Abstract
Трофобласта стволовые клетки (TSCS) возникают как следствие первого решения клеточных судеб в развитии млекопитающих. Их можно культивировать в лабораторных условиях , сохраняя при этом способность к самообновлению и дифференцироваться во все подтипы трофобласта линии, что эквивалентно в естественных условиях популяции клеток, приводящее к фетальной части плаценты стебля. Поэтому TSCS предлагают уникальную модель для изучения развития плаценты и эмбриональных против внеэмбриональной решения клеточных судеб в пробирке. От стадии бластоцисты года, особым местом эпигенетическое барьер, состоящий из метилирования ДНК и модификации гистонов плотно отделяет оба родословных. Здесь мы опишем протокол, чтобы полностью преодолеть этот барьер с помощью клонов переходного процесса избыточная экспрессия трофобласта ключевых регуляторов Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 в мышиных эмбриональных фибробластов. Индуцированные трофобласта стволовые клетки способны к самообновлению и почти идентичны БЛАСТОЦИСТНОЙ производных трофобласта стволовых клеток яп по морфологии, экспрессии генов и маркеров метилирования. Функциональная в пробирке и в естественных условиях анализов подтверждают , что эти клетки способны дифференцироваться трофобласт родословная генерации полиплоидных трофобласта гигантские клетки и chimerizing плаценту при введении в бластоцисты. Индукция трофобласт стволовых клеток из соматических тканей открывает новые возможности для изучения генетических и эпигенетических характеристик этой внеэмбриональной линии и предлагает возможность генерировать линии трофобласт стволовых клеток без разрушения соответствующего эмбриона.
Introduction
В последнее время, исследование, сравнивая несколько подходов эмбриональных стволовых клеток мыши, чтобы трофобласта превращение стволовых клеток показало, что во всех анализируемых систем, преобразование родословная оставалась незавершенной. Вместо индуцированных стволовых клеток трофобласта (iTSCs) так называемые трофобласта стволовые клетки , как клетки были сгенерированы сохраняя память о клеточной судьбы происхождения 1. Здесь мы следовали другой подход генерации ITSC. По аналогии с прямой индукции плюрипотентных стволовых клеток из мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) 2, iTSCs были непосредственно преобразованы из дифференцированной соматической ткани. Во-первых, мы определили 12 факторов, побуждающие кандидатов TSC судьбу, когда избыточно экспрессируется в MEFs. В дальнейшем, факторы Tfap2c, Gata3, Eomes и ETS2 были идентифицированы , чтобы быть необходимым и достаточным для индукции ITSC 3. Одновременно другая группа независимо друг от друга нашли Tfap2c, Gata3 и Eomes быть достаточным для превращения MEFs в iTSCs. Тем не менее, в том, чтоИсследование, время , необходимое для трансгенной экспрессии значительно больше по сравнению с нашего исследования, что указывает на различные кинетики конверсии, когда ETS2 отсутствует в трансдифференцировку коктейль 4.
Обычные фетальной бычьей сыворотки (FBS) , содержащей культуру индуцированных и бластоцисты полученных трофобласта стволовых клеток зависит от наличия факторов , секретируемых роста инактивированной MEFs 5,6. Во время индукции ITSC эти факторы обеспечиваются MEFs, которые испытывают недостаток в полной мере сочетание трансгенов и не подвергающихся трансдифференцировку. Тем не менее, как только отдельные колонии ITSC являются субкультивироваться, они требуют средств массовой информации, которые были выдержано ростом инактивированной MEFs. С этого момента, iTSCs могут быть выращены и обработаны как бластоцисты получены TSC, в соответствии со стандартными протоколами. Следует отметить, что в отличие от Tanaka и др. , 5, мы обычно культуры TSC , и iTSCs без желатинирования клеточной культуры блюда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты мыши были проведены в соответствии с немецким законом защиты животных и по согласованию с одобрения местных комитетов по уходу за институциональное животных (Landesamt FUER Natur, Umwelt унд Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия [одобрение ID номер: AZ 84-02.04.2013 .A428]).
1. Подготовка СМИ
- Подготовка 293T среды: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), 10% (об / об) FBS, L-глутамином (2 мМ), пируват натрия (1 мМ), пенициллин / стрептомицин (1x).
- Подготовка MEF среды: DMEM, 10% (об / об) FBS, L-глутамина (2 мМ), 1x несущественные аминокислоты, пенициллин / стрептомицин (1x).
- Готовят среду TS (W / O FGF4 / гепарин): Roswell институт Мемориальный парк среда (среда RPMI) 1640, 20% (об / об) FBS (стволовых клеток культуры класс), пенициллин / стрептомицин (1x), L-глутамина (2 мМ ), пируват натрия (1 мМ), 2-меркаптоэтанол (0,1 мМ).
- Готовят среду TS с FGF4 / гепарина (Ts + F4H): RPMI 1640, 20% (об / об) FBS (стволовые клеткикультура сорта), пенициллин / стрептомицин (1x), L-глутамина (2 мМ), пируват натрия (1 мМ), 2-меркаптоэтанол (0,1 мМ), 25 нг / мл FGF4, 1 мкг / мл гепарина.
Примечание: FGF4 и гепарин добавлены непосредственно в средах непосредственно перед использованием. - Готовят TS-CM с FGF4 / гепарином (TS-СМ + F4H): 70% МЕФ кондиционером TS среда + 30% свежеприготовленный Т.С. среда + 25 нг / мл FGF4, 1 мкг / мл гепарина.
Примечание: FGF4 и гепарин добавлены непосредственно в средах непосредственно перед использованием. - Подготовка среды для трансфекции: Расширенный DMEM, 2% (об / об) FBS (стволовых класс культура клеток), L-глутамина (2 мМ), пенициллин / стрептомицин (1x).
- Готовят Вирус-продуцирующей среде: Advanced DMEM, 5% (об / об) FBS (стволовых класс культура клеток), L-глутамина (2 мМ), пенициллин / стрептомицин (1x).
2. Мышиные Эмбриональные Фибробласт Выведение
- Установка приуроченная вязки с использованием масс 129S2SV самок и самцов мышей , гомозиготных R26 :: rtTA (название штамма; B6.Cg-Гт (ROSA) 26Sor TM1 (rtTA* М2) Jae / J 7). На E13.5 мышей жертвенных шейным смещением и изолировать первичных мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в соответствии со стандартными протоколами 8. Затем пластины клетки из одного эмбриона на 150 мм блюдо в MEF средах.
- После того, как первичные MEF культуры достигают слитности на 150 мм чашки, мыть клетки дважды с 10 мл PBS и добавляют 4 мл 0,05% раствора трипсина / ЭДТА. Инкубируйте блюда в течение 3 - 4 мин в инкубаторе при температуре 37 ° C.
- После проверки инкубационного если клетки отрываются от чашки с помощью инвертированного микроскопа (с использованием 10-кратным объективом). Добавьте 5 мл MEF средств массовой информации, чтобы остановить трипсинизации и собирать суспензии клеток в 50 мл коническую трубку.
- Бассейн суспензии клеток из нескольких блюд и собирают в 50 мл коническую трубку. Суспензию клеток Центрифуга в течение 3 мин при 200g и 10 ° C.
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок клеток в ФБС, содержащем 10% (об / об) диметилсульфоксида. Замораживание MEFs в аликвоты для дальнейшего использования.
Примечание: В качестве альтернативы, используйте дикий станде первичные MEFs; Тем не менее, дополнительный лентивирусов вектор выражения rtTA должен быть трансдуцированных вместе с другими лентивирусными векторами (например , с использованием плазмиды FUdeltaGW-rtTA , описанный Maherali и др. 9). - Получение MEF-кондиционированной среды TS
Примечание: До экспериментов по конверсии, MEF кондиционером (CM) TS СМИ должен быть подготовлен, который требуется для субкультуры отдельных линий ITSC (описанных в разделе 6).- Пластина 1 х 10 7 митотически инактивированных МЭФ на 150 мм блюдо в MEF среде на желаемое количество блюд. Деактивированы MEFs от гамма-облучения дозой 9 Гр.
Примечание: Выход на 150 мм блюдо составляет около 60 мл СМ. - На следующий день после посева, аспирация и отбрасывать MEF среды и добавляют 20 мл свежеприготовленную среду TS (без FGF4 / гепарин) на каждую чашку митотически инактивированы MEFs и место тарелки обратно в инкубатор при температуре 37 ° С.
- После инкубированиясреда TS в течение трех дней на митотически инактивированных МЭФ, собирают среду в 50 мл конические пробирки. Фильтрующий материал, через фильтр с размером пор 0,2 мкм и продолжить 2.6.4. Заменить CM 20 мл свежей среды TS для получения дополнительной партии СМ.
Примечание: митотически инактивированных МЭФ может быть использован для подготовки CM до трех раз. - Алиготе 35 мл фильтрованной CM в 50 мл конические пробирки и хранят при -20 ° C до необходимости. После размораживания, добавляют 15 мл свежеприготовленного среды TS, чтобы получить 70% TS-CM и хранить при температуре 4 ° С в течение до одного месяца.
- Пластина 1 х 10 7 митотически инактивированных МЭФ на 150 мм блюдо в MEF среде на желаемое количество блюд. Деактивированы MEFs от гамма-облучения дозой 9 Гр.
3. Лентивирусов Вектор Производство в клетках 293Т
Примечание: Все этапы проводятся в лабораторных помещений лицензию на уровень биологической безопасности 2.
- До начала экспериментов по конверсии, подготовить лентивирусов векторов для доксициклина (DOX) в зависимости избыточная экспрессия Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2 и mCherry. Для каждого лентивирусов, клетки 293T совместно трансфекцию с использованиемСоответствующий лентивирусов вектор переноса вместе с упаковочной плазмиды и VSV-G экспрессии оболочки плазмиды (плазмиды информация приведена в таблице материалов).
Примечание: Для получения полезной информации , касающейся производства вируса относятся к ГАВРИЛЕСКУ и др. 10. Хотя он описывает производство ретровирус, общие комментарии относительно качества 293T клеток и ДНК плазмиды справедливы для лентивирусов производства, а также.
ВНИМАНИЕ: необходимо принять соответствующие меры безопасности при работе с лентивирусов векторов и работа должна быть выполнена в уровень биологической безопасности 2 объекта. - Шерсть пять 100 мм чашки с поли-L-лизин (100 мкг / мл) раствора, покрывая посуду с 5 мл раствора и осторожно качалки для равномерного распределения раствора для нанесения покрытия. Поместите посуду обратно в инкубатор при температуре 37 ° С в течение 30 мин. Через 30 мин раствор аспирата покрытия и полоскать посуду один раз PBS.
- Пластина 7 × 10 6 293T клеток на чашку в 10 мл 293T-клеточных сред, сВирл блюда, чтобы равномерно распределить клетки и помещать посуду обратно в инкубатор при температуре 37 ° С.
- На следующее утро, заменить среду для роста с 5 мл среды трансфекции. Добавить 6 мкл 1,000x запаса раствора хлорохина (25 мМ) и поместите блюда обратно в инкубатор при температуре 37 ° C.
- В то же время, подготовить трансфекции смесь:
- Для каждого лентивирусов вектора подготовить два 5 мл реакционных труб, маркированных как А и В.
- Добавить 600 мкл 2x HEPES-солевой буфер (ОБД) к трубке А.
- В трубке В смеси 61,5 мкл CaCl 2 раствор (2 М), с 18,5 мкг lentivector ДНК и 9,25 мкг psPAX2 и 9,25 мкг pMD2.G. Регулировка громкости до 600 мкл стерильной культуры класса H 2 O.
- Добавить раствор из трубки B по каплям к трубе А в то время как встряхиванием. Выдержите смесь для трансфекции в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить смесь трансфекции очень осторожно по каплям к подготовленным 293Т на 100 мм блюдо.осле 5 до 6 часов удалить среду и заменить 10 мл вируса-продуцирующей среды. Поместите посуду обратно в инкубатор при температуре 37 ° С.
Примечание: Будьте осторожны при снятии и замене среды, так как клетки 293T легко отделяться от тарелки. Среднее изменение 5-6 ч после трансфекции имеет решающее значение, так как длительное воздействие хлорохина является токсичным для клеток. - На следующее утро, осторожно снимите и выбросьте среднего и заменить 7 мл вируса-производственной среды.
- На следующее утро собрать первую партию вируса, содержащего среду. Отберите среднего и собирают в 15 мл коническую трубку. Опять же, добавить 7 мл вируса-продуцирующей среды на клетки. Хранить содержащую вирус среду в холодильнике, пока вторая партия не будет собран на следующий день.
- На следующее утро аспирация вторую партию вируса, содержащего среду добавлением его в 15 мл коническую пробирку, содержащую первую партию. 293T-клетки теперь могут быть отброшены. Фильтр содержащую вирус среду через Сур 0,45 мкм-активного вещества, свободной от ацетата целлюлозы -membrane фильтр. Аликвоты отфильтровывали, содержащую вирус среду и хранят при -80 ° C для дальнейшего использования.
Примечание: производство Вирус также может быть выполнена в 6-луночных планшетах. Шкала вниз объемов и количества клеток соответственно.
4. Фибробласт Трансдукция 4 Факторы и mCherry управления Вектор
Примечание: Все шаги выполняются в уровень биологической безопасности 2 объекта.
- Для схематического представления экспериментального контура см на фиг.1. Растаяйте одну аликвоту первичных rtTA-MEFs и пластины 3,33 х 10 5 клеток на лунку 6-луночного блюдо в общем объеме 2 мл MEF сред. Подготовьте по крайней мере, 3 скважины и маркировать их с 4-мя факторами (4F), mCherry и контроля.
Примечание: В качестве альтернативы, дикие MEFs типа могут быть использованы, когда rtTA выражения лентивирусов вектор добавляется к lentivector коктейль во время шага 4.2. - На следующий день после того, как клетки полностью оправился от cryopreдля консервации, заменить MEF СМИ в трех 6-ти скважин с 0,6 мл (4F), 0,9 мл (mCherry) и 1 мл (контроль) трансдукции СМИ, соответственно. Оттепель один аликвоту PLV-Teto-Tfap2c, -Gata3, -Eomes, -ets и -mCherry вируса при комнатной температуре и добавляют 100 мкл каждого вируса, содержащего супернатанта (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) в 4F хорошо.
Примечание: В случае MEFs дикого типа, уменьшить объем preplated сред на 100 мкл и дополнительно добавляют 100 мкл вируса FUdeltaGW-rtTA, содержащего супернатанта к смеси 4F. - Добавьте 100 мкл mCherry вируса средах, содержащих к колодцу метили mCherry. Добавить полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл в каждую лунку. Поместите блюдо обратно в инкубатор при температуре 37 ° С и инкубировать MEFs O / N с вируссодержащей супернатант.
Примечание: В случае MEFs дикого типа, уменьшить объем preplated сред на 100 мкл и дополнительно добавляют 100 мкл FUdeltaGW-rtTA вируса, содержащего супернатанта. - На следующее утро, осторожно удалитевируссодержащих средства массовой информации и мыть три раза с 2 мл PBS. Наконец, добавьте 2 мл TS носителя (без FGF4 / гепарин).
Примечание: Трансдуцированные MEFs может быть либо непосредственно использоваться для ITSC индукционных экспериментов или замораживают для дальнейшего использования.
5. Фибробласт к конверсии ITSC
Примечание: Все этапы проводятся в лабораторных помещений лицензию на уровень биологической безопасности 2.
- Промыть трансдуцированных MEFs дважды 2 мл PBS и после добавления 0,5 мл трипсин / ЭДТА раствор инкубировать их в инкубаторе в течение 3 - 4 мин. Проверьте под инвертированным микроскопом для надлежащего открепления клеток.
- Деактивировать трипсина путем добавления 1 мл среды TS. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку и центрифуги в течение 3 мин при 200 х г. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в 2 мл среды TS. Используйте untransduced контрольный образец для подсчета клеток.
- Тарелка 4F-MEFs, mCherry-MEFs и MEFs untransduced управления каждый с плотностью 2 × 10 5клеток на 100 мм для культивирования клеток блюдо в 10 TS мл среды, содержащей 2 мкг / мл DOX (среда TS + FGF4 / гепарин + DOX).
- В качестве альтернативы, выполнить трансдифференцировку на небольших блюд. Пластина 3,6 × 10 3 клеток на см 2 от желаемого размера тарелки, объема шкалы соответственно.
- На следующий день, с использованием эпифлуоресцентной микроскопа (с использованием 10-кратным объективом и фильтр, пригодный для красного флуоресцентного возбуждения) осуществляет контроль за экспрессию белка mCherry с целью оценки эффективности трансдукции.
Примечание: эффективность трансдукции должна быть близка к 100%. Если увеличена гибель клеток очевидно после индукции трансгенной это означает, что титр вируса была слишком высока. Трансдукция следует повторить с уменьшенным количеством вируссодержащей среды. - С этого момента изменения средств массовой информации на все блюда каждый день до 10-й день после посева. После этого, кормить клетки со средней TS без DOX (среды TS + FGF4 / гепарин).
- С помощью инвертированного микроскопа, монитор дляПоявление 'transdifferentiated областей' (см рис 2B и С) на 4F блюдо на срок до 3 -х недель. Такие колонии не должны быть видны на двух блюд управления (mCherry-MEFs и untransduced MEFs).
6. Выделение отдельных линий ITSC
Примечание: На шаге 6.3 капот культуре ткани не требуется. Рекомендуется протереть инвертированный микроскоп с 70% -ным этанолом, чтобы свести к минимуму вероятность бактериального загрязнения. Отдельные колонии ITSC могут быть изолированы между днями 21 и 28 дней трансдифференцировки.
- Добавьте 40 мкл 0,05% раствора трипсина / ЭДТА в 12 лунки 96 U-образным дном блюдо хорошо и поставить блюдо на льду.
- До выделения колонии, аспирация среды на 4F-MEF трансдифференцировку блюдо. Промыть клетки один раз с помощью 10 мл PBS. Опять же, добавить 10 мл PBS и место блюдо под инвертированным микроскопом.
- С помощью 100-мкл пипетки набор 40 мкл поднимите отдельных колоний, на сircling их кончиком пипетки и аспирационных плавающую колонию. Передача клетки одной колонии каждый в одну лунку готовое блюдо 96-луночного. После сбора 12 колоний место 96-луночного блюдо в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 мин.
- Диссоциируют клетки пипетированием вверх и вниз несколько раз и приостановки передачи клеток в одну лунку 24-луночного блюдо с подготовленными 500 мкл среды TS-CM (30% свежей TS среда + 70% CM + FGF4 / гепарин).
- На следующий день заменить среду со свежим TS-CM среды для удаления мертвых клеток. Изменение среднего каждый день.
- Монитор для появления эпителиальных колоний с яркими границами (см рисунок 2). После того, как появляются колонии, культуры до 70% сплошности или в течение одной недели и постепенно расширить свое присутствие на большие блюда. С этого момента, культуры клеток в качестве добросовестных TSC , в соответствии со стандартными протоколами в средах , содержащих сыворотки или в свободной от сыворотки, определенных средах 3,5,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На блюде , где трансген выражение 4F активизирован, клетки быстро изменить морфологию (сравните рисунок 2А и В). Вокруг день 14 - 21 различных областей transdifferentiated появляются (два примера приведены на рисунке 2В и С). Эти первичные колонии не имеют типичную морфологию TSC; Однако , как только они субкультивироваться, характерные эпителиальной морфологии с плотными краями и яркими границами очень напоминает добросовестных TSC , возникает (рис 2D). 4F-iTSCs пятно положительным для трофобласта факторов транскрипции CDX2 и Tfap2c (рис 2E). Эти линии ITSC теперь могут быть использованы для последующего в пробирке или в естественных условиях анализа, то есть в пробирке дифференциации анализов или плацентарные экспериментов химер.
Рисунок 1. Хронология MEF до ITSC преобразования. Графическое представление трансдифференцировкой MEFs в iTSCs. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель Изменения морфологии Во время MEF к ITSC конверсии.
(А) Микрофотография rtTA-MEFs. (B) Микрофотография transdifferentiated 4F-MEFs. Пример transdifferentiated области, выделены красным цветом. (C) Пример 2 из transdifferentiated колонии на 21 день трансдифференцировки после десяти дней DOX индукции в 4f-MEFs. Область подходит для суб-культивированием выделены красным цветом. (D) Микрофотография 4F-iTSCs после того, как к югу от культивированием. Все масштабные линейки указывают на 100 мкм. Изображения были тAken на инвертированный микроскоп с использованием 10-кратным объективом и фазового контраста. (E) Иммунофлуоресценции окрашивание против факторов транскрипции CDX2 и Tfap2c в 4f-iTSCs. Ядра окрашиваются Hoechst. Масштабные полоски показывают 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
4 фактора (Tfap2c, Gata3, Eomes, ETS2) на основе протокола трансдифференцировка, представленный здесь предлагает надежный метод для создания точно конвертирована iTSCs из эмбриональных фибробластов мыши. Кроме того, способ также применим для послеродовых хвостовых фибробласты, хотя и с падением эффективности по сравнению с эмбриональными фибробластами 3. В целом, качество первичных фибробластов является решающим фактором исхода и ухода трансдифференцировку должны быть приняты, чтобы использовать ранние прохождение клеток (пассаж от двух до трех).
Сила этого протокола является использование доксициклина-индуцируемых векторы, которые допускают временной контроль экспрессии трансгена. Это дает возможность генерации стабильных линий ITSC, которые активируют эндогенный фактор транскрипции сети, поддерживая TSC судьбу независимо от экспрессии трансгенов. Это в отличие от ранее опубликованных протоколов, описывающих индукцию TSC судьбы из эмбриональных стволовых клеток, метод тхат на сегодняшний день только дает неполностью перепрограммирован трофобласт стволовых клеток , как клетки 1.
Тем не менее, известное ограничение протокола, описанного здесь является переменное число новых transdifferentiated колоний, что делает его трудно предсказать эффективность трансдифференцировку. Эти ограничения обусловлены несколькими сильно изменчивых факторов, которые имеют решающее значение для исхода трансдифференцировку: эффективность трансдукции отдельных лентивирусов векторов, количество пролиферации исходного клеточной популяции, а количество клеточной гибели во время трансдифференцировки. При некоторых обстоятельствах transdifferentiated ITSC колонии не появляются. В этом случае средства массовой информации и реагенты должны быть проверены на их способности поддерживать подлинную культуру TSC, перед их использованием в производстве ITSC. Кроме того, трансдукция с 4F можно титровать, так как слишком больших количеств трансгенной экспрессии приводят к гибели клеток. В общем, к югу от культивированием отдельных ITSC лИнес требует некоторой практики. В случае, когда возникают трудности с субкультуры iTSCs (то есть., Субкультивироваться клетки неспособны поддерживать самообновление и вместо того, чтобы спонтанно дифференцироваться), одиночные изолированные колонии могут быть альтернативно высевали на чашки с 50% плотности клеток роста инактивированной фидера клетки для поддержания роста и присоединение клеток. Линии ITSC можно затем постепенно отучить от кормушек во время последующего пассирования. Следует отметить, что нам не удалось непосредственно конвертирование MEFs в iTSCs с использованием определенных условий TX средних, поскольку TX среда поддерживает только установлены ITSC / TSC линии.
До сих пор протокол ITSC индукции из фибробластов устанавливается только для мышиных клеток. Следовательно, теперь он будет представлять большой интерес адаптировать этот протокол к другим видам и включить вывод ITSC линий от модельных систем человека или других. Кроме того, анализ точных механизмов фибробласте конверсии ITSC будет предлагать новые знания о природесоматического по сравнению с экстра-эмбриональных барьера клонального и помощи в понимании принципов определения судьбы клеток во время нормального и патологического развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-10G | Dissolve in sterile PBS, prepare 2 mg/ml stock solution. Store aliquots at -20 °C |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Prepare 25 mM stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Prepare 8 mg/ml stock solution in sterile cell culture grade water. Store aliquots at -20 °C |
| human recombinant Fibroblast Growth Factor 4 | ReliaTech | 300-131L | Dissolve in sterile 0.1% BSA in PBS, prepare 25 µg/ml stock solution. Store aliquots at -80 °C |
| Heparin sodium salt | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving in sterile PBS. Store aliquots at -80°C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, no glutamine | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03IR | |
| Surfactant-free cellulose acetate-membrane filter | Corning | 431220 | |
| Non-essential amino acids | ThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), cell culture grade | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgene | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgene | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgene | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgene | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mice B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mice | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
References
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538 (2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Kubaczka, C., et al. Direct Induction of Trophoblast Stem Cells from Murine Fibroblasts. Cell Stem Cell. 17 (5), 557-568 (2015).
- Benchetrit, H., et al. Extensive Nuclear Reprogramming Underlies Lineage Conversion into Functional Trophoblast Stem-like Cells. Cell Stem Cell. 17 (5), 543-556 (2015).
- Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4. Science. 282 (5396), 2072-2075 (1998).
- Erlebacher, A., Price, K. A., Glimcher, L. H. Maintenance of mouse trophoblast stem cell proliferation by TGF-beta/activin. Dev Biol. 275 (1), 158-169 (2004).
- Hochedlinger, K., Yamada, Y., Beard, C., Jaenisch, R. Ectopic expression of Oct-4 blocks progenitor-cell differentiation and causes dysplasia in epithelial tissues. Cell. 121 (3), 465-477 (2005).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. (10), e550 (2007).
- Kubaczka, C., et al. Derivation and Maintenance of Murine Trophoblast Stem Cells under Defined Conditions. Stem Cell Rep. 2 (2), 232-242 (2014).
