Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Zusammenfassung

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Zusammenfassung

Die Architektur verzweigter Organe wie Lunge, Nieren und Brustdrüsen entsteht durch den Entwicklungsprozess der verzweigten Morphogenese, der durch eine Vielzahl von löslichen und physikalischen Signalen in der Mikroumgebung reguliert wird. Hier wird eine Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um den Prozess der Verzweigungsmorphogenese zu untersuchen, indem künstlich hergestellte dreidimensionale (3D) Epithelgewebe mit definierter Form und Größe gebildet werden, die vollständig in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind. Diese Methode ermöglicht die Bildung von Arrays identischer Gewebe und ermöglicht die Kontrolle einer Vielzahl von Umweltfaktoren, einschließlich Gewebegeometrie, Abstand und EZM-Zusammensetzung. Diese Methode kann auch mit weit verbreiteten Techniken wie der Traktionskraftmikroskopie (TFM) kombiniert werden, um mehr Informationen über die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden EZM zu erhalten. Das Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Zell- und Gewebeprozessen zu untersuchen, die über die verzweigte Morphogenese hinausgehen, einschließlich der Krebsinvasion.

Einleitung

Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung ^1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und dieser Prozess wird fortgesetzt ³ eine epitheliale Baum zu erstellen. Obwohl viele wichtige biochemische Signale identifiziert wurden, ein umfassendes Verständnis der zellbiologischen Mechanismen, die diese komplexen Entwicklungsprozess führen derzeit fehlt. Darüber hinaus sind mechanistische Studien über die Einflüsse der spezifischen Signale nur schwer von Erfah zu dekonstruierenrungen in vivo sind so präzise Raum - Zeit - Störungen und Messungen oft nicht möglich.

Dreidimensionale (3D) Kulturtechniken, wie beispielsweise Vollorgankultur, primäre Organoiden und Zellkulturmodellen, sind nützliche Werkzeuge für die systematische Untersuchung der Mechanismen , darunter liegende Gewebe - Morphogenese ^4-6. Dies kann besonders nützlich sein für die Bestimmung der Einflüsse von spezifischen Faktoren einzeln, wie mechanische Kräfte und biochemische Signale auf einer Vielzahl von Zellverhalten, einschließlich der Migration, Proliferation und Differenzierung. ⁶ Engineered Zellkulturmodellen, insbesondere leicht die Störung ermöglichen von einzelnen Zellen und deren Mikroumgebung.

Eine solche Kulturmodell verwendet einen Mikro-basierten Ansatz Modell mammaepithelialen Gewebe zu konstruieren mit 3D-Struktur gesteuert, die konsistent und reproduzierbar Zweige bilden, die gemeinsam wandern, wenn sie mit dem eine induzierteppropriate Wachstumsfaktoren. Der große Vorteil des Modells ist die Fähigkeit, genau zu manipulieren und die Auswirkungen der physikalischen und biochemischen Faktoren, wie beispielsweise Muster der mechanischen Beanspruchung mit hoher statistischer Sicherheit messen. Diese Technik, die zusammen mit Computermodellierung, wurde bereits verwendet ^7-11 die relativen Beiträge der physikalischen und biochemischen Signale in der Leitung von der normalen Entwicklung der Brust-Epithelgewebe und anderen verzweigten Epithelien zu bestimmen. Dargestellt ist hier ein detailliertes Protokoll für diese Modellgewebe Gebäude, das leicht auf andere Arten von Zellen und extrazellulären Matrix erweitert werden kann (ECM) Gele, und die dazu dient, als mögliches Instrument für die Prüfung von Therapeutika.

Protokoll

1. Herstellung der Lösungen

1. Zur Herstellung einer 5 mg / ml - Lösung von Insulin, verdünnen das pulverisierte Insulin Lager mit 5 mM Salzsäure (HCl) in dH ₂ O (500 mg Insulin in 100 ml Lösungsmittel). Herstellung von 100 ml Lösungsmittel durch 50 & mgr; l konzentrierter HCl Zugabe zu 100 ml destilliertem Wasser (dH ₂ O).
2. Um eine 1x PBS - Lösung machen, verdünnen das 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Stammlösung mit dH ₂ O unter sterilen Bedingungen auf 1x.
3. Bereiten Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerlösung wie folgt: mischen Sie das PDMS-Präpolymer zusammen mit dem Härter in einem 10: 1 (w: w) Verhältnis.
4. Bereiten Sie die Zellkulturmedium wie folgt: zu 500 ml Lager Dulbecco modifiziertem Eagle Medium: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F-12), 10 ml sterilem fötalen Rinderserum (FBS), 500 ul Gentamicin Reagens und 500 & mgr; l von 5 mg / ml Insulin.
5. Um die 1% Rinderserumalbumin (BSA) in 1x PBS-Lösung zuzubereiten, 1% (w: V) Lösung Pulver von BSA PBS auf 1x und gründlich mischen.
6. Um eine 4 mg / ml-Lösung von neutralisiert Rinder-Typ vorbereiten I-Kollagen, fügen Sie 50 ul 10x Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) Puffer, 30 ul 0,1 N Natriumhydroxid (NaOH), 30 & mgr; l Zellkulturmedium und 400 ul Lager Kollagen zu einem gekühlten Mikrozentrifugen-Röhrchen von 1,5 ml. Mischen Sie langsam durch Pipettieren nach oben und unten; vermeiden Blasen einzuführen. Um alle Blasen zu entfernen, kurz die Mischung bei 4 ° C zentrifugiert werden.
7. Bereiten Sie eine Fixierungslösung um 16% Paraformaldehyd Verdünnung 1: 4 (v: v) in 1x PBS.
8. Bereiten Sie eine Kerne Markierungslösung durch den Bestand Kerne Markierungslösung verdünnt 1: 1000 (v: v) in 1x PBS.
9. Vorbereiten eines 0,3% Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung und Detergens (PBST) Lösung, die durch Mischen von 1x PBS mit 0,3% (v: v) Waschmittel.
10. Bereiten Blocking-Puffer durch Verdünnen Ziegenserum 01.10 (v: v) in 0,3% PBST.
11. Bereiten eines primären Antikörperlösung für ein bestimmtes Protein von Interesse durch Verdünnen priMary Antikörper (beispielsweise Kaninchen-anti-focal adhesion kinase (FAK)) 1: 200 (v: v) in Blocking-Puffer.
12. Vorbereiten eines sekundären Antikörperlösung durch eine fluoreszierende Sonde konjugierte Antikörper verdünnt (beispielsweise Ziegen-anti-Kaninchen) 1: 1000 (v: v) in Blocking-Puffer.

2. Herstellung von Elastomer-Briefmarken für 3D-Mikrostrukturierung

Hinweis: Elastomeres Stempel werden mit PDMS hergestellt.

1. Machen Sie eine PDMS-Lösung im gleichen Verhältnis wie 1.3 in Schritt beschrieben und gründlich mischen. Platzieren der Mischung in einer Vakuumkammer für 15-30 min alle Luftblasen zu entfernen, die während des Mischprozesses eingebracht wurden.
2. Gießen Sie die entgaste Lösung in eine Plastik wiegen Boot oder eine Petrischale mit einem Silizium-Master enthält, die lithographisch mit Eigenschaften der gewünschten Geometrie strukturiert wird. Für die besten Ergebnisse, heilen die PDMS-Lösung bei 60 ° C für ca. 12 Stunden.
   Hinweis: Die Silizium-Meister hochgradig anpassbar sind; Dieses Protokoll verwendet rechteckige Strukturen mit Abmessungen von 50& mgr; m × 200 & mgr; m × 50 & mgr; m Abstand 200 & mgr; m voneinander entfernt. Die Silizium-Master können unter Verwendung von Standard-Photolithographietechniken hergestellt werden. Kurz gesagt wird ein auf Epoxybasis Photoresist auf einem Siliciumwafer spinbeschichtet. Eine Maske, die gewünschten Stempel Funktionen Detaillierung ist auf der Oberseite des Photoresist beschichteten Wafer angeordnet, die dann mit UV-Licht ausgesetzt wird. Die gewünschten Eigenschaften, die nicht von der Maske blockiert werden dem Licht ausgesetzt und der Photoresist an diesen Stellen wird vernetzt, während der Rest der Photoresistschicht löslich ist, und kann weggespült werden.
3. Nachdem das PDMS um die gewünschten Funktionen auf dem Silizium-Master ausgehärtet ist, entfernen Sie die PDMS und Master aus dem Plastikbehälter. Trennen Sie sorgfältig die PDMS aus dem Siliziumwafer und den Überschuss entfernen PDMS aus um die geprägten Merkmale einer sauberen Rasierklinge.
4. Schneiden Sie nun die PDMS gemustert mit aufgedrucktem Funktionen in einzelne rechteckigen Stempel (~ 8 mm x 5 mm) mit einer Rasierklinge. Bewahren Sie diese Funktion Seite nach oben in einem cleein 100-mm-Durchmesser Petrischale.
5. Darüber hinaus verwenden die PDMS-Lösung 1.3 in Schritt beschriebenen Träger für die rechteckigen Stempel zu machen.
6. Verwendung einer Schleuderbeschichtungsvorrichtung, verteilt ~ 2-3 g des PDMS-Lösung gleichmäßig auf einer 100-mm-Durchmesser-Petrischale und härten die PDMS für ~ 12 Stunden bei 60 ° C, wie in Schritt 2.1. Dann mit einer Rasierklinge, schneiden Sie die dünne Schicht aus PDMS in Rechtecke (~ 5 mm x 2 mm).
   Hinweis: Zwei Stützen für jeden PDMS-Stempel in 2.3 Schritt gemacht benötigt werden. Die Träger können in der 100-mm-Durchmesser-Petrischale aufbewahrt werden, die die PDMS-Stempel enthält.
7. Bevor die PDMS-Stempel und Träger können für die Zellkultur verwendet werden, Sterilisieren durch Eintauchen in 70% Ethanol und trocken unter Verwendung eines Aspirator in einer biologischen Sicherheit Schrank (Zellkulturhaube).

3. Herstellung von 3D-Epithelgewebe

1. In einem Biosicherheitsschrank, fügen Sie oben auf jeder Stempel einen Rückgang von etwa 50 & mgr; l von 1% BSA in PBS. Legen Sie die Tröpfchen bei 4 ° C bedeckt Briefmarken für einen Minimum von 4 h, um sicherzustellen, dass das BSA an die Oberfläche des Stempels adsorbiert.
2. Absaugen BSA-Lösung aus den PDMS-Stempel.
3. Waschen der Oberflächen der zwei Mal mit Zellkulturmedium Tempel (50 & mgr; l pro Wasch pro Stempel sollte ausreichend sein) und nach jeder Wasch Absaugen.
4. Behandeln Sie die sterilisierten PDMS-Stempel und Träger mit gebogenen Pinzette aus rostfreiem Stahl. In einem Biosicherheitsschrank, legen Sie ein 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale für jeden Stempel PDMS. In jedem Gericht, legte sich zwei PDMS unterstützt durch einen Abstand, der etwas kleiner als die Länge der Stempel PDMS getrennt.
5. Mit Hilfe der Pinzette, sterilisieren, so viele kreisförmige Glasplättchen (15 mm Durchmesser, # 1), da PDMS-Stempel unter Verwendung von 70% igem Ethanol sind. Saugen Sie die überschüssige Flüssigkeit aus den Deckgläsern, während sie mit der Pinzette zu halten. Bewahren Sie die gewaschenen Deckgläser in einem separaten 100-mm-Durchmesser Petrischale.
6. Dispense ~ 50 & mgr; l der Kollagenmischung zu gleichmäßig zu beschichten die Oberfläche jedes PDMS-Stempel.
7. Abholenjeweils mit Kollagen beschichteten PDMS-Stempel mit der Pinzette und invertieren sie sanft. Senken die invertierten Stempel auf der Oberseite des PDMS unterstützt gelegt in 35-mm-Durchmesser-Gewebekulturklöpper, so dass das Kollagen zwischen dem Stempel und dem Boden der Gewebekulturschale ist. Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C für 30 min.
8. Dispense ~ 50 & mgr; l der verbleibenden Kollagenmischung auf jede der kreisförmigen Deckgläser (später, werden diese auf der Oberseite der engineered Gewebe platziert werden, um sie vollständig in Kollagen einkapseln) und inkubieren bei 37 ° C für 30 min.
9. Besorgen Sie sich einen 100-mm-Durchmesser-Gewebekulturschale mit Epithelzellen (ex. EpH4 Maus Brustepithelzellen) bei ~ 40% Konfluenz. Absaugen Zellkulturmedium und wäscht einmal mit 10 ml 1x PBS. 2 ml Trypsin zu den Zellen und inkubiere bei 37 ° C für 5-10 min.
10. 8 ml frisches Kulturmedium auf die Gewebekulturschale mit Trypsin behandelt Zellen enthält, löst alle verbleibenden adhärenten Zellen von der Schale. Vorsichtig mischen durch Pipettieren und bewegen Sie das Zellgemisch in ein 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
11. Absaugen Überstand aus dem konischen Rohr und Resuspendieren des Zellpellets in Zellkulturmedium. unter Verwendung eines Hämozytometers zählen die Zellen die Konzentration der Suspension zu bestimmen. Stellen Sie das Suspensionsvolumen um eine Endkonzentration von ~ 10 ⁶ bis 10 ⁷ Zellen / ml zu erhalten.
12. Entfernen Sie die gelierte Kollagenproben aus dem Inkubator. Mit der Pinzette, heben Sie vorsichtig die PDMS-Stempel gerade nach oben, sie aus dem geformten Kollagen zu lösen und sie zu verwerfen.
13. Dispense ~ 30 & mgr; l der konzentrierten Zellsuspension auf die Oberfläche jedes Kollagengel Formhohlräume der gewünschten Geometrie enthält. Beachten Sie die Zellen unter einem Hellfeldmikroskop mit einem Objektiv 10x / 0,25 NA , während sanft die Gerichte Seite Schütteln zur Seite Zelle zu fördern innerhalb der Hohlräume nieder. Die Hohlräume sollten innerhalb von ca. 5 min gefüllt werden.
14. Um reMove die Hohlräume überschüssige Zellen aus der Umgebung, neigen jedes Schalenkultur Gewebe auf seiner Seite und sanft verzichtet ~ 400 & mgr; l Zellkulturmedium über die Oberfläche des Kollagengels. Saugen Sie die Flüssigkeit, und wiederholen Sie den Wasch 1-2 weitere Male, die Kollagen-Gelen unter dem Mikroskop in zwischen jeder Wäsche zu überprüfen.
15. Nachdem die überschüssigen Zellen aus um die Zelle gefüllten Hohlräume in der Kollagenform gelöscht wurden, legen die Gewebekulturschalen in einer Zellkulturbrutschrank bei 37 ° C für 15 min. Dann mit der Pinzette vorsichtig umdrehen, die mit Kollagen beschichteten Klasse Deck und legen Sie sie auf der Oberseite der Zelle gefüllten Kollagen Formen, so dass das Kollagen aus den Deckgläsern bildet eine Kappe über den Zell gefüllte Hohlräume. Inkubieren der Proben bei 37 ° C für 15 min.
16. Sobald die Kollagenkappen an die Zelle gefüllten Kollagen Form anhaften, verzichtet ~ 2-2,5 ml Zellkulturmedium langsam über das Deckglas auf der Gele. Kultur die Proben bei 37 ° C für 1-3 Tage.
    Hinweis:24 h nach der anfänglichen Aussaat können die epithelialen Geweben mit Wachstumsfaktoren wie epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) oder Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF) behandelt Verzweigung zu induzieren.

4. Immunofluoreszenz und Bildanalyse

1. Saugen Sie das Zellkulturmedium aus den Gewebekulturschalen und fügen Sie genug Fixierungslösung, die zellhaltigen Gelen zu decken. Inkubieren Sie die Gerichte bei Raumtemperatur für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute.
2. Saugen Sie das Fixiermittel, füllen Sie die Gewebekulturschalen mit 1x PBS und Inkubation für 15 min auf einem Schüttler bei 200 Umdrehungen pro Minute bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wäschen.
3. Zur Kennzeichnung der Kerne: absaugen PBS aus der Gewebekulturschale und ersetzen mit Hoechst Lösung. Inkubieren bei Raumtemperatur für 15-20 min. Um FAK oder einen anderen Marker Fleck, der mit Antikörper nachweisbar ist, überspringen 4,5 Schritt.
4. Saugen Sie das Kernmarkierungslösung und waschen Sie die Zellen enthaltende gels dreimal mit 1x PBS, wie in Schritt 4.2. Befleckten Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
5. Um sich für ein Protein von Interesse Fleck: absaugen PBS aus den Gewebekulturschalen, fügen Sie 300 ul 0,3% PBST und inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min.
6. Saugen Sie das PBS, decken Sie die Gele mit Blocking-Puffer und Inkubation auf einem Schüttler (200 UpM) bei Raumtemperatur für ca. 4 Std.
7. Saugen Sie den Blockierungspuffer, decken Sie die Gele mit primären Antikörperlösung und bei 200 Umdrehungen pro Minute über Nacht bei 4 ° C auf einem Schüttler inkubiert.
8. Aspirieren die primäre Antikörperlösung, Zugabe von 0,3% PBST-Lösung und Inkubieren auf einem Schüttler bei 200 rpm für 30 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie das PBST und wiederholen Sie alle 30 min für 3-4 Std.
9. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8, diesmal mit der sekundären Antikörperlösung inkubiert. Wickeln der Gewebekulturschalen mit Aluminiumfolie gegen Ausbleichung des sekundären Antikörpers zu verhindern. Nach dem final Wäsche, Bunt Proben können in 1x PBS bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
10. Um Proben zu visualisieren, verwenden Sie einen 10X / 0,30 NA - Objektiv auf der Mittelebene der epithelialen Geweben konzentriert.
11. Zur Visualisierung Zellkerne, Bild fixierten Proben mit einem nuklearen Marker markiert mit einem 10x / 0,30 NA - Objektiv unter UV - Beleuchtung.
12. Zur Visualisierung Proben für ein Protein von Interesse gefärbt, Bild ein 10x / 0,30 NA - Objektiv auf einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
13. Um Frequenz Karten von Proteinfärbung von mehreren Geweben erstellen (in der Regel 50 oder mehr) von identischen Ausgangsgeometrie, erste Import jedes der Bilder Standardbildanalyse-Software (siehe Materialien) und wandeln sie in 8-Bit-Graustufen.
14. Um Schwelle dieser Bilder, wandeln sie in binäre (dh Halbton / schwarz und weiß) durch ein Grau Cutoff - Punkt definieren; Grauwerte unterhalb der Schwelle schwarz werden, und diejenigen, oberhalb der Schwelle werden weiß. Dann kombinierenjedes der einzelnen binären Bilder in einer einzigen Bildstapel.
15. Als nächstes registrieren die gestapelten Bilder (dh ausrichten oder sie entsprechen) in der Analyse - Software. Viele Bildanalyse-Software-Pakete sind mit einem frei verfügbaren Registrierung Plugin.
    1. Verwenden, um jedes Bild in einem Stapel als Vorlage für die Ausrichtung des nächsten Bildes, so dass die Bilder in dem gesamten Stapel werden durch Ausbreitung ausgerichtet sind. Schließlich Overlay (Projekt) werden die Bilder in der ausgerichteten Bildstapel auf mittlere Intensität anhand eines einzelnen Bildes mit einer Pixelfrequenz Karte zu bilden. Dieses Bild kann dann farblich gekennzeichnet sein Bildbearbeitungssoftware der Wahl ^10,11 verwenden.

Ergebnisse

Allgemeines Schema von mammaepithelialen Gewebe Mikro

Eine allgemeine schematische Darstellung der Mikrofabrikationsverfahren des experimentellen Arbeitsablauf umreißt in Abbildung 1 dargestellt ist. Das Ergebnis ist ein Array von Epithelgewebe identischer Geometrie und den Abstand, der in einer ECM - Gel vollständig eingebettet sind. Ein repräsentatives Experiment verwendet EpH4 Maus-Mamma-Epithelzellen kultiviert in einem G...

Diskussion

Das oben beschriebene Protokoll skizziert ein Verfahren zur Herstellung identischer Epithelgewebe mit vordefinierter Form, das eine räumliche Kontrolle der mechanischen Belastung ermöglicht, die den Zellen im Gewebe ausgesetzt ist. Eine elastomere Form wird verwendet, um Hohlräume in Typ-I-Kollagen zu erzeugen, die dann mit Epithelzellen gefüllt und mit einer zusätzlichen Kollagenschicht bedeckt werden, so dass die Zellen vollständig in einer 3D-Kollagenmatrix-Umgebung eingekapselt sind. Die weitere Kultivierung dieser G...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polydimethylsiloxan (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS Härter	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Lithographisch gemusterter Silikonmeister	selbsthergestellt	N/A
Kunststoff-Wiege	Fisher Scientific	08-732-115
Petrischalen mit 100 mm Durchmesser	BioExpress	D-2550-2
Ethylalkohol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Stellen Sie eine 70%ige EtOH (v:v) -Lösung her, indem Sie sie mit dH2O
Rasierklinge	American Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium : Schinken (') s F12 Nährstoffmischung (DMEM/F12) (1:1)	Hyklone	SH30023FS
fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Rind Kollagen Typ I (nicht pepsinisiert)	Koken	IAC-50
Albumin aus Rinderserum (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Gebogene Pinzette aus Edelstahl	Dumont	7
Gewebekulturschalen mit 35 mm Durchmesser	BioExpress	T-2881-6
15 ml konische Röhrchen	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Runde #1 Glasabdeckgläser, 15 mm Durchmesser	Bellco Glass Inc.	Sonderbestellung
0,05% 1x Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehyd	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergent
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Resuspendiert in dH2O bei 50 mg/ml
Kaninchen Anti-Maus FAK Antikörper	Life Technologies	AMO0672
Goat Anti-Kaninchen Alexa 488 Antikörper	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Wird zur Farbcodierung von Pixelfrequenzkarten verwendet.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Kostenlose Bildanalysesoftware zum Schwellenwerten, Registrieren und Überlagern von Bildern zur Erstellung einer Pixelfrequenzkarte. Das StackReg-Plugin wurde für die Registrierung von Binärbildern verwendet.