Hier präsentieren wir ein Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in voll funktionsfähige und stabile Trophoblasten-Stammzellen durch zehntägige Überexpression von Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2.
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Methodenartikel
Protokoll für die direkte Umwandlung von murinen embryonalen Fibroblasten in Trophoblast Stammzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Trophoblast Stammzellen (TSZ) entstehen als Folge der ersten Zellschicksal Entscheidung in Säugetierentwicklung. Sie können in vitro kultiviert werden, die Fähigkeit zur Selbsterneuerung zu halten und in alle Subtypen des Trophoblasten lineage, äquivalent zu der in vivo zu differenzieren , um den fetalen Teils der Plazenta - Zellpopulation stammen führt. Deshalb bieten TSCs ein einzigartiges Modell Entwicklung der Plazenta und embryonale gegen außer embryonale Zellschicksal Entscheidung in vitro zu studieren. Von der Blastozysten-Stadium ab, eine deutliche bestehend epigenetische Barriere von DNA-Methylierung und Histon-Modifikationen trennt eng beide Linien. Hier beschreiben wir ein Protokoll um alle Funktionen der Linie Barriere durch transiente Überexpression von trophoblast Schlüsselregulatoren überwinden Tfap2c, Gata3, Eomes und Ets2 in murinen embryonalen Fibroblasten. Die trophoblast induzierten Stammzellen sind in der Lage selbst zu erneuern und sind nahezu identisch abgeleitet trophoblast Stammzellen Blastozyste in Bezug auf die Morphologie, Marker Genexpression und Methylierungsmuster. Funktionelle in vitro und in vivo - Assays bestätigen , daß diese Zellen entlang der Trophoblast lineage Erzeugung polyploid Trophoblasten Riesenzellen und chimerizing die Plazenta , wenn sie in Blastozysten injiziert zu differenzieren können. Die Induktion von Trophoblast Stammzellen aus somatischen Gewebe eröffnet neue Wege genetischen und epigenetischen Merkmale dieser extraembryonale Linie zu studieren und bietet die Möglichkeit, trophoblast Stammzelllinien ohne Zerstörung des jeweiligen Embryo zu erzeugen.
Einleitung
Vor kurzem wurde eine Studie mehrere Ansätze von embryonalen Maus-Stammzellen zu vergleichen Stammzellen Umwandlung in Trophoblasten hat ergeben, dass in allen untersuchten Systemen Linie Umwandlung unvollständig geblieben. Anstelle von induzierten Trophoblasten Stammzellen (iTSCs) so Trophoblast Stammzellen-ähnliche Zellen genannt wurden generiert 1 einem Speicher des Zellschicksals Herkunftshalte. Hier verfolgen wir einen anderen Ansatz der ITSC Generation. Ähnlich wie bei der direkten Induktion von pluripotenten Stammzellen , die aus murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) 2, haben iTSCs wurde von differenzierten somatischen Gewebe direkt umge....
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Protokoll
AZ 84-02.04.2013: Alle Maus-Experimente wurden mit der Zustimmung der lokalen institutionellen Tierpflegegremien (Landes fuer Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, Nordrhein-Westfalen [Zulassungs ID-Nummer nach dem deutschen Gesetz des Tierschutzes und im Einvernehmen durchgeführt .A428]).
1. Medienvorbereitung
- Bereiten 293T-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), Natriumpyruvat (1 mM), Penicillin / Streptomycin (1x).
- Bereiten MEF Medium: DMEM, 10% (v / v) FBS, L-Glutamin (2 mM), 1x nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin / Streptomycin (1x).
- Bereiten TS-Med....
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Ergebnisse
Auf der Schale , wo die transgene Expression des 4F aktiviert wird, ändern sich Zellen schnell Morphologie (2A und B vergleichen). Um Tag 14-21 verschiedene transdifferentiated Bereiche entstehen (zwei Beispiele in 2B und C angegeben sind). Diese primären Kolonien fehlen typische TSC Morphologie; aber sobald sie subkultiviert, charakteristisch epitheliale Morphologie mit engen Kanten und helle Grenzen erinnert stark an bona fide TSCs entsteht (2D.......
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Diskussion
Das 4-Faktor (Tfap2c, Gata3, Eomes, Ets2) auf der Basis transdifferentiation Protokoll hier vorgestellten bietet eine zuverlässige Methode treu zu erzeugen umgewandelt iTSCs von embryonalen Maus-Fibroblasten. Ferner ist das Verfahren auch für die postnatale tail Fibroblasten, allerdings mit einem Rückgang der Effizienz 3 embryonale Fibroblasten im Vergleich zu. Im allgemeinen Qualität der primären Fibroblasten ist ein kritischer Faktor transdifferentiation Ergebnis und Sorgfalt sollte frühen Passage-Zellen (P.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Doxycyclinhyclat | Sigma-Aldrich | D9891-10G | In sterilem PBS auflösen, 2 mg/ml Stammlösung herstellen. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C |
| Chloroquin-Diphosphat-Salz | Sigma-Aldrich | C6628-25G | Bereiten Sie eine 25 mM Stammlösung in sterilem Wasser in Zellkulturqualität vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C |
| Polybren (Hexadimethrinbromid) | Sigma-Aldrich | 107689-10G | Bereiten Sie 8 mg/ml Stammlösung in sterilem Wasser in Zellkulturqualität vor. Lagern Sie Aliquots bei -20 > C |
| humaner rekombinanter Fibroblasten-Wachstumsfaktor 4 | ReliaTech | 300-131L | In sterilem 0,1% BSA in PBS auflösen, vorbereiten 25 &; Mikro; g/ml Stammlösung. Lagern Sie Aliquots bei -80 &de; C |
| Heparin-Natriumsalz | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | 1 mg/ml Stammlösung durch Auflösen in sterilem PBS herstellen. Lagern Sie Aliquots bei -80 Grad; C |
| ProFection Mammalian Transfection System | Promega | E1200 | |
| PBS, ohne Calcium, ohne Magnesium | ThermoFisher Scientific | 1419-094 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 31966-021 | |
| RPMI 1640, ohne Glutamin | ThermoFisher Scientific | 31870-025 | |
| Advanced DMEM (1x) | ThermoFisher Scientific | 12491-015 | |
| Trypsin-EDTA (0,05%), Phenolrot | ThermoFisher Scientific | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysin | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| Fötales Rinderserum | Hyklon | SH30071.03IR | |
| Tensidfreier Celluloseacetat-Membranfilter | Corning | 431220 | |
| Nicht-essentielle | AminosäurenThermoFisher Scientific | 11140-035 | |
| Penicillin Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | |
| Natriumpyruvat | ThermoFisher Scientific | 11360-039 | |
| L-Glutamin | ThermoFisher Scientific | 25030-24 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 31350-010 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO), Zellkulturqualität | Panreac AppliChem GmbH | A3672,0100 | |
| pLV-tetO-Tfap2c | Addgen | 70269 | |
| pLV-tetO-Gata3 | Addgen | 70270 | |
| pLV-tetO-Eomes | Addgen | 70271 | |
| pLV-tetO-Ets2 | Addgen | 70272 | |
| pLV-tetO-mCherry | Addgene | 70273 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G | Addgen | 12259 | |
| FUdeltaGW-rtTA | Addgene | 19780 | |
| Mäuse B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1(rtTA*M2)Jae/J 7 | JAX Mäuse | 6965 | |
| 129S2SV | Charles River | 129 |
Referenzen
- Cambuli, F., et al. Epigenetic memory of the first cell fate decision prevents complete ES cell reprogramming into trophoblast. Nat commun. 5, 5538(2014).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent....
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Nachdrucke und Genehmigungen
