Technik Dreidimensionale Epithelgewebe Eingebettet in extrazellulären Matrix

Summary

Diese Handschrift beschreibt eine weiche Lithographie-basierte Technik einheitlichen Arrays von dreidimensionalen (3D) Epithelgewebe definierter Geometrie durch extrazelluläre Matrix umgeben zu konstruieren. Dieses Verfahren ist offen für eine große Vielfalt von Zelltypen und experimentelle Kontexten und ermöglicht Hochdurchsatz-Screening von identischen Replikaten.

Abstract

Die Architektur verzweigter Organe wie Lunge, Nieren und Brustdrüsen entsteht durch den Entwicklungsprozess der verzweigten Morphogenese, der durch eine Vielzahl von löslichen und physikalischen Signalen in der Mikroumgebung reguliert wird. Hier wird eine Methode beschrieben, die entwickelt wurde, um den Prozess der Verzweigungsmorphogenese zu untersuchen, indem künstlich hergestellte dreidimensionale (3D) Epithelgewebe mit definierter Form und Größe gebildet werden, die vollständig in eine extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet sind. Diese Methode ermöglicht die Bildung von Arrays identischer Gewebe und ermöglicht die Kontrolle einer Vielzahl von Umweltfaktoren, einschließlich Gewebegeometrie, Abstand und EZM-Zusammensetzung. Diese Methode kann auch mit weit verbreiteten Techniken wie der Traktionskraftmikroskopie (TFM) kombiniert werden, um mehr Informationen über die Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer umgebenden EZM zu erhalten. Das Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Zell- und Gewebeprozessen zu untersuchen, die über die verzweigte Morphogenese hinausgehen, einschließlich der Krebsinvasion.

Introduction

Die Entwicklung von verzweigten epithelialen Geweben, als Verzweiger Morphogenese bekannt ist, wird von Zellen abgeleiteten, physikalischen und Umweltfaktoren reguliert wird. In der Brustdrüse, Morphogenese Verzweigung ist ein iterativer Prozess, durch den geführten kollektive Zellmigration eine baumartige Architektur schafft. Der erste Schritt ist die primäre Knospenbildung aus den Milchgängen, gefolgt von Zweig Initiierung und Dehnung ^1,2. Invasion der Filialen in das umgebende Stroma wird durch die systemische Freisetzung von Steroidhormonen in der Pubertät induziert. Neue primäre Knospen initiieren dann von den Enden der bestehenden Filialen, und diese....

Protocol

1. Herstellung der Lösungen

1. Zur Herstellung einer 5 mg / ml - Lösung von Insulin, verdünnen das pulverisierte Insulin Lager mit 5 mM Salzsäure (HCl) in dH ₂ O (500 mg Insulin in 100 ml Lösungsmittel). Herstellung von 100 ml Lösungsmittel durch 50 & mgr; l konzentrierter HCl Zugabe zu 100 ml destilliertem Wasser (dH ₂ O).
2. Um eine 1x PBS - Lösung machen, verdünnen das 10x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Stammlösung mit dH ₂ O unter sterilen Bedingungen auf 1x.
3. Bereiten Sie das Polydimethylsiloxan (PDMS) Elastomerlösung wie folgt: mischen Sie das PDMS-Präpolymer zusammen mit dem Härter in einem 10: 1 (....

Results

Allgemeines Schema von mammaepithelialen Gewebe Mikro

Eine allgemeine schematische Darstellung der Mikrofabrikationsverfahren des experimentellen Arbeitsablauf umreißt in Abbildung 1 dargestellt ist. Das Ergebnis ist ein Array von Epithelgewebe identischer Geometrie und den Abstand, der in einer ECM - Gel vollständig eingebettet sind. Ein repräsentatives Experiment verwendet EpH4 Maus-Mamma-Epithelzellen kultiviert in einem G.......

Discussion

Das oben beschriebene Protokoll skizziert ein Verfahren zur Herstellung identischer Epithelgewebe mit vordefinierter Form, das eine räumliche Kontrolle der mechanischen Belastung ermöglicht, die den Zellen im Gewebe ausgesetzt ist. Eine elastomere Form wird verwendet, um Hohlräume in Typ-I-Kollagen zu erzeugen, die dann mit Epithelzellen gefüllt und mit einer zusätzlichen Kollagenschicht bedeckt werden, so dass die Zellen vollständig in einer 3D-Kollagenmatrix-Umgebung eingekapselt sind. Die weitere Kultivierung dieser G.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polydimethylsiloxan (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
PDMS Härter	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184
Lithographisch gemusterter Silikonmeister	selbsthergestellt	N/A
Kunststoff-Wiege	Fisher Scientific	08-732-115
Petrischalen mit 100 mm Durchmesser	BioExpress	D-2550-2
Ethylalkohol 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	Stellen Sie eine 70%ige EtOH (v:v) -Lösung her, indem Sie sie mit dH2O
Rasierklinge	American Safety Razor	620179
1:1 Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium : Schinken (') s F12 Nährstoffmischung (DMEM/F12) (1:1)	Hyklone	SH30023FS
fötales Rinderserum (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank' s ausgewogene Salzlösung (HBSS)	Life Technologies	14185-052
Insulin	Sigma Aldrich	I6634-500MG
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
10x Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Fisher Scientific	BP399-500
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma Aldrich	221465-500G
Rind Kollagen Typ I (nicht pepsinisiert)	Koken	IAC-50
Albumin aus Rinderserum (BSA)	Sigma Aldrich	A-7906
Gebogene Pinzette aus Edelstahl	Dumont	7
Gewebekulturschalen mit 35 mm Durchmesser	BioExpress	T-2881-6
15 ml konische Röhrchen	BioExpress	C-3394-2
1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
Runde #1 Glasabdeckgläser, 15 mm Durchmesser	Bellco Glass Inc.	Sonderbestellung
0,05% 1x Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
Paraformaldehyd	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	Detergent
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	Resuspendiert in dH2O bei 50 mg/ml
Kaninchen Anti-Maus FAK Antikörper	Life Technologies	AMO0672
Goat Anti-Kaninchen Alexa 488 Antikörper	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	Wird zur Farbcodierung von Pixelfrequenzkarten verwendet.
FIJI (ImageJ)	NIH	N/A	Kostenlose Bildanalysesoftware zum Schwellenwerten, Registrieren und Überlagern von Bildern zur Erstellung einer Pixelfrequenzkarte. Das StackReg-Plugin wurde für die Registrierung von Binärbildern verwendet.