RNA-Interferenz-basierte Untersuchung der Funktion von Heat Shock Protein 27 während Hornhautepithels Wundheilung

Zusammenfassung

Hierin präsentieren wir ein Protokoll zur Verwendung von Hitzeschockprotein 27 (HSP27)-spezifischer kleiner interferierender RNA, um die Funktion von HSP27 während der Wundheilung im Hornhautepithel zu beurteilen. RNA-Interferenz ist die beste Methode, um die Genexpression effektiv auszuschalten, um die Proteinfunktion in verschiedenen Zelltypen zu untersuchen.

Zusammenfassung

Small interfering RNA (siRNA) gehört zu den am weitesten verbreiteten RNA-Interferenzmethoden für das kurzfristige Silencing von proteinkodierenden Genen. siRNA ist ein synthetischer RNA-Duplex, der entwickelt wurde, um spezifisch auf ein mRNA-Transkript abzuzielen, um dessen Abbau zu induzieren, und es wurde verwendet, um neue Wege in verschiedenen zellulären Prozessen zu identifizieren. Es gibt nur wenige Berichte über die Rolle des phosphorylierten Hitzeschockproteins 27 (HSP27) bei der Wundheilung im Hornhautepithel. Hierbei wurden kultivierte humane Hornhautepithelzellen in eine verschlüsselte Kontroll-siRNA-transfizierte Gruppe und eine HSP27-spezifische siRNA-transfizierte Gruppe unterteilt. Anschließend wurden Scratch-induzierte gerichtete Wundassays, Western Blot und Durchflusszytometrie durchgeführt. Wir schließen daraus, dass HSP27 eine Rolle bei der Heilung von Hornhautepithelwunden spielt, die die Apoptose und Migration von Epithelzellen beinhalten könnte. Hier werden Schritt-für-Schritt-Beschreibungen der Probenvorbereitung und des Studienprotokolls zur Verfügung gestellt.

Einleitung

Hornhautepithelzellen (LME) werden kontinuierlich in Tränenfilm vergossen, während sie von Zellen aus dem Limbus und Hornhautepithels basalen Schichten gleichzeitig ersetzt werden. ¹ Verschiedene extrinsische Stressoren können die Apoptose und Schuppung der LME induzieren. ² Die Hitzeschockproteine (HSP) hoch konserviert und können in zwei Familien nach Molekülgrße unterteilen. ³ die größte Familie HSP umfasst HSP90, HSP70 und HSP60, und die kleinere Familie umfasst HSP27. ⁴ ist die Phosphorylierung von HSP27 ist bekannt , eine wichtige Rolle in Zellüberleben zu spielen und ist für die Zellmigration erforderlich wegen der Rolle dieses Proteins in die Aktin - Umbildung. ^5-7 Daher wir die mögliche Rolle von HSP27 - Phosphorylierung in CEC Migration und Apoptose in einem in vitro - Modell von epithelialen Wundheilung zu testen versucht.

RNA-Interferenz (RNAi) entweder kleiner oder short interfering RNAs (siRNA) mit GEnerated Interesse sowohl in der Grundlagen- und angewandten Biologie, da sie möglicherweise die Expression jedes Gens von Interesse erlaubt zerlegten werden. ⁸ Hier haben wir HSP27-spezifische siRNA , den Beitrag von HSP27 CEC Wundheilung und Apoptose zu bewerten. Traditionelle RNAi Methoden für die Gen-knock-down in Zellen verwenden synthetische RNA-Duplexe, darunter zwei unmodifizierten 21-mer Oligonukleotide, die zusammengesetzt werden können siRNAs zu erstellen. Die RNAi siRNA, die wir in dieser vorliegenden Untersuchung verwendet wird, ist eine einfache und hocheffiziente Methode, um Zellen zu transfizieren, und dieses Reagens arbeitet mit verschiedenen immortalisierten Zelllinien. In der vorliegenden Studie zeigen wir die Methoden für diese Analyse verwendet, einschließlich eines Kratzers induzierten Richtungs Wunden-Assay, Western Blot, siRNA-Transfektion Assay, Immunfluoreszenztest und Durchflusszytometrie.

Protokoll

1. Zelllinie

1. Kultur 10 ⁶ Telomerase-immortalisierten humanen Cornea - Epithelzellen (hCEC) in einer 6-Well - Platte (Dichte: 1039,9 Zellen / mm ²⁾ in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre unter Verwendung bronchiale Epithel - Wachstumsmedium (BEGM) bis sie erreichen 95% Konfluenz.

2. Western-Blot-Analyse nach Epithelial Scratch Wunden Erstellen

1. Streak eine sterile 200 ul Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluierender kultiviert hCEC viermal pro Schale in einem biologischen Sicherheitsschrank (Klasse II, Typ A2) und Inkubation hCEC separat in einem 37 ° C Inkubator mit einer 5% igen CO ₂ -Atmosphäre für 1, 5, 10, 30, 60 und 120 min.
2. Verwenden einer 6-Well-Platte für sechs verschiedene Proben nach der Inkubationszeit nach Hornhautepithels Verwundung.
3. Waschen Sie verwundete HCEC Monolayern dreimal mit 1x PBS und fügen Sie dann 2,0 ml BEGM in jede Vertiefung.
4. Nehmen Sie hCEC mit 2ml 0,25% Trypsin-(EDTA) pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
5. Suspend hCEC mit 1 ml 1x PBS und übertragen sie in ein 1,5-ml-Röhrchen.
6. Zentrifuge hCEC bei 10.000 × g für 15 Sekunden und absaugen 1x PBS unter Verwendung einer 1 ml Pipette.
7. Resuspendieren hCEC in 100 & mgr; l eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM EDTA, 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid [PMSF], Proteaseinhibitoren [1 uM Pepstatin A, 1 uM Leupeptin und 0,1 uM Aprotinin] und 0,5% Triton X-100 [pH 7]) und sie gut mischen.
8. Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren.
9. Centrifuge Lysate bei 4 ° C bei 10.000 × g für 15 Minuten, und dann Stände übertragen an die frische 1,5-ml-Röhrchen (90 & mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C.
10. Bestimmen Gesamtproteinkonzentrationen von Zelllysaten des Bradford pr mitotein Test. ⁹
11. Last 30 ug Gesamtzellproteine ​​in einen 10% oder 12% Acrylamid-Gel für Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und dann elektrophoretisch Übertragung getrennt Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C in Western-Blot-Assays verwendet werden.
12. Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären polyklonalen Kaninchen-Antikörper gegen nicht-phosphorylierten HSP27 (1: 1000 Verdünnung) oder primärem polyklonalem Kaninchen-Antikörper gegen phosphoryliertes HSP27 (1 : 1000 Verdünnung) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) und die Membranen bei 4 ° C auf einem Schüttler über Nacht inkubiert.
13. Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach dem Waschen für 10 min 3 mal mit TBST.
14. Inkubieren Sie die Membran in den Western-Blot Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur.
15. Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz.
16. Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen bedeckt Membran in einer Filmkassette mit Proteinseite nach oben zeigt.
17. Platzieren Röntgenfilm auf der Membran und freizulegen, für 1 min.

3. siRNA Transfection Assay ¹⁰

1. Kultur hCEC bei 5 × 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in einer 6-Well - Platte in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre unter Verwendung BEGM , bis sie 95% Konfluenz erreichen.
2. Man verdünnt das Transfektionsreagenz (2,5 oder 7,5 ul) mit 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium für die Transfektion (der Verdünnungsfaktor betrug 41 oder 14.3) und lösen die HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA in 100 & mgr; l reduziert Serum-Medium zu erstellen 10 oder 50 nM HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll-siRNA.
3. Mischungs 100 μ; L siRNA-Lösung mit 100 & mgr; l verdünnt Transfektionsreagenz (1: 1-Verhältnis) und die Mischung 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
4. Fügen Sie die siRNA-Lipid-Komplexe zu den Zellen. Dann nach 4 h Änderungsmedien BEGM abzuschließen und die Zellen für 2 Tage bei 37 ° C inkubieren.
5. Analysieren transfizierten Zellen mittels Western Blot, wie sich aus den Abschnitten 4.1 bis 4.7 beschrieben.

4. Western Blot - Assay für ¹¹ siRNA-transfizierten Zellen

1. Extrahieren Sie HSP27-spezifische und verschlüsselten Kontroll - siRNA-transfizierten hCEC in einem biologischen Sicherheitsschrank mit 100 ul eiskaltem Lysepuffer (10 mM Tris, 10 mM NaCl, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 25 mM NaF, 2 mM Na ₃ VO _4, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), Proteaseinhibitoren, und 0,5% Triton X-100, pH 7).
2. Inkubiere Zellen für 30 min auf Eis Zelllyse zu induzieren.
3. Pellet-Lysate bei 10.000 × g für 15 min und dann Überstand auf frische 1,5 ml Wanne übertragenes (90 & mgr; l-Aliquots) und lagern Sie sie bei -80 ° C.
4. Bestimmen Proteinkonzentrationen der Zelllysate des Bradford - Protein - Assay. ⁹
5. Belastungsproben mit gleichen Mengen an Gesamtzellproteine ​​auf einem 10% bzw. 12% Acrylamidgel unterziehen um das Gel SDS-PAGE und elektrophoretisch übertragen die abgetrennten Proteinbanden auf Nitrocellulosefilter mit einem 200 mA Strom für 1 h bei 4 ° C zu verwenden Sie in Western-Blot-Assays.
6. Block Nitrocellulose-Filtermembranen mit 5% Magermilch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST) für 1 h, hinzufügen primären Antikörper gegen phosphorylierte und nicht-phosphorylierte HSP27 (1: 1000 Verdünnung), phosphoryliertes Akt (1: 1000 Verdünnung), nicht-phosphoryliertem Akt (1: 1000 Verdünnung, als Zellüberlebensmarker verwendet), Bcl-2-assoziierten X-Protein (1: 1000 Verdünnung, als pro-apoptotische Protein verwendet) und Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; 1 : 200-Verdünnung, als Ladekontrolle) in 5% Rinderserumalbumin (BSA) verwendet, undbrüten die Membranen über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler.
7. Erkennen immunoreaktive Banden unter Verwendung von Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper (1: 10.000 Verdünnung) in 5% BSA nach 3-maligem Waschen mit TBST, 10 min jede Waschung.
8. Inkubieren der Membran in den Western-Blotting Luminol Reagenzien (6-7 ml pro 10 cm × 5 cm-Membran) für 1 min bei Raumtemperatur.
9. Entfernen Sie die Membran aus Reagenzlösung, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit mit einem saugfähigen Tuch, und in eine Plastikfolie Schutz.
10. Die Arbeit in einem dunklen Raum mit einem sicheren Licht, legen Sie die bedeckte Membran in einer Filmkassette mit der Proteinseite nach oben zeigt.
11. Platzieren Röntgenfilm auf der Oberseite der Membran und freizulegen, für 1 min.

5. Scratch-induzierte Directional Verwundung Assay Bewertung der Zellmigration ¹²

1. In einem biologischen Sicherheitsschrank, eine Wunde, indem sie mit einer sterilen Pipettenspitze über die Oberfläche eines gut konfluenter Kulturen ziehen vonHSP27-spezifische siRNA-transfizierten oder verschlüsselt Kontroll-siRNA-transfizierten hCEC.
2. Unmittelbar nach der Verwundung, wasche die Zellen zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und halten sie in BEGM Kulturen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre für 24 Stunden nach der Verwundung.
3. Fotografieren Sie HCEC Bilder einen aufrechten Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung 24 Stunden nach der Verwundung und führen mit Hintergrund Abflachen der Filter verwenden Befehl in die Bildanalyse-Software.
4. Mit dem Befehl Auswählen Messungen definieren Sie die Area of ​​Interest (AOI) mit der gleichen Größe polygonale Form, die sich von Ende senkrecht abdecken kann der anfänglichen Wunde zu beenden, und zu bestimmen, drei verschiedene AOI im verletzten Bereich jeder Probe.
5. zählen automatisch die Zellzahl in jedem Feld die Count / Größe Measure Menü-Optionen.

6. Durchflusszytometrie Analyse von Apoptosis

1. Kultur HSP27-spezifische siRNA-transfizierten und Kontroll siRNA-transfizierten hCEC jeweils 10 nM siRNA in einer Konzentration von 5 × 10 ⁵ Zellen enthält / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen bis die Zellen 95% Konfluenz in einer 37 ° C - Inkubator mit 5% CO ₂ -Atmosphäre in BEGM erreichen.
2. Nehmen Sie hCEC mit 2 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Vertiefung für 5 Minuten, Zentrifuge bei 900 xg für 5 min in einem 15-ml-Röhrchen und absaugen Trypsin-EDTA eine 1 ml Pipette.
3. Wasche die Zellen zweimal mit kaltem PBS und dann Resuspendieren der Zellen in 1x Bindungspuffer (0,1 M HEPES / NaOH [pH 7,4], 1,4 M NaCl, und 25 mM CaCl ₂₎ bei einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Transfer von 100 & mgr; l Zellsuspension (1 x 10 ⁵ Zellen) in einen 5 ml - Kulturröhrchen.
5. In 5 ul Fluoresceinisothiocyanat-konjugierten Annexin V und 5 ul Propidiumiodid.
6. Die Zellen vorsichtig vortexen und für 15 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
7. Mit 200 & mgr; l 1x Bindungspuffer in jedes Röhrchen und zu analysieren, um die Zellen durch einen Strömungs cytometer innerhalb 1 Stunde.

Ergebnisse

Die Expression von phosphoryliertem HSP27 signifikant bei 5, 10 erhöht, und 30 min nach der Verwundung scratch Vergleich zu unverwundeten hCEC ^13. Western - Blot - Analyse zeigte , dass die Expression von HSP27 phosphorylierten und phosphorylierten Akt waren beide signifikant reduziert, wohingegen die Expression von Bax signifikant in HSP27-spezifische siRNA-transfizierten hCEC (1A-E) erhöht wurde. Das phosphorylierte HSP27 - Expression wurde durch 30% und 40%...

Diskussion

In der vorliegenden Studie haben wir die potenzielle Rolle von HSP27 bei Hornhautepithelwunden mit Hilfe von in vitro Ansätzen untersucht. Die kritischen Schritte umfassten die siRNA-Transfektion für den HSP27-Knock-down, um die Funktion von HSP27 in Zellen zu beobachten, die Stress ausgesetzt waren. Insbesondere wurde durch diese Experimente eine Rolle von HSP27 bei der Migration von Epithelzellen und der Apoptose während der Wundheilung des Hornhautepithels aufgedeckt. Im Gegensatz zu früheren Studien¹⁰

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biologische Sicherheitswerkbank	CHC LAB Co., Ltd,  Daejeon, Republik Korea	CHC-777A2-06	Klasse II, Typ A2
Stealth RNA	Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA		RNAi siRNA; verschlüsselte Kontroll-siRNA und HSP27-spezifische siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc., Walkersville, MD	CC-3171, CC4175	Wachstumsmedium für Bronchialepithel
Protease-Hemmer	Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO	P8340, P7626	1 μ M Pepstatin A, 1 μ M Leupeptin, 0,1 μ M Aprotinin
Bradford-Protein-Assay	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA	#500-0001	Bradford-Protein-Assay
Nitrozellulose-Filter	Amersham, Little Chalfont, Großbritannien	RPN3032D	Western-Blotting-Membran
Nicht phosphoryliertes HSP27	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab12351	1:1.000 Verdünnung (Gesamt-HSP27)
Phosphoryliertes HSP27 (Ser85)	Abcam Inc., Cambridge, MA	ab5594	1:1.000 Verdünnung HSP27 wurde an Ser85 phosphoryliert
. Lipofectamine® RNAiMAX-Reagenz	Invitrogen, Carlsbad, CA	13-778-075	Transfektionsreagenz
Phosphoryliertes Akt (Ser473)	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4060	1:1.000 Verdünnung Akt wurde an Ser473 (Zellüberlebensmarker) phosphoryliert.Nicht
phosphoryliertes Akt	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4061	1:1.000 Verdünnung (Total Akt)
Bcl-2-assoziiertes X-Protein	Cell Signaling Technology, Danvers, MA	Nr. 4062	1:1.000 (anti-apoptotischer Proteinmarker)
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	Nr. 4063	1:1.000 Marker für die Beladungskontrolle (Haushaltsgen)
Meerrettichperoxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-Antikörper	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	NCI1460KR	1:10.000 Verdünnung
OPTI-MEM	Invitrogen, Carlsbad, CA	31985	reduziertes Serummedium für die Transfektion
Bildanalysesoftware	Olympus, Inc., Tokio, Japan	Image-Pro Plus 5.0
Magermilchpulver	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlstruhe, Deutschland	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	Nr. 0497
Natriumchlorid	Amresco LCC, Inc. Solon, OH	No-0241
Sechs-Well-Kulturplatte	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	140675	35,00 mm Durchmesser / Well
24-Well-Kulturschale	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA	142475
Orbitalschüttler	N-Bioteck, Inc., Seoul, Südkorea	NB1015
Rinderserumalbumin	Santa Cruz Biotechnologie, Santa Cruz, Kalifornien	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ		Durchflusszytometrie
Röntgenfilm	Kodak, Rochester, NY		Medizinische Röntgenkassette mit grünem 400 Bildschirm
Western Blotting Luminol Reagenz	Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA	sc-2048
FITC Annexin V Apoptose-Detektionskit I	BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ	556547