region of Interest (ROI) ziehen auf dem Bildschirm , indem Sie auf eine quadratische Form zu schaffen , die 10 & mgr; m ² auf dem grünen Kanal Bild (488 nm Anregung) ist eine Position, wo es keine Zellfluoreszenz (Hintergrund). Wiederholen Sie diesen Vorgang für den roten Kanal Bild (561 nm Anregung) unter Verwendung der Bilder aus Schritt 5.8.
2. Unter Verwendung der Imaging-Software prJean-Pierre Gerber Rechtsklick auf den ROI aus Schritt 7.1 und wählen Sie "Als Hintergrund ROI setzen." Klicken Sie auf "Bild", dann klicken Sie auf "subtrahieren Hintergrund" aus dem Drop-Down-Fenster, um die durchschnittlichen Hintergrundwerte zu subtrahieren (aus Schritt 7.1) aus dem gesamten Image. Führen Sie Untergrundsubtraktion für Zellen co-exprimierenden Em-Aurora A und entweder mCherry-MCAK, Mapple-EB3 oder Mapple-Tubulin.
3. Im Hintergrund nur Rot-Kanal Bild subtrahiert wird, klicken Sie auf das Binary Band und wählen Sie "definieren Threshold" und wählen Sie dann die "pro Kanal" -Funktion den bezeichneten fluoreszierenden Marker auszuschließen.
   Hinweis: Die Schwellen Schritt wurde am durchgeführt entweder der mCherry-MCAK, Mapple-EB3 oder Mapple-Tubulin-Bild zu ermöglichen, Zeichnen von Linien, die spezifisch die schwellen Objekt für die Co-Lokalisierung Analyse markiert (siehe Schritt 7.4).
4. Mit Hilfe der Zeilentool in der Imaging-Software, zeichnen Sie eine 2-Punkt-dicke Linie über die ausgeschlossenen Objekte innerhalb des Schwellenbilds.
5. Wählen Sie die Linie gezeichnete Objekte in Schritt 7.4. Kopieren Sie die Zeile Objekte aus dem roten Kanal auf seinen entsprechenden grünen Kanal (Em-Aurora A) Bild.
6. Messen Sie die Graustufen-Pixelintensitätswerte unter der Leitung der Co-Lokalisierung und insgesamt Em-Aurora-A-Werte für jede einzelne Zelle zu berechnen Objekte, indem Sie "Messen" und dann "Intensitätsprofil" aus dem Drop-Down-Fenster innerhalb der Imaging-Software-Programm.
   1. Organisieren Sie die Daten, die durch experimentelle Behandlung und subzellulärer Region zu einem Tabellenkalkulationsprogramm exportieren und die Datei als Typ .xls speichern (zB "control_grayscale_intensity.xls").
      Anmerkung: Die Angaben in dieser Art und Weise präsentiert stellt die Co-Lokalisation Bruchteil der gesamten gemessenen Em-Aurora-A pro subzellulärer Region.
7. Unter Verwendung der gemessenen Werte von Schritt 7.6, wiederholen Sie den Schritt 6.3.7 die statistische Signifikanz unter Verwendung von p <0,05 als der Cutoff für Bedeutung zu berechnen.

8. Immunofluoreszenz

1. Fix-Zellen (siehe Schritt 3.4) mit Paraformaldehyd / Glutaraldehyd Koextraktion / Fixierungspuffer (PGF-PHEM; 4% Paraformaldehyd, 0,15% Glutaraldehyd, 0,2% Waschmittel in 60 mM PIPES, 27,3 mM HEPES, 10 mM EGTA und 8,2 mM MgSO _4, pH 7,0) für 10 min bei RT.
2. Spülen 3 mal für 5 min mit 2 ml 1x PBS.
3. Behandlung 2 mal für 15 Minuten mit 0,01 g / ml NaBH ₄ in 1x PBS reaktive Aldehyde zu quenchen.
   Hinweis: NaBH ₄ bildet Blasen , die die Deckgläser verursachen kann zu schweben. Es ist entscheidend, dass die Deckgläser während dieser Inkubationen untergetaucht bleiben. Wenn die Deckgläser zu schweben beginnen, verwenden Zange eine Kante des Deckglases, um zu heben die Blasen entweichen zu lassen.
4. Spülen Sie 2 mal mit 1x PBS vor bei RT für 1 h mit 5% fettfreie Milch in 1x PBS auf einem Wippschüttler blockiert.
5. Inkubieren Zellen in der primären Antikörper (Kaninchen-Anti-pT288-Aurora A (1: 1000)) und Ratten-anti-α-Tubulin (1: 500), hergestellt in 1x PBS-Lösung. Inkubieren bei 4 ° C auf einem Schüttler über Nacht.
6. Entfernen Sie primäre Antikörper und spülen Sie 3-mal für 5 min in 1x PBS, bevor mit sekundären Antikörpern inkubiert (Esel-Anti-Kaninchen (1: 1000) und Ziege anti-Ratte (1: 1000)), hergestellt in 5% fettfreie Milch für 2 Stunden bei 37 ° C.
7. Mount Deckglas auf einem Glasobjektträger in fluoreszenz optimierten Montagemedium. Verschließen Sie die Deck Kanten auf den Schlitten mit klarem Nagellack, und lagern im Dunkeln bei 4 ° C.

9. Zellmigration Assay

1. Führen Sie HUVEC Kultur für Migrationsassays, wie oben beschrieben (Protokoll 3: cDNA-Transfektion und HUVEC Kultur auf Deckgläser, Schritte 3,2-3,3).
2. Nach Transfektion von Zellen, Rettungs- Zellen, die mit 80 ul kompletten endothelialen Basalmedium. Pipette, um die 80 & mgr; l Probe als Tropfen auf die Mitte eines getrockneten Fibronektin-beschichtete 22-mm-Rund Nr 1.5 Deckglas. Nicht verbreitet die 80 ul droSeite Inkubieren bei 37 ° C für 3-4 Stunden Zeit für die Zellhaftung in einer konfluenten Monoschicht zu ermöglichen.
   Hinweis: Das Trocknen des Deckglases erforderlich ist, die 80 & mgr; l Tropfen Ausbreitung bei Kontakt des Deckglases zu verhindern. Dieser Ansatz ermöglicht HUVECs in einem kleinen Bereich des Deckglases konzentriert werden und dadurch fördert die rasche Bildung einer konfluenten Monoschicht von Zellen.
3. Spülen 2 mal in kompletten endothelialen Basalmedium un-anhaftenden Zellen zu entfernen.
4. So erstellen Sie ein "Wundrand," kratzen das Deckglas mit einem Messer sterilisiert Rasierer vorsichtig mit einem sauberen Rasierklinge über die HUVEC-Monoschicht ziehen (aus Schritt 9.2). Halten Sie das Deckglas sanft an Ort und Stelle mit einer Pinzette beim Abschaben Verrutschen der Rasierklinge zu verhindern.
5. Lassen Sie die Zellen für 3 Stunden in einem 37 ° C Inkubator zu erholen. Zusammenbauen und montieren Deckglas (n) für die Bildgebung (siehe Protokoll 4).
6. Erwerben Phasenkontrast und 488 nm Bilder in 10-Minuten-Intervallen für 12 Stunden am Mikroskop eine Verwendung10x 0,45 NA Phasenziel und ein 0,52 NA LWD Kondensator das "ND Acquisition" Panel der Bildaufnahme-Software-Programm (siehe Schritt 5.3) verwendet wird.

10. Quantifizierung von HUVEC Branching und Migration

1. Für die Analyse Verzweigung und sogar Zell Beleuchtung und unvoreingenommene Quantifizierung, erwerben eine mikroskopische Bild eines HUVEC transfiziert (siehe Schritt 3.3) und mit dem Ausdruck der Marker Mapple-C1-cDNA-Konstrukt, ein Zellvolumen zu ermöglichen.
2. Unter Verwendung der Imaging-Software-Programm, öffnen Sie das Mapple-C1 Bild und beschriften Sie die Position auf beiden Seiten der Branche, wo die Membran den größten Krümmungswinkel zeigt. Verbinden Sie diese beiden Punkte mit einer geraden Linie. Diese Linie ist die "Zweig Herkunft."
3. Mit der Linie Werkzeug der Bildbearbeitungssoftware identifizieren visuell Zweige, die messen> 10 & mgr; m in der Länge von der "Zweig Ursprung" bestimmt in Schritt 10.2. Berechnen Sie die Zweiglänge durch Messen des Abstands von the "Zweig Ursprung" der am weitesten entfernten Punkt der Zweigspitze (siehe Abbildung 4).
4. Zählen Sie die Anzahl der verzweigten Vorsprünge, die messen> 10 & mgr; m in der Länge zu erhalten "Zelle Zweignummer."
5. Für Wanderungsanalyse unter Verwendung der gesammelten Bilder in Schritt 9.6, identifizieren visuell eine Wundrand HUVEC basierend auf physikalischen Ort (dh Zellen physisch am Rand der Wunde) und Expressionsprofils (dh, wählen Sie eine grüne Zelle Wundrand , wenn das Experiment beinhaltet Expression von GFP).
6. Unter Verwendung der Phasenkontrastbilder der Zellen, visuell den Kern zu identifizieren (die halbtransparente kugelförmige Struktur in der Nähe der Mitte der Zelle), und dann den Nukleolus visuell identifizieren (kleine, dunkel gefärbte, kugelförmige Struktur im Zellkern) an der erste Zeitpunkt der Zeitraffer-Bilder. Klicke auf die Position des Nucleolus der x- und y-Koordinaten des Nukleolus zu etikettieren.
7. Mit Imaging-Software, von Hand verfolgen dieKernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bilder , indem Sie auf die Position des Kernkörperchen Klicken auf die x- und y - Koordinaten des Kernkörperchen in jedem Rahmen des Zeitraffer-Film (Abbildung 4) zu beschriften.
8. Mit der Imaging-Software, klicken Sie auf "Datei" und dann auf Speichern klicken unter "dann auf den Bilddateityp auswählen" .xls ".
9. Öffnen Sie die Hand-Tracking-Datendatei (aus Schritt 10.8) mit einem Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie die mittlere Wanderungsgeschwindigkeit und Laufstrecke zu Ursprung bedeuten.
10. Mit Hilfe eines Tabellenkalkulationsprogramm, klicken Sie auf "Data", dann klicken Sie auf "Data Analysis" aus dem Drop-Down-Fenster Daten. Wählen Sie Bonferroni-Korrektur, one-way Varianzanalyse Test mit> 95% als der Cutoff für statistische Signifikanz.

Ergebnisse

HUVEC Kultur für Lebendzell-Mikroskopie
Abbildung lebender Zellen von HUVECs fluoreszierende Proteine ​​exprimieren erfordert , dass HUVECs werden in einer Umgebung gehalten , die geeignet ist für normales Zellwachstum und Wartung, sowie normale Protein - Expression und Funktion. 1 zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll eine gepufferte vorzubereiten verwendet und geschlossenes System, das für das Sammeln von optischen Eigenschaften optimiert Zeitrafferbilder von lebenden Zellen aufrecht erhält. Dünne Streifen von doppelseitigem Klebeband werden auf einen Glasobjektträger (1A) angeordnet und dann das Deckglas des kultivierten HUVECs enthält , wird auf der Oberseite des Bandes wie beispiels invertiert , dass die Zellen gegenüber dem Schieber (1B). Auf diese Weise stellt das Band eine kleine Lücke zwischen den beiden Glasoberflächen und schafft einen Raum , in dem die Zellen in geeigneten Zellkulturmedium gebadet werden (1C, siehe Protokoll 4, oben). ichna letzten Schritt wird das Deckglas auf dem Glasobjektträger eine abgedichtete Vaseline unter Verwendung: Lanolin: Paraffinwachs (1: 1: 1 - Mischung, VALAP; 1D) ein geschlossenes System zu schaffen. Dieser Zellkulturansatz wurde sowohl für die kürzere Zeitsequenz Abbilden EB3 Kometen und für die längere Zeitsequenz Verzweigungs und Migrationsexperimente verwendet. Zusätzlich kann das wachsartige Konsistenz VALAP zum einfachen Entfernen aus dem Glasobjektträger und Deckglas am Ende eines Abbildungs ​​experimentieren, so daß ergänzende Ansätze einschließlich Fixierung und Immunmarkierung (siehe Protokoll 8) erlaubt, können auf dem gleichen Deckglas und Zellprobe durchgeführt werden, dass wurde mit der Live-Cell-Imaging-Ansatz visualisiert.

Abb . 1: Methodology of HUVEC Kultur lebender Zellen mikroskopischen Abbildung (A) Schneiden 2 Stück doppelseitigen Klebebands in 0,65 cm x 2.50 cm rechteckigen Streifen und befestigen ein Stück doppelseitigen Klebebands horizontal entlang der oberen Kante der Folie, und das andere Stück, entlang der Unterkante des Schiebers. Es ist wichtig , eine kleine Menge an Raum zwischen dem Band und dem Schlitten Kante zum Abdichten der Kammer zu ermöglichen , wie in (D) beschrieben. (B) einer Pinzette entfernen Sie die Deck Verwendung enthält HUVECs und invertieren die Deck (Zellenseite nach unten) auf der Oberseite der Bandstücke. (C) mit einer Mikropipette, dann werden 40 & mgr; l von Bildmedien (vollständige endothelialen basalen Medium , das mit 25 & mgr; M HEPES) zwischen dem Deckglas und dem Glasträger. Stellen Sie sicher, dass der Raum zwischen dem Deckglas und Objektträger vollständig mit Bildmedien und vermeiden Sie Blasen gefüllt ist. Verwenden, um eine Wasserstrahlpumpe entlang der Kante des Deckglases überschüssige Medien zu entfernen, falls erforderlich. (D) Verwenden Sie warmes VALAP (1: 1: 1 Vaseline: Lanolin: Paraffin) um die Ränder des Deckglases zu versiegeln. Überprüfen Sie für Bildmedien Leckages durch leichtes Drücken auf dem Deckglas um. Verwenden Sie zusätzliche VALAP zu beheben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Automatische Verfolgung von EB3 fluoreszenzmarkierten ermöglicht eine umfassende Analyse der gesamten Zelle und regionalen MT Wachstumsdynamik. Die Sammlung von klar, deutlich und sehr Zeit- und ortsaufgelösten mikroskopischen Bildern des EB3 Protein ist auf die Analyse von EB3 Bewegungen innerhalb der Zelle essentiell. HUVEC Expression EB3 fluoreszenzmarkierten variiert von Zelle zu Zelle verbreitet und die Fluoreszenzintensität erhöht typischerweise innerhalb der gleichen Zelle über einen Zeitraum von Stunden. Daher ist es wichtig, diese Veränderungen in der Expression Profil zu identifizieren, um mögliche Auswirkungen der erhöhten EB-Expression auf MT Wachstumsdynamik zu prüfen und zu überwachen. Dies geschieht am besten durch die Auswertung Grau Fluoreszenz intensity Profile für jeden abgebildeten Zelle, und dann die Datenanalyse auf jene Zellen zu beschränken, die einen definierten Bereich von Graustufen-Expressionsprofile anzuzeigen. Erste Bewertung der Expression Profildatensätze ist kritisch und sollte mit MT Wachstumsdynamik Daten verglichen werden, die durch plusTipTracker Software für jede Zelle erhalten wird. Expressionsprofile können gegen MT Wachstumsgeschwindigkeit und MT Wachstum Lebensdauer innerhalb einer experimentellen Gruppe für jede Zelle aufgetragen werden, um den gewünschten Bereich der Graustufendarstellung zu bestimmen und potenzielle Ausreißer zu identifizieren.

Abbildung 2 Highlights ein HUVEC auf einem Fibronektin - Substrat kultiviert (siehe Protokoll 2.1, oben) und mit dem Ausdruck in der Nähe von den optimalen Mengen an Mapple-markierten EB3. Fluoreszierende EB3 Kometen sind in einem Zeitraffer-Serie von Bildern über einen Zeitraum von 12 sec (2A) gezeigt. Analyse von EB3 Kometen plusTipTracker Software beinhaltet einen automatisierten, Frame-by-Frame EB3 Komet Dete mitction (grüne und gelbe Punkte, 2B). Kometen innerhalb jedes Rahmens erfasst werden dann verknüpft, abhängig von ihrer Änderung in der Position von Rahmen zu Rahmen, EB3 Spuren und eine visuelle EB3 Spur overlay (2C-F) zu erzeugen. Track-Overlays sind farbcodiert und Farbunterschiede können durch die Parameter vom Benutzer eingegebenen bestimmt werden. Üblicherweise verwenden diese Unterschiede den globalen Mittelwert von MT Wachstumsgeschwindigkeit und das Wachstum MT Lebensdauer ^5,31 und teilen damit die Daten in vier Gruppen: langsam und kurzlebig (rot), langsam und langlebig (gelb), schnell und kurz lebte (grün) und eine schnelle und langlebige MT Wachstum (blau; 2G). PlusTipTracker-vermittelte Verfolgung von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik ermöglicht auch benutzerdefinierte Regions of Interest (ROIs). PlusTipTracker extrahiert die Spur MT Wachstumsdaten von innerhalb der benutzerdefinierten ROI (2A, B und F), wodurch für den Vergleich von MT Wachstums dynamics in verschiedenen Regionen der gleichen Zelle.

Abbildung 2: EB3 Komet Erkennung, Verfolgung und plusTipTracker Datenausgang (A) Zeitraffer-Film eines HUVEC exprimieren Mapple EB3.. Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht und ganze Zelle Maske (weiße Linie) Demarkieren die Zellgrenzen. Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Tafeln zeigen roh Grauzeitrafferbilder von EB3 Kometen in aufeinanderfolgenden Abbildungsrahmen (t = 0 sec - t = 12 sec). (B) Nachweis von plusTipTracker EB3 Kometen aus den Bildern in (A) gezeigt ist . Linke Seite zeigt eine ganze Zelle Ansicht der erkannten Kometen (gelbe Punkte). Red Box stellt den gezoomten Bereich in den Zeitraffer-Bilder gezeigt (rechte Felder). Rechts Platten markieren fünf erkannt EB3 Kometen (rote Pfeile) und Spuren diese fünf Kometen über die 12 Sekunden Abbildungsperiode. Grün dots EB3 Kometen repräsentieren detektiert, der nicht vorhanden war (oder nicht festgestellt wurden) in der vorherigen Zeitintervall. (C) Maximum Intensity Projection von 61 Frames (2 min Film) der EB3 Kometen in (A) gezeigt. (D) plusTipTracker MT Track - Overlay aus den gleichen 61 Frames (2 min Film) in (C) gezeigt. (E) Zoom von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in C). (F) Zoom von plusTipTracker MT Track - Overlay von Maximum Intensity Projection (roter Kasten in D). (G) farbkodierte Legende für Track - Overlays in (D) gezeigt , und (F). Bezeichnung als langsam, schnell, kurzlebige oder langlebig ist für alle Wachstumsspuren in einer Gruppe von zehn Mapple-EB3 exprimierenden HUVECs gemessen am Mittelwert berechnet. Zur leichteren Visualisierung Spur Overlays in (D) und (F) werden mit invertierten Pixelintensitäten der Zelle erzeugte Bild in (A) gezeigt ist. Maßstabsbalken = 20 um./files/ftp_upload/54265/54265fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

HUVEC Verzweigung und Muster Migration sind empfindlich Signale aus dem ECM-physikalischen mechano.

HUVECs werden auch auf verschiedene Typen von Signalisierungs cues reagieren bekannt und dabei, morphologische Veränderungen unterzogen werden, die eine geeignete zelluläre Antwort auf die bestimmte Signalisierungs cue diktieren (s) ^36,40-42. HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glassubstraten (3A), oder auf steifen 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (55 kPa) in der Regel eine runde oder längliche Morphologie mit wenigen deutlichen verzweigten Vorsprünge (3B) angezeigt werden soll . Wenn jedoch kultiviert auf sehr weichem 2-dimensionalen Polyacrylamid ECMs (0,7 kPa), HUVECs zeigen eine stark verzweigte Morphologie, die bekannt ist, zur Folge haben Compliance-induzierte nach untenRegulierung der Myosin-II Kontraktilität ^4,5,31 (3C). Somit regulieren HUVECs ihre zellulären Morphologie durch ECM mechanosensing, und dies wird durch lokalisierte Modulation der MT Dynamik und acto-Myosin Kontraktilität erreicht.

Da HUVECs eine Vielzahl von morphologischen Eigenschaften angezeigt werden, um HUVEC zu messen Verzweigung ist es wichtig, zunächst zu definieren, was eine verzweigte Vorsprung ist, und dann zu bestimmen, wie ein verzweigter Vorsprung objektiv gemessen werden. Eine Technik verwendet eine Vier-Schritt - Ansatz , mit dem ein Zellengrenze oder "Maske" von Hand erzeugt wird , um die Kanten der Zelle Verfolgungs ein Bild einer Zelle unter Verwendung eines Fluoreszenzvolumenmarker exprimierenden die Zellränder (3D) zu definieren. Nach Maskenerzeugung, Zweig Ursprünge sind durch Ortung größten Krümmungswinkel zwischen dem verzweigten Vorsprung und dem Zellkörper definiert. Eine Linie wird gezogen DEMArk die "Zweig Ursprung" (lila gewinkelten Linien; Abbildung 3E). Filialnummer wird gemessen , indem einfach die Anzahl der Zweige mit einem definierten Zweig Ursprung zu zählen (Abbildung 3F). Verzweigungslänge wird als der Abstand von dem Verzweigungsursprung zum distalen Verzweigungsspitze (Abbildung 3G) gemessen. Zur Aufnahme von kleinen lamellipodialen Projektionen aus der Datenanalyse, zusätzliches Kriterium vermeiden verlangen , dass Äste müssen länger sein ( "Zweiglänge") als breit (an der "Zweig Herkunft"), und dass Zweige müssen mindestens zehn Mikrometer lang sein ^{5 , 31.}

. 3: Analyse von HUVEC Verzweigungs Morphologie (A - C) DIC Bild Beispiele von HUVECs kultiviert auf Fibronektin beschichteten Glas ECMs (A) steif (55 kPa) Polyacrylamid ECMs (B) und weiche (0,7kPa) Polyacrylamid ECMs (C). Verzweigung wird in HUVECs kultiviert auf 0,7 kPa Polyacrylamid ECMs (C) im Vergleich zu den steiferen ECMs (A, B) dramatisch zugenommen. (D). DIC mikroskopische Aufnahme (linkes Bild) eines transfizierten HUVEC exprimieren eine Mapple-C1-cDNA-Konstrukt (ein Zellvolumen Marker; rechtes Bild). Definieren (E) Herkunft der Zweig durch den größten Krümmungswinkel Ortung (dh der Position , wo die Membran die größte Krümmung zeigt, purpurfarbene Linien) auf beiden Seiten der Branche und schließen Sie dann die Winkel mit einer geraden Linie (blaue Linien) . (F) Identifizieren und verzweigte Vorsprünge auszuwählen , die erweitern> 10 & mgr; m von der "Zweig Ursprung" (definiert in E). Zählen Sie die Anzahl der verzweigten Vorsprünge, die zu erhalten "Zweignummer." (G) Messen Sie den Abstand von der Mitte der "Zweig Ursprung" der most distale Spitze der Branche das Linienwerkzeug in der Anwendung Anmerkungen und Messungen mit Hilfe von NIS Elements Software, die zu erhalten "Astlänge." Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Zusätzlich zur Erfassungs ECM Compliance HUVECs auch zur Beseitigung von benachbarten Zellkontakte als induziert durch scratch Verwundung erfassen und darauf zu reagieren. Im Migrationstest, in einer Monoschicht kultiviert HUVECs werden einer Kratzwunde ausgesetzt und Migrationseigenschaften gemessen werden (siehe Protokoll 9, oben). Nach der Induktion der Wunde durch die Monoschicht Verkratzen, polarisieren Wundrand HUVECs durch eine protrusive Vorderkante zu entwickeln , die in die Wunde (4A, t = 0 h) erstreckt. Über einen Zeitverlauf von 10-12 h, polarisiert Wundrand HUVECs wandern in den Wundbereich und füllen dieWunde, eine neue konfluenten einschichtigen Aufbau (4A, t = 11 h). Wie bei HUVEC Verzweigung schlägt aktuelle Hinweise darauf , dass Polarisierung und Migration auf die koordinierte Umorganisation des MT und Aktin - Zytoskelett kritisch abhängig ist ^43-49. Dies wird dadurch erreicht, teilweise durch lokale Hemmung der an der Vorderkante MT Demontage MCAK induzierten, aber nicht an der Hinterkante des aufgewickelten Kante HUVECs ^31. Die Empfindlichkeit der MT Dynamik wundinduzierten Polarisations durch die Rac1 GTPase initiiert wird, die zahlreiche nachgeschalteten Regulatorproteine ​​Ziele, einschließlich Aurora-A-Kinase, die phosphoryliert und hemmt MCAK an der Vorderkante und anderen Kinasen, die fähig sind, zu hemmen oder MAPs aktivierenden lokal MT Wachstum und Schrumpfung ^{18,31,36,48,50-53} modulieren. Umfangreiche experimentelle Beweise unterstützt die Vorstellung, dass die Koordinierung der Vorderkante Vorsprung und Hinterkante Kontraktion wird durch Zyklen von Rac1 Aktivierung geregeltMT Montage an der Vorderkante und RhoA Aktivierung acto-Myosin Kontraktilität an der Hinterkante, wodurch der Fahrt gerichtet Motilität ^{9,41,51,52,54-58} zu fördern.

Bis heute gibt es keine etablierte Methode für die automatische Verfolgung von Zellmigration durchführen. Dies ist ein Ergebnis von Schwierigkeiten bei der rechenzell ECM Grenzen zu analysieren, die konsequent zu ändern sind als Wundrandzellen polarisieren und zu migrieren. Fluoreszierend markierten Zellen von Tracking - ^59-64, die Bevölkerung von fluoreszenzmarkierten HUVECs in Wundrand Migrationsversuche beträgt ca. 30-40% der Gesamt HUVEC Bevölkerung und damit die Mehrheit der Wundrandzellen Während viele Software - Programme in der Lage sind ein Muss werden durch Phasenkontrast oder DIC-Bildgebung sichtbar gemacht. Zusätzlich ist es wichtig, wenn die Migration wundKante Messung fluoreszierenden und nicht fluoreszierenden Zellen innerhalb der gleichen Wunde auszuwerten, um spezifisch zu identifizieren,Auswirkungen der Expressionskonstrukte sowohl innerhalb des experimentellen Studiengruppen und zwischen den experimentellen Studiengruppen. Derzeit ist der beste Ansatz HUVEC Migration zu messen , um eine Hand - Tracking - Ansatz zu verwenden , bei dem ein Wundrand Zelle zunächst identifiziert und dann werden der Kern und Kernkörperchen identifiziert (Abbildung 4B). Der Nukleolus wird als die Position Determinante für die Zellverfolgung verwendet aufgrund seiner hohen Lichtstreuungs Dichte und relativ geringe Größe. Diese beiden Merkmale der Nukleolus machen es leichter zu identifizieren und Messfehler zu reduzieren, indem die Bereichsbegrenzungs in dem der Benutzer einzelne Spurpositionen platzieren. HUVEC Migration Spuren werden dann durch einen Klick auf den Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bildrahmen erzeugt. Schließlich werden Wanderungsgeschwindigkeit und Migrationsdistanz zum Ursprung gemessen und für die Kontrolle und experimentelle Zellgruppen (4B) analysiert.

Abbildung 4: Analyse der Wundrand HUVECs und Migration Tracking (A) 20X Phasenkontrast - Bilder einer 11 h Zeitraffer-Imaging - Serie von Grund auf neu Wundrand HUVECs (auch bekannt als "Migration Assay").. Die Wunde und die Richtung der Migration in das Panel t = 0 h angegeben. HUVECs werden gezeigt, um die Wundkante und vorab in die Wunde zu durchqueren, bis eine Monoschicht von Zellen gebildet wird (t = 3,5 h - t = 11 h). (B) Analyse der Migrationstest Zeitraffer - Bildgebung (wie in A gezeigt) erfordert zunächst die Identifizierung einer verfolgbaren HUVEC Wundrand basierend auf Zellenposition (dh Zellen physisch am Rand der Wunde) und Expressionsprofil (d .h. wählen Sie eine grüne Zelle Wundrand , wenn das Experiment Expression von GFP beinhaltet). Mit dem Phasenkontrastbild, identifizieren den Kern und die Kernkörperchen. Hand verfolgen die Kernkörperchen in aufeinanderfolgenden Zeitraffer-Bilder, die eine Verwendung vonAnwendung Notationen und Messungen in NIS Elements Software Wanderungsgeschwindigkeit und den Abstand zum Ursprung zu bestimmen. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m (A), 20 & mgr; m (B). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Mit HUVECs in Morphologie und Migration Experimente.
Abbildung lebender Zellen von EB3-markierte MT Wachstumsdynamik innerhalb HUVECs erfordert angemessene und reproduzierbare Zellkulturbedingungen, um zu messen und zu bewerten Veränderungen in MT Wachstum und HUVEC Morphologie, so dass sie dann zu einem ECM-Signalisierungs Cue zugeordnet werden. HUVECs stellen ein hervorragendes Modell der Zellform und Beweglichkeit für das Studium. Sie sind sehr zugänglich für die Transfektion mit fluoreszenzmarkierten cDNAs sie dramatische Morphologien als Reaktion auf sowohl lösliche als auch physikalische Signal Cues aufweisen, und sie behalten die Fähigkeit , sich in vaskuläre Röhren zu organisieren , wenn ^65-70 geeignete Zellkulturbedingungen zur Verfügung gestellt. Primäre Zellkulturen, wie HUVECs, erfordern eine sorgfältige Handhabung und Überwachung von Zellpassage Nummer, um die Zellen gesund sind, um sicherzustellen, und dass sie sich verhalten normalerweise während der Experimente. Wenn beispielsweise die Durchführung von Experimenten untersucht cytoskeleton und / oder die Zellmorphologie, HUVECs sollte nicht für Experimente über den zehnten Zellkulturdurchgang verwendet werden, wie HUVECs typischerweise beginnen ungleichmäßigen Morphologien herum Passage zwölf bis fünfzehn anzuzeigen.

Zelldichte ist auch ein kritischer Regulator der HUVEC Gesundheit und Proliferation. HUVEC Verzweigung Untersuchungen (siehe Protokoll 10,1-10,4 oben) verwenden relativ niedrige Zelldichte Kulturen, um die Zellen physischen Raum zu schaffen, mit ihren ECM zu interagieren und verzweigte Vorsprünge zu verlängern. Im Gegensatz dazu ist der Migrationsforschung in der Wundrand (siehe Protokoll 10,5-10,8), HUVECs sind Kultur in einer Monoschicht vor der Verletzung. Als solche Wundrand HUVECs eine relativ unverzweigten Morphologie zeigen, erstrecken sich Kantenvorsprüngen führt, und zeigen Zell-Zell-Interaktionen mit ihren unmittelbaren Nachbarn, wie sie in die Wunde wandern.

Caveats und Vorteile von Tracking-MT Dynamics in Wohn HUVECs.
Spinning Disk-Mikroskopie ist ein ausgezeichneter Ansatztesten experimentelle Hypothesen, die konfokale Bildklarheit mit hoher Zeitauflösung erfordern. Mit der entsprechenden Kamera und Lasermodul dieser Mikroskopie Ansatz ist empfindlich gegenüber niedriger Emission Fluoreszenz und kann in reduzierten Photobleaching im Vergleich zu anderen Arten von Fluoreszenzmikroskopie unterstützen. Wichtig ist, dass dieser Ansatz auch gut für mittlere bis hohe Zeitauflösung Bildgebung geeignet, da zur Erzeugung umfassende Messungen von MT Wachstumsdynamik mit dem EB3 Label-Ansatz, in einer Vielzahl von verschiedenen Zelltypen erforderlich ist.

Während die EB3 Methodik zur Etikettierung wachsenden MT Plus-Enden deutliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Fluoreszenzmarkierung MTs aufweist, hat es auch eindeutige Nachteile auf. Zum Beispiel gibt es einen Anteil des MT - Array , das zu einem gegebenen Zeitpunkt nicht aktiv wachsenden wird einschließlich sowohl der Population von Auseinanderbauen MTs und der Population von stabilen, nicht-dynamischen MTs ^71-74. EB3 würde diese zwei Populationen von MTs nicht beschriften undDaher ist der Beitrag dieser beiden Populationen nicht in experimentellen Datenanalyse einbezogen werden. Alternative Methoden für die gesamte MT Array Auswertung wurden auf die Expression von fluoreszenzmarkierten Tubulin fokussiert, die in allen Populationen von MTs enthält und ermöglicht Identifizierung wachsen, schrumpfen, und stabile MTs. Jedoch wegen der relativ hohen Dichte des MT-Array in der Nähe der Mitte der Zelle und neben dem Mtoc (MTOC), das gesamte MT-Array Markierung erzeugt ein Nachteil bei der Durchführung der Bildanalyse von MT Enden, die nicht in der Nähe der Zelle Peripherie ^75-77. Experimente unter Verwendung von Zweifarben - co-Markierung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin und fluoreszierende EB3 in lebenden Zellen haben gezeigt, qualitativ, dass die überwiegende Mehrheit der Tubulin-markiertem MTs auch EB3-markiertes ^78. Darüber hinaus hat es kein effizientes Verfahren zur automatischen Verfolgung von MTs mit fluoreszierenden Tubulin markiert worden. Dies bedeutet, dass die Daten KollHand Verfolgung einzelner MTs tion und Messungen der MT Dynamik in Zellen benötigen fluoreszierendes Tubulin exprimieren, ein Prozess, fehleranfällig und mühsam ist. Als Ergebnis hat die automatisierte Computeranalyse von EB3 markiertem MTs die bevorzugte Methode werden zur Messung MT Dynamik wie es Dynamik MT Experimente angewendet werden kann auf zahlreiche Zelltypen und in einer Vielzahl von experimentellen Regimen ^35,79.

Die Verknüpfung MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration.
Aus der Sicht eines Zytoskelett Ermittler, eine äußerst nützliche Anpassung der plusTipTracker automatisierten Tracking-Analyse ist die Fähigkeit, sowohl ganze Zelle und regionale Veränderungen in MT Wachstumsdynamik zu messen und zu bewerten. Die Anforderung für eine Zelle polarisiert zu werden, ist eine wesentliche Voraussetzung für die Richtungszellmigration. Als solche haben polarisierte Signal Cues lange Schlüsselfaktoren für die gerichtete Zellmigration bekannt ^{30,31,51,54,56,80,81} . Beispielsweise lösliche Signalmoleküle wie VEGF Aktin - Polymerisation und MT Wachstum in Richtung der VEGF cue in endothelialen Zelltypen ^2,82-87 induzieren. Zusätzlich kann in Reaktion auf physikalische Wechselwirkungen mit dem ECM (beispielsweise Compliance und Dimensionalität mechanosensing) modulieren HUVECs ihre MT Dynamik durch örtliches Regulieren MAPs MT Wachstum zu fördern verzweigten Vorsprünge innerhalb verlängernden, und dies dient HUVEC Migration in Richtung der Führung Stichwort ^5,31,88. Somit Polarisation in Reaktion auf extrazelluläre Signalisierungs cues unterstreicht die Notwendigkeit für experimentelle Bewertung von lokalisierten Veränderungen in Zytoskelett-Dynamik.

Gleichzeitige Live-Cell-Imaging von MT Wachstumsdynamik (mit dem EB3-Ansatz) und HUVEC Zellmigration ist extrem schwierig durchzuführen, weil MTs auf einer Zeitskala von Sekunden wachsen, während Veränderungen der Zellmorphologie und gerichtete Migration auf einer Zeitskala von Stunden auftreten. Doch beide Prozesse sind eng LINKEd. Außerdem führt kontinuierliche, schnelle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten EB3 auf der zweiten Zeitskala des EB3 Signal Photobleaching. Versuche, dieses Problem zu überwinden, indem kurze Abbildungsreihe EB3 (1-2 min Akquisitions Serie) alle 30 Minuten waren erfolgreich leitend, jedoch nur in einer kleinen Anzahl von ECs erreicht werden könnte, der eine optimale Expression EB3 hatte und daß keine nachteiligen haben anzuzeigen Auswirkungen auf wiederholte Laserbeleuchtung ^5.

Ein alternativer Ansatz, der für Interpretationen , wie MT Wachstumsdynamik beitragen zu Veränderungen der Zellmorphologie und Migration ermöglicht die plusTipTracker Region of Interest (ROI) Werkzeug ³⁵ (siehe Protokoll 6.6). Diese Methode ermöglicht eine ganze Zelle MT Wachstum Spuren unterteilt in benutzerdefinierten Regionen zu sein, von dem Spuren MT Wachstum können dann extrahiert und analysiert werden. Beispielsweise Vergleiche von "verzweigten" versus "nicht verzweigte" Regionen der Zelle haben gezeigt, dass mehr MTs s wachsenNiedrigen und persistent innerhalb verzweigten Regionen im Vergleich zu dem nicht verzweigten Zellperipherie ^5. In polarisiert Wundrand HUVECs, Vergleiche der Vorderkante und Hinterkante Wachstumsdynamik MT zeigte, dass MCAK-induzierte MT Demontage innerhalb der Vorderkante spezifisch gehemmt wird, aber nicht die Hinterkante. Regional Bewertung der Vorder- und Hinterkante MT Wachstumsdynamik in HUVECs exprimierenden Rac1 und / oder Phosphorylierung Mutanten von MCAK ergab ferner, dass Rac1-induzierte Aktivierung von Aurora-A-Kinase gezielt und lokal MCAK Aktivität innerhalb der Vorderkante verhindert HUVEC Polarisation und gerichtete Migration zu fahren ^31. So hat die Kombination von automatisierten Verfolgung von MT Wachstumsdynamik und regionale Bewertung der MT Wachstumsdynamik innerhalb der verzweigten Vorsprünge und / oder der Vorderkante der Wundrand HUVECs erlaubt uns MT Wachstumsdynamik zu HUVEC Morphologie und Migration zu verknüpfen.

Die Protokolle beschrieben sind designed, um eine im Allgemeinen einfach und hoch reproduzierbare Methodik für HUVEC Kultur und experimentelle Untersuchung. Dennoch sind viele der Protokolldetails komplex und zeitaufwendig, was sich wiederum Gelegenheit für Fehler oder Schwierigkeiten stellt die experimentelle Methodik in der Durchführung. Während es wurde versucht, mögliche Probleme während des gesamten Protokolls, hier ist eine zusätzliche, detaillierte Fehlersuche von möglichen Problemen zur Verfügung gestellt, die weniger verbreitet sind oder in anderer Weise als Noten innerhalb der Methodik Protokolle abgekürzt.

Bezogen auf Beschichtung Deck mit Polyacrylamid-Substrate (Protokoll 2.2), ein häufiges Problem, das Glasplättchen der Aktivierung ist die komplexe Natur entsteht, Kupplung Polyacrylamid auf das Glas, Aktivierung Polyacrylamid und dann ECM Kopplung mit dem Polyacrylamid. Ein besonders schwierig und möglicherweise problematischen Schritt wird die Kultivierung HUVECs auf die Fibronektin / Polyacrylamid-Gel nach der Exposition des polyacrylamide-beschichtete Deckgläser bis 2 mM Sulfo-SANPAH (Schritt 2.2.2.6, oben). Es ist entscheidend für den Erfolg von HUVECs auf diesen Substraten die Kultivierung, die Sulfo-SANPAH vollständig aus dem experimentellen System folgende ECM Konjugation entfernt werden. Dies kann am besten dadurch erreicht , mit ddH ₂ O Waschen und Inkubation der Deckgläser in ddH ₂ O auf einem über Nacht Schüttler. Wenn Zellen, die auf den Polyacrylamid ECMs nicht überleben, oder wenn die Lebensfähigkeit geringer ist als erwartet, erhöht, und wiederholtes Waschen von Sulfo-SANPAH nach Konjugation an Fibronektin (Schritt 2.2.2.9) empfohlen wird, um potenziell dieses Problem lindern.

Verwandt Protocol 3 (cDNA-Transfektion und HUVEC Kultur auf einem Deckglas), ist ein großer Einfluss auf den Erfolg der Elektroporation Verfahrens die Handhabung der HUVECs sowohl während Trypsinisierung der Zellen sie aus dem Kunststoffkolben zu entfernen, und nach Abschluss die Elektroporation (Schritte 3,3-3,4, oben). Es ist wichtig, zu kümmernvollständig die HUVECs überwachen, während in Trypsin und nicht die Zeit für die Zellen "round-up" auf der Oberfläche des Kolbens (typischerweise 1-2 min) erforderlich, um nicht überschreiten. Zu viel Zeit in Trypsin ist eine Hauptursache für Tod HUVEC, die typischerweise nicht realisiert ist, bis die Zellen an Fibronektin-beschichtete Deckgläser plattiert sind (Schritt 3.4) und sie dann nicht an dem Substrat zu befestigen.

Von ähnlicher Bedeutung, HUVECs (und die meisten primären Zelltypen) nicht gut gehen, wenn für lange Zeit in der Elektroporation Puffer suspendiert. Bei größeren Maßstab Experimenten beispielsweise, wo der Benutzer über fünf oder mehr Bedingungen, die Elektroporation erfordern, ist es besser, um die Zellen in einzelnen Rohren (1 Röhrchen pro Transfektion) pelletiert halten und sie zu mischen, one-at-a-time , in der Elektroporations-Puffer unmittelbar vor der Elektroporation. Dieser Ansatz minimiert Inkubationszeit in Elektroporationspuffers und maximierte HUVEC Überleben. Zusätzlich sofortige Rettung in kompletten Kulturmedien ist auch crtische nach der Elektroporation. Rettungs Verzögerungen von einer Minute oder mehr nach der Elektroporation kann in nahezu vollständigen HUVEC zum Tod führen und sollte daher vermieden werden.

Verwandte Zellmigrationsassay (Protocol 9), die Technik der HUVECs mit extrem hoher Dichte Züchten hängt von einer kritischen Änderung (in Schritt beschrieben 9.2) der traditionellen HUVEC-Zellkulturmethode (beschrieben in Protocol 3), das Trocknen des mit Fibronectin beschichteten Deckglas erfordert um HUVEC Kultur in einen sehr kleinen Bereich des Deckglases zu ermöglichen. Oft, wenn das Deckglas nicht vollständig getrocknet wird, oder wenn die vorherige Beschichtung des Deckglases mit Fibronectin (Schritte 2.1 oder 2.2) nicht effizient, die Medien-enthaltenden Zellen, die auf dem Deckglas platziert wird ihre Oberflächenspannung zu verlieren und um die erweitern Kanten des Deckglases, die Dichte der Zellen auf dem Deckglas, dadurch verringert wird. Eine Methode, dieses potentielle Problem zu beheben, ist das Medium aus dem Deck abzusaugen und dannStellen Sie das Deckglas (noch in den 35-mm-Schale) in die Rückseite des Biosicherheitsschrank für 5-10 min. Diese Anpassung kann dazu beitragen, den Luftstrom innerhalb des Gehäuses zu ermöglichen, in das Trocknen der Schüssel zu unterstützen. Wenn sichtbare Flüssigkeit auf dem Deckglas nach dem Lufttrocknen bleibt, aspirieren die Flüssigkeit Flecken und wieder an der Luft trocknen für 5-10 zusätzliche min im Biosicherheitsschrank ermöglichen. Es ist wichtig zu beachten, dass es keine Möglichkeit gibt, vollständig dieses potentielle Problem zu vermeiden, aber es ist weniger geworden ein Problem mit wiederholten Praxis des Protokolls. Es ist auch eine Fehlerbehebung Empfehlung, dass, wenn Deck für die Zellmigration Assay (oder einem Test im Allgemeinen) die Vorbereitung, extra Deck vorzubereiten und haben extra HUVECs ready-to-go im Falle von Problemen auf dem Weg.

Mit diesen Problem Überlegungen im Auge, ist es auch wichtig, den Nutzen der Protokolle zu markieren diskutiert und deren Auswirkungen in Zukunft Zellbiologie Forschung. Die Anwendbarkeit auf die polyacrylamid Ansatz ist breit gefächert und umfasst nicht nur zweidimensionale Studien der zell ECM Eingriff (oben beschrieben), sondern auch dreidimensionale Untersuchungen ^5. Diese Anwendung ist entscheidend für die Erhöhung unser Verständnis, wie HUVECs Zellform und Migration in physiologischen Umgebungen zu regulieren und sollten Ermittler ein grundlegendes Verständnis dafür, wie morphologische Veränderungen koordiniert mit Zytoskelett-Veränderungen. Während die hier beschriebenen Protokolle auf Messungen der MT Wachstumsdynamik fokussiert sind, kann die Mehrzahl der Protokolle und sollte eine beliebige Anzahl von anderen mikroskopisch meßbaren Aspekte der zell ECM-Wechselwirkungen zu messen angepasst werden. Bezüglich MT Dynamik gibt es zahlreiche MAPs, einschließlich mindestens 14 Familien von kinesins ^89, die jeweils mit einem potentiellen Beitrag zu einer HUVEC Polarität und gerichtete Wanderung und alle , die unter Verwendung der vorgestellten Protokolle untersucht werden können.

Zukünftige Untersuchungen sollten einelso an Engagement zell ECM im Vergleich zu Krankheitszuständen in normalen ausgerichtet sein. HUVEC Protokolle hier vorgestellten sind anwendbar auf Untersuchungen der normalen vaskulären Homöostase Prozesse sowie Krankheitszuständen, einschließlich Herzerkrankungen, Retinopathie, Tumorwachstum und Metastasierung, um nur einige zu nennen. Konjugieren sichtlich transparent ECMs und Polyacrylamid Substrate zugänglich Einhaltung Mikroskopische Untersuchungen zum Eingriff Studien zell ECM solchen Gefäßangiogenese überwacht dass endothelial Zelle mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung werden können. Diese Arten von experimentellen Ansätzen bereits offenbaren wichtige Unterschiede in endothelialen Zellform, Polarität, die Migration und die Wirkungen von Proteinen begonnen, die diese Prozesse ^5,31,90 regulieren. Künftige Anstrengungen sollten zu identifizieren wollen, wie die Kombination von ECM-Compliance und Dimensionalität mechanosensing lokal Kontrollproteine ​​dienen können, die gezielt und Zytoskeletts regulieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Aurora A Inhibitor I	Selleck Chemicals	S1451
2%ige Bis-Lösung	Bio-Rad	1610142
3-Aminopropyltrimethyloxysilan	Sigma-Aldrich	A3648
40% Acrylamid	Bio-Rad	1610140
405, 488, 561, 640 nm Hochleistungs-MLC400-Laserkombiniermodul	Agilent Technologies	99462
Ammoniumpersulfat	Sigma-Aldrich	A3678
Anti– Maus-IgG-Immunpräzipitationskügelchen,	TrueBlot-Reagenzien; Rockland Inc.	88-1688-31
anti– Kaninchen-IgG-Immunpräzipitationskügelchen,	TrueBlot-Reagenzien; Rockland Inc.	88-7788-31
ET455/50M, DAPI-ET Emissionsfilter	Chroma Technology Corp.	ET455/50m
ET525/36m Emissionsfilter	Chroma Technology Corp.	ET525/36m
ET605/70m Emissionsfilter	Chroma Technology Corp.	ET605/70m
ET700/75m Emissionsfilter	Chroma Technology Corp.	ET700/75m
Rinderserumalbuminfraktion V	RPI Products	A30075-100.0
Clara gekühlte Kamera für ladungsgekoppelte Geräte	Andor Technology	77026010
Cy3 Esel Anti-Kaninchen	Jackson ImmunoResearch	711-165-152
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
Dyelight 649 Anti-Ratte	für ZiegenJackson ImmunoResearch	112-496-068
EGM-MV SingleQuot Versorgung & Wachstumsfaktoren (Inhalt unten gezeigt)	Lonza	CC-4143
Fötales Rinderserum 25 ml
Rinderhirnextrakt 2,0 ml
Gentamycinsulfat 0,5 ml
Epidermaler Wachstumsfaktor 0,5 ml
Hydrocortison 0,5 ml
Penicillin/Streptomycin (10.000 IE Pen/ml, 10.000 µ g Streptokokken/ml)  10,0 ml
EGTA	Sigma-Aldrich	E3884-100G
Elektronischer Verschluss	Sutter Instrument	77016099
Fibronektin	EMD Millipore	FC010
Glutaraldehyd	Thermo Fisher Scientific	S80026
HALT Proteasehemmer	Thermo Fisher Scientific	PI-78425
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
HRP Anti-Maus für Ziegen	Jackson ImmunoResearch	115-036-062
HRP für Ziegen gegen Kaninchen	Jackson ImmunoResearch	111-036-045
Immuno-Blot PVDF Membran	Bio-Rad	162-0174
Lanolin	Thermo Fisher Scientific	8006-54-0
Magnesium Sulfat	Sigma-Aldrich	M2643-500G
Mikroskop	Nikon TiE	MEA53100
Motorisierter Tisch	ASI Technologies	MS-2000
Eindeckmedium	Dako	CS70330-2
Maus anti-Aurora A	Abcam	ab130156
Maus anti-GAPDH	Abcam	ab9484
Maus Anti-MCAK	Abcam	ab50778
Maus Anti-Tubulin (DM1A)	Cell Signaling Technology	3873S
Nagellack	Elektronenmikroskopie Wissenschaften	72180
NIS Elements Software	Nikon	MQS310000
Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	Enthält den Elektroporationspuffer
Paraffin	Thermo Fisher Scientific	P31-500
Penicillin-Streptomycin (10.000 I.E. Pen/ml, 10.000 µ g Strepto/ml)	MP Biomedicals	91670249
Vaseline	Dow Corning	2021854-1113
Rohre	Sigma-Aldrich	P6757-100G
plusTipTracker
Kaninchen Anti-GFP	Abcam	ab290
Kaninchen Anti– pT288– Aurora A	Abcam	ab18318
Ratte Anti– α-Tubulin	AbD Serotec	MCA78G
Natriumborhydrid	Thermo Fisher Scientific	678-10
Spinnscheibe	Andor Technology	Yokagawa CSU-X1
Sulfo-SANPAH	Thermo Fisher	Scientific PI-22589
SuperSignal West Pico Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Fisher Scientific	34080
Triton X-100	Thermo Fisher Scientific	BP151-500
Trypsin	Corning	MT25053CI
Tween-20	Thermo Fisher Scientific	BP337