Hochdurchsatz-Screening von Kohlenhydrat-abbauenden Enzymen Neuartige Unlöslich chromogenen Assays Kits

Zusammenfassung

Ein Hochdurchsatz-Assay für das Enzym-Screening wird beschrieben. Dieses gebrauchsfertige Multiplex-Assay-Kit besteht aus vorausgewählten C-hromogenen P-Olymer-H-Ydrogel-Substraten (CPH) und komplexenI-nlöslichen C-hromogenen B-iomasse(ICB)-Substraten. Zielenzyme sind Polysaccharid-abbauende Endoenzyme und Proteasen.

Zusammenfassung

CArbohydrate activeen zymes (CAZymes) haben in vivo mehrere Rollen und werden häufig für die industrielle Verarbeitung in der Biokraftstoff-, Textil-, Waschmittel-, Papier- und Lebensmittelindustrie verwendet. Ein tieferes Verständnis von CAZymes ist sowohl aus fundamentalbiologischer als auch aus industrieller Sicht wichtig. In der Natur gibt es eine große Anzahl von CAZymen (vor allem in Mikroorganismen), und Hunderttausende wurden katalogisiert und in der Datenbank carbohydrate active enzyme (CAZy) beschrieben. Die Entdeckungsrate mutmaßlicher Enzyme hat jedoch unsere Fähigkeit, ihre Aktivitäten biochemisch zu charakterisieren, übertroffen. Ein Grund dafür ist, dass Fortschritte in der Genom- und Transkriptomsequenzierung zusammen mit den zugehörigen bioinformatischen Werkzeugen eine schnelle Identifizierung von CAZyme-Kandidaten ermöglichen, die Technologie zur Bestimmung der biochemischen Eigenschaften eines Enzyms jedoch langsamer vorangeschritten ist. Um diese Technologielücke zu schließen, wird hier ein neuartiges Hochdurchsatz-Assay-Kit auf Basis unlöslicher chromogener Substrate beschrieben. Es wurden zwei unterschiedliche Substrattypen hergestellt: Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) Substrate (hergestellt aus gereinigten Polysacchariden und Proteinen) und Inlösliche Chromogene Biomass (ICB) Substrate (hergestellt aus komplexen Biomassematerialien). Sowohl CPH- als auch ICB-Substrate werden in einem 96-Well-Hochdurchsatz-Assay-System bereitgestellt. Die CPH-Substrate können in vier verschiedenen Farben hergestellt werden, wodurch sie miteinander vermischt werden können und somit der Assay-Durchsatz erhöht wird. Das Protokoll beschreibt einen 96-Well-Plattenassay und zeigt, wie dieser Assay für das Screening der Aktivitäten von Enzymen, Enzymcocktails und Brühen verwendet werden kann.

Einleitung

Techniken zum Mining von Genomen und Metagenomen haben sich in den letzten Jahren rasant entwickelt, ebenso wie Strategien mit mittlerem und hohem Durchsatz für die Klonierung und Expression rekombinanter Enzyme. Darüber hinaus haben sich die bioinformatischen Ressourcen und die damit verbundenen Depots, wie z. B. (CAZy)^1,2, stark erweitert. Die Nutzung der mikrobiellen Enzymvielfalt für industrielle Zwecke ist jedoch mit erheblichen Herausforderungen verbunden, und die empirische Bestimmung der Enzymaktivitäten ist inzwischen zu einem ernsthaften Engpass geworden. Zum Beispiel wird geschätzt, dass wir mit den derzeitigen Methoden die Aktivitäten von nicht mehr als 4% der Proteine in der CAZy-Datenbank sicher vorhersagen können. Obwohl zahlreiche Methoden zur Überwachung der Enzymaktivität zur Verfügung stehen, haben sie alle einige Einschränkungen. Für die Beurteilung der oligomeren Fragmente der Glykosylhydrolase (GH)-Aktivitäten stehen etablierte Techniken zur Verfügung, die auf Chromatographie in Kombination mit Massenspektrometrie beruhen^3,4. Diese Ansätze sind jedoch arbeitsintensiv und in der Regel mit geringem Durchsatz verbunden. Methoden, die auf der Messung von reduzierenden Zuckern basieren, wie z. B.^die Dinitrosalicylsäure-5- und Nelson-Somogyi-6-Assays, werden häufig zur Beurteilung der GH-Aktivitäten verwendet. Diese Assays haben jedoch einen begrenzten Durchsatz und können anfällig für Nebenreaktionen sein. Einzelne chromogene Polysaccharidsubstrate, wie z. B. Azurin vernetzt (AZCL), werden häufig zur Bestimmung der Enzymaktivitäten verwendet, aber der separate Kauf aller Substrate und die manuelle Verteilung der Substratpulver innerhalb der Assay-Platte kann umständlich und kostspielig sein⁷.

Wir haben eine neue Generation von chromogenen Polymer-Hydrogel-Substraten (CPH) auf Basis von Chlortriazin-Farbstoffen entwickelt, die in Verbindung mit einer 96-Well-Filterplatte ein Hochdurchsatz-Assay-System bilden. Es wurden zusätzliche Substrate für unlösliche chromogene Biomasse (ICB) entwickelt, die Informationen über die Substratverfügbarkeit in komplexen Polymermischungen, wie sie in lignozellulosehaltiger Biomasse vorkommen, liefern. Jedes Substrat kann in einer von vier Farben hergestellt werden, und verschiedenfarbige Substrate können in einem einzigen Well kombiniert werden. In diesem Protokoll wird gezeigt, dass diese Methodik auf eine Vielzahl von Polysacchariden und Proteinen angewendet werden kann und welches Potenzial für das Screening von GHs, lytischen Polysaccharid-Monooxygenasen (LPMOs) und Proteasen besteht. Für die Verwendung von 96-Well-Platten werden spezifische Protokolle zur Verfügung gestellt, und repräsentative Ergebnisse verdeutlichen die hohe Effizienz der CPH- und ICB-Substratkits als Werkzeuge für das Enzymscreening.

Ein wesentlicher Vorteil der beschriebenen Assay-Kits, unabhängig vom Substrat, besteht darin, dass die Kits innerhalb von 15 Minuten nach dem Aktivierungsschritt einsatzbereit sind. Dadurch entfällt die zeitaufwändige Montage des Assays aus Rohsubstratmaterialien, wie dies bei einigen anderen Methoden der Fall ist⁷. Die CPH- und ICB-Substrate zeichnen sich durch eine hervorragende Lagerung (mindestens ein Jahr bei Raumtemperatur), pH- und Temperaturstabilität ⁸ aus und erfordern keine spezielle Ausrüstung oder Schulung. Die CPH- oder ICB-Assays basieren auf einer 96-Well-Filterplatte, in der die Reaktion mit dem Enzym durchgeführt wird. Wenn das Enzym mit einem gegebenen Substrat aktiv ist, werden lösliche gefärbte Oligomere erzeugt, die einen farbigen Überstand erzeugen, der dann unter Verwendung eines Vakuumverteilers oder einer Zentrifuge ⁸ in eine reguläre Klarwell-96-Well-Platte filtriert werden kann.

Die Substrate werden mit Chlortriazin-Farbstoffen gefärbt, die im sichtbaren Spektrum (VIS) absorbieren, und einzelne Farben (rot, blau, gelb und grün) können mit Hilfe der linearen Regression aufgelöst werden, wenn verschiedene CPH-Substrate unterschiedlicher Farbe in einer einzigen Vertiefung gemischt werden und das Enzym auf mehr als ein Substrat wirkt. Die resultierende Platte mit den Überständen kann mit einem Standard-Mikrotiterplatten-Reader gemessen werden, der in der Lage ist, die Absorption im VIS-Bereich zu messen. Das Mischen verschiedener Substrate mit unterschiedlichen Farben in einem Well erhöht den Durchsatz des Assay-Systems auf insgesamt 384 Experimente in einer 96-Well-Platte (4 verschiedene Substrate unterschiedlicher Farbe pro Well).

CPH-Substrate bieten ein wertvolles Werkzeug zur Beurteilung der spezifischen Aktivität eines Enzyms, während ICB-Substrate verwendet werden, um die Fähigkeit eines Enzyms zur Verdauung einer Komponente im Kontext komplexer Substratmischungen zu bewerten, die Enzyme normalerweise in Biomasse antreffen. Obwohl ICB-Substrate keine Informationen über einzelne Enzymspezifitäten liefern, sind sie dennoch nützliche Werkzeuge, um die kommerzielle Leistung von Enzymen, Cocktails oder Brühen zu bewerten.

Protokoll

1. chromogenen Assay mit CPH Substrate in einer 96-Well-Plattenformat

1. Die Aktivierung des Assay - Kit Platte
   1. Aktivieren Sie den 96-Loch-Filter-Testkit Platte (Materialliste) durch Zugabe von 200 & mgr; l Aktivierungslösung (erhalten mit dem Kit) in jede Vertiefung, gefolgt von 10 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur ohne Rühren (blau CPH-Xylan enthält).
   2. Vakuum ziehen einen Vakuumverteiler mit (mit dem Abstandsblock innerhalb und jeder Standard, transparent 96-Well-Platte als Sammelplatte) erhaltenen Aktivierungslösung zu entfernen. Es ist auch möglich, eine Zentrifuge bei 2.700 xg für 10 min für diesen Schritt an Stelle des Vakuumverteiler zu verwenden.
   3. Waschen Sie die CPH Substrate von 100 & mgr; l sterilem Wasser hinzufügen und anwenden Vakuum (oder Zentrifugalkraft), um den Stabilisator zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt noch zweimal, und die Platten sind nun einsatzbereit.
2. Die Enzymreaktion
   HINWEIS: Immer auch Pufferallein als negative Kontrolle, und wenn möglich, zuvor als positive Kontrollen gekennzeichnet Enzyme. Verwenden Sie eine statistisch entsprechende Anzahl an Wiederholungen. Die CPH Substrate sind stabil zwischen pH 3,0 bis 10,0 und die Gesamtmenge an Pufferende Enzymlösung in jeder Vertiefung sollten nicht 180 & mgr; l nicht übersteigen. Pflanzenextrakt oder Kulturbrühe kann auch anstelle von gereinigter Enzymlösung verwendet werden.
   1. Zugabe von 150 & mgr; l 100 mM Natriumacetatpuffer, pH 4,5 , und 5 ul endo -cellulase - Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 1 U / ml) zu jeder Vertiefung der Testkit Platte.
   2. Legen Sie die Produktplatte (eine klare-Well-Platte kompatibel mit dem Mikrotiterplatten-Leser) unterhalb der Assay-Kit Platte beim Schütteln eine mögliche Leckage von der Reaktionsplatte zu sammeln.
   3. Inkubieren der Testkit Platte bei 25 ° C für 30 min in einem Horizontalschüttler bei 150 Upm.
      HINWEIS: Mischen die Reaktion in der Testkit Platte während der Inkubation ist entscheidend für eine konsistente Verwirklichung und Reproproduzierbar Ergebnis. CPH Substrate sind stabil bis zu 90 ° C. Die Inkubationszeit sollte bis zu 24 Stunden erhöht werden, wenn Kulturbrühen Prüfung unbekannte Enzymkonzentrationen mit CPH haltigen Substraten. Man beachte, dass geeignete Inkubationszeiten auf die Aktivität des Enzyms abhängt (s), aber im allgemeinen, wenn es keine nachweisbare Aktivität innerhalb von 24 Stunden ist, ist es wahrscheinlich, dass das Enzym nicht das getestete Substrat abgebaut wird. Ein aktives Enzym Abbau der unlöslichen chromogenen Polysaccharide des CPH Substrat in lösliche chromogenen Oligosaccharide, die als farbige Überstand sichtbar sind.
   4. Legen Sie die saubere Produktplatte im Inneren der Vakuumkammer mit dem Abstandsblock im Inneren.
   5. Legen Sie die Assay-Kit Platte oben und gelten Vakuum (maximale Unterdruck von -60 kPa). Es ist auch möglich, eine Zentrifuge bei 2.700 xg für 10 min zu verwenden.
      HINWEIS: Das Filtrat die farbigen Oligosaccharide als Reaktionsprodukt ist jetzt in der Produktplatte zur weiteren Analyse mit ⁸ .
3. Nachweis und Quantifizierung
   1. Prüfen, dass das Volumen der Flüssigkeit in jeder Vertiefung der Produktplatte durch visuelle Inspektion in etwa gleich ist.
   2. Lesen Sie die Absorption der Sammelplatte bei 595 nm für blau CPH-Xylan einen Plattenleser.
   3. Wenn die Datenanalyse zu tun, subtrahieren die puffer nur negative Kontrollwerte aus den Werten aus den Vertiefungen, in denen ein Enzym hinzugefügt wurde. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardfehler der Mittelwerte (SEM) aus den Wiederholungsvertiefungen ^8.

2. chromogenen Assay mit ICB Substrate in einer 96-Well-Format

1. Die Enzymreaktion
   1. Fügen Sie die 150 & mgr; l 100 mM Natriumacetat - Puffer, pH 4,5 und 5 & mgr; l 31 U / ml endo -xylanase Lösung zu jeder Vertiefung der Assay - Kit - Platte mit roten ICB-Weizenstroh (endgültige Enzymkonzentration in dem Schacht: 1 U / ml) .
      HINWEIS: Die Assay-Kit Platten (96-Well-Filter plAtes ICB Substrate) enthalten, werden in der Literatur hergestellt (siehe Liste der Materialien), wie beschrieben. Die ICB Substrate sind stabil in Puffer mit einem pH-Bereich zwischen pH 3,0 bis 10,0. Immer auch allein als negative Kontrolle, kommerzielle Enzyme als positive Kontrolle Puffer und eine statistisch entsprechende Anzahl von Repliken.
      1. Sie nicht die ICB Substrate wie die CPH Substratplatte zu aktivieren, sondern entfernen Sie den Stabilisator durch dreimaliges Waschen mit 100 & mgr; l Wasser, gefolgt von Vakuumfiltration oder Zentrifugation.
   2. Legen Sie die Produktplatte unterhalb der Substratplatte während des Schüttelns eine mögliche Leckage von der Substratplatte zu sammeln.
   3. Inkubieren der Reaktion bei 25 ° C bei 150 Upm für 2 Stunden schütteln.
      HINWEIS: Ein aktives Enzym die unlöslichen chromogenen Polysaccharide in dem ICB Substrat in lösliche Oligosaccharide degradiert, die als farbige Überstand sichtbar sind. ICB Substrate sind stabil bis zu 90 ° C. Die Inkubation time sollte bis 24 Stunden erhöht werden, wenn nicht gereinigten Enzyme wie Kulturbrühen verwendet werden.
   4. Stellen Sie das Produkt Platte im Inneren der Vakuumkammer mit dem Abstandsblock im Inneren.
   5. Legen Sie die Assay-Kit Platte oben und gelten Vakuum (maximale Unterdruck von -60 kPa) oder eine Zentrifuge verwenden das Produkt aus dem Assay-Kit Platte in die Vertiefung der Produktplatte zu filtrieren.
      HINWEIS: Das Filtrat die farbigen Oligosaccharide als Reaktionsprodukt ist jetzt in der Sammlung Platte zur weiteren Analyse ⁸ enthält.
2. Nachweis und Quantifizierung
   1. Prüfen, dass das Volumen der Flüssigkeit in jeder Vertiefung der Sammelplatte durch visuelle Inspektion in etwa gleich ist.
   2. Lesen Sie die Absorption der Sammelplatte bei 517 nm für rot ICB-Weizenstroh einen Plattenleser.
   3. Wenn die Datenanalyse zu tun - den Puffer subtrahieren - nur negative Kontrollwerte aus den Werten aus den Vertiefungen, in denen ein Enzym,wurde hinzugefügt. Berechnen Sie den Mittelwert und die Standardfehler der Mittelwerte (SEM) aus den Wiederholungsvertiefungen ^8.
      HINWEIS: Bei unbekannten Enzyme Screening, schlagen wir vor, eine Verdünnungsreihe, um zu machen detailliertere Daten über den Dynamikbereich von Enzymaktivität zu erhalten.

Ergebnisse

Der Hochdurchsatz und Multiplexkapazität dieses Assay basiert auf unlöslichen chromogenen Polymer (oder Protein) Hydrogel (CPH) Substrate in Filterplatten mit 96 Vertiefungen angeordnet. Enzyme sowie negative Kontrollen werden dem Testkit Platte (1A) hinzugefügt und die Enzyme zersetzen die entsprechende Substrat eine gefärbte Überstand (1B) zu erzeugen. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird der Überstand in ein klares Produkt-well - Platte überführt und die Extinktion direkt ein Spektrophotometer für Platten mit 96 Vertiefungen (1C) verwendet , gemessen werden.

Ein Beispiel für eine Dosis - Antwort der CPH-Arabinoxylan zu Xylanase bei verschiedenen Konzentrationen des Enzyms (0,00 bis 0,75 U / ml) ist in Figur 1D gezeigt , wo die abnehmende Enzymkonzentration visuell beobachtet werden kann. Eine ausführlichere spektrophotometrische Quantifizierung können die Absorption gegen die Enzymkonzentration (Abbildung 1E) zum Plotten verwendet werden. Die Signalintensität entspricht der Enzymaktivität. Die Reproduzierbarkeit des Assays wird durch die Fehlerbalken (Standardfehler des Mittelwerts, SEM, von drei Replikaten) gezeigt. Genauere Untersuchungen über die Reproduzierbarkeit dieses Tests werden an anderer Stelle ⁸ veröffentlicht.

Abbildung 1. Xylanase Behandlung von CPH-Arabinoxylan. A) Ein Schema des Assay - Kits Platte mit dem CPH Substrat (zB CPH-Arabinoxylan) geladen in 96-Well - Filterplatte Brunnen direkt vor der Zugabe von Enzymen 1 und 2 und dem Puffer -nur Steuerung (enzyme 1 hatte endo -xylanase Aktivität), b) Abbau von CPH-Arabinoxylan durch Enzym - 1 erzeugt einen farbigen Überstand; C) nach der vakuumunterstützten FiltratD) Produktplatte , enthaltend die Reaktionsprodukte nach der Behandlung von CPH-Arabinoxylan in 4 verschiedenen Farben mit unterschiedlichen Konzentrationen von endo -β-1,4-Xylanase in 100 mM; Ionen der Überstände in dem Produkt Platte wird die Absorption spektrophotometrisch gemessen Natriumacetat - Puffer, pH 4,5 für 60 Minuten bei Raumtemperatur, e . ) Quantifizierung der Reaktionsprodukte von D Spektrophotometrie Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Es gibt verschiedene Optionen für die Verwendung dieses Assays in Enzym-Screening. Eine Möglichkeit ist , eine 96-Well - Platte zu verwenden , die verschiedene Polysaccharide für das Screening, beispielsweise eine kleine Anzahl von (gereinigten) endo -enzyme mit unbekannter Aktivität. In diesem Fall zeigt das Ergebnis, das Polysaccharide sind Degraddurch das Zielenzym können. Um dieses Prinzip zu zeigen , wurde eine endo -cellulase bei 25 ° C gegen verschiedene CPH Substrate getestet. Drei verschiedene Enzymkonzentrationen (0,5 U / ml, 1,0 U / ml und 5 U / ml) wurden für 30 min inkubiert. Das Ergebnis ist deutlich sichtbar in der Produktplatte (2A). Das Produktblatt für dieses endo -cellulase des Lieferanten gibt Nebenaktivität für Xyloglucan (Tamarinde), Gerste β-Glucan, Glucomannan, Birkenholz - Xylan und Low - Side-Aktivität für Galactomannan. In Übereinstimmung damit Aktivität zusätzlich zu Cellulase gefunden wurde gegen CPH-β-Glucan (Gerste), CPH-Xyloglucan (Tamarinde), CPH-Xylan (Buche) und eine geringe Aktivität gegen CPH-Galactomannan (2B). Glucomannan wurde nicht geprüft. Die gleichen CPH Substrate wurden mit kommerziell erhältlichen Enzyme (drei verschiedene Enzymkonzentrationen: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml und 1,0 U / ml) verdaut, die als Positivkontrollen unter denselben Bedingungen als der vorherigeExperiment. Alle Substrate wurden durch die positive Kontrolle Enzym abgebaut und die Signalintensität auf höhere Enzymkonzentration (2C) erhöhte sich entsprechend.

Abbildung 2. Acht verschiedene CPH Substrate wurden unter Rühren inkubiert bei 25 ° C für 30 min. A) Das Produkt Platte verschiedener CPH Substrate mit einer endo -cellulase verdaut, mit unterschiedlichen Konzentrationen. B) Quantifizierung der Aktivität und verschiedene Nebenaktivität die endo -cellulase. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert von drei Replikaten C) Aktivität von verschiedenen kommerziellen Enzyme zu dem entsprechenden CPH Substrat (Endo-Cellulase und 2-HE-Cellulose;. E-LAMSE und CPH-pachyman, CPH-Curdlan, CPH- β-Glucan (Gerste); E-XYAN4 und CPH-Xylan, E-XEGP und CPH-Xyloglucan, E-BLAAM und CPH-Amylose, E-BMACJ und CPH-Galactomannan; alle Enzyme aus Megazyme). Die Fehlerbalken stellen die Standardfehler des Mittelwerts von zwei Repliken. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die unlöslichen chromogenen Biomasse (ICB) Substrate sind eine sinnvolle Ergänzung zu dem chromogenen Substrat Repertoire, weil sie teilweise die natürliche Anordnung von Polysacchariden in Pflanzenzellwänden, die sind der Hauptbestandteil von Biomasse zu halten. CPH und ICB Substrate werden in unserem Beispiel verwendet , um die sezerniert Enzyme von Phanerochaete chrysosporium , wenn in einem flüssigen Medium kultiviert zu analysieren. Die Platte Aufbau der Testkit Platte ist mit 19 CPH Substraten und 5 ICB Substrate (4 Vertiefungen für jedes Substrat, 3B). P. in 3A gezeigten chrysosporium war cultivated für drei Tage und dann analysiert der Kulturüberstand. Daher wurde 125 & mgr; l 200 mM Puffer in jede Vertiefung gegeben und 25 & mgr; l Kulturüberstand überführt. Drei verschiedenen pH - Bedingungen wurden unter Verwendung von Natriumacetat - Puffer getestet , pH 4,0, Natriumphosphat - Puffer pH 6,0 oder pH 8,0 (3C). Die Platte wurde Schütteln (150 rpm) inkubiert bei 25 ° C für 2 Stunden.

Die Reaktionsprodukte wurden in der Produktplatte (3D) übertragen und ausgewertet. P. chrysosporium erzeugten Enzyme für den Abbau von verschiedenen Glukane, Stärke und Xylane (Figur 3E). Niedrigere Signale für die Hemicellulosen Arabinan (Zuckerrübe) und Pektinsäure Galactan sowie für RGI (Soyabohne) nachgewiesen werden konnte. Die Enzyme hergestellt waren aktiver unter sauren Bedingungen (pH 4,0) als in neutralen oder leicht basischen Bedingungen (pH 8,0). Geringere Aktivität gegenüber ICB Substrate (3F)zeigt, dass, wenn die Polysaccharide in einem natürlichen Kontext sind, als mit einem reinen Polysaccharid die Wirksamkeit des Enzyms ist nicht das gleiche, und deshalb ICB Substrate, die eine realistischere Sicht auf die Enzymeffizienz zu demonstrieren, wenn sie roh oder Pre- angewendet wurde behandelten Pflanzenmaterial.

Abbildung 3. Screening von einem Kulturüberstand von einem 3-Tage alten Flüssigkultur von Phanerochaete chrysosporium ein Multi - Substratplatte mit mit 19 CPH und 5 ICB Substraten. A) Ein Schema des Plattenaufbau mit 4 Vertiefungen für jedes einzelne Substrat (grauer Hintergrund = CPH Substrate, orange Hintergrund = ICB Substrate). B) Bild der Testplatte mit dem Substrat. C) zeigt Schema der Pufferbedingungen in diesem Experiment verwendet (200 mM Natriumacetat pH 4,0, Natriumphosphat pH 6,0 und Natriumphosphat pH 8,0). D) Bild der Produktplatte nach 2 h bei 25 ° C. E) Die Extinktionen wurden bei 517 nm detektiert und aufgezeichnet für jeden einzelnen CPH Substrat und F ) ICB Substrat Ergebnisse für die jeweiligen Enzyme. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Die chromogenen Substrate können auch durch Verwendung einer Mischung von verschiedenen farbigen CPH Substrate in einer Vertiefung und der Analyse der Reaktionsüberstand nach Behandlung mit einzelnen Enzymen oder Enzymcocktails zu studieren synergistische Effekte verwendet werden.

In dem folgenden Beispiel wird in Figur 4 wurden mit einer annähernd equ zusammen gemischt rot CPH-Cellulose und gelb CPH-Xylan Substrate gezeigtAl - Verhältnis in 96-Well - Filterplatte Vertiefungen. 4A zeigt die farbigen Reaktionsprodukte nach 1 Stunde Behandlung bei Raumtemperatur ohne Enzym (Kontrolle), Cellulose cel (2 U / ml), Xylanase xyl (1 U / ml) und einem Gemisch beider Enzyme (3 Wiederholungen für jede approach) in 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5. Zur Analyse wurde das Reaktionsprodukt spektrophotometrisch durch Abtasten des Absorptionsspektrums von 350 nm bis 700 nm (4B) quantifiziert. Oft allein visuelle Inspektion kann einen Hinweis darauf geben , ob das Enzym auf ein oder mehrere Substrate wirkt, jedoch Absorptionsspektren von verschiedenen Farbstoffen stamm aufgezeichnet wurden, können auch einfache lineare Regression ⁸ geben eine genauere Anzeige des Ausmaßes des Abbaus jedes Verwendung gelöst werden Substrat aus der Mischung.

CPH Substraten als Mischungen fügt im wesentlichen dem Durchsatz des Assays ermöglicht screening gegen bis zu 4 verschiedene Substrate in einem Experiment (ein Loch). In dem gezeigten Beispiel sind vier verschiedene Substrate verwendet: blau CPH-β-Glucan (Gerste), gelb CPH-Xylan (Buchenholz), grüne CPH-Amylose und rot CPH-pectic Galaktan (Lupine). Das Layout der Substratplatte wird in 4C und ein Bild von der Testplatte in 4D gezeigt. Die Reaktion wurde in 100 mM Natriumacetat-Puffer pH 4,5 für 30 min bei 25 ° C und 150 rpm durchgeführt. Erste einzelne Enzyme mit steigender Enzymkonzentration wurden mit dem entsprechenden CPH Substrat (4E) und der gefärbten Überstand getestet empfangen wurde , wie in der Produktplatte (4F, row 1A - 12D) erwartet. Zeile E enthielt die zwei verschiedene Substrate CPH gelb CPH-Xylan und blauen CPH-β-Glucan, das mit unterschiedlichen Verhältnissen der entsprechenden Enzyme abgebaut wurden endo -xylanase und endo - Glucanase. Nach der Reaktion ist das Ergebnis Visible in der Produktplatte: die Farbe des Reaktionsprodukts war dunkler grün-blau, wenn mehr endo -Glucanase vorhanden war (4F, 4E-6E) und verwandelte sich in eine leichtere gelb-grün, wenn der endo -xylanase Konzentration erhöht ( 4F, 10-12E). Das gleiche ist in der Reihe F, wobei die beiden Substrate rot CPH-pectic Galaktan und gelb CPH-Xylan abgebaut wurden mit Endo -galactanase und endo -xylanase gesehen. Alle vier verschiedenen farbigen CPH Substrat vorhanden waren (4F, 1G-12F) und einzelne Enzyme die entsprechende CPH Substrat abgebaut und durch Zugabe von zusätzlichen Enzymen eine Kombination der farbigen Reaktionsprodukte empfangen wurde.

Figur 4. Eine Kombination von zwei verschiedenen CPH Substrate, rot CPH-Cellulose und gelb CPH-Xylan, mit verschiedenen Enzymen behandelt. EIN) Reaktionsüberstand nach der Behandlung von zwei Substraten mit endo -cellulase (cel) oder endo -xylanase (xyl) oder beide Enzyme. B) Die Absorptionsspektren der Reaktionsstände. Eine Kombination aus vier verschiedenen CPH Substrate mit unterschiedlichen Enzymen behandelt C) Schema der Substratplatte die CPH Substrate enthält. Blau CPH-β-Glucan (Gerste), gelb CPH-Xylan (Buchenholz), grüne CPH-Amylose und rot CPH- pectic Galaktan (Lupine) D) Abbildung des Plattentest die verschiedenen CPH Substrate E) Schema der Produktplatte zeigt das Verhältnis der zugesetzten Enzyme (nominale Konzentration (NC) enthält:.. glu = 1 U / ml endo - Glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo - Amylase und gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Bild von der Produktplatte nach 30 Minuten Inkubation bei 25 ° C. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Substrat	Quelle
CPH-2-Hydroxyethylzellulose	N / A
(CPH-2-HE-Cellulose)
CPH-Amylopektin	Kartoffel
CPH-Amylose	Kartoffel
CPH-Arabinan	Zuckerrübe
CPH-Arabinoxylan	Weizen
CPH-Casein	Kuhmilch
CPH-chitosan	tierischen Ursprungs
CPH-Curdlan	Alcaligenes faecalis
CPH-Dextran	Leuconostoc spp.
CPH-Galactomannan	Johannisbrotbaum
CPH-Laminarins	Laminaria digitata
CPH-Lichenan	Isländisch Moos
CPH-Methyl	N / A
CPH-pachyman	Poria cocos
CPH-pectic Galaktan	Kartoffel
CPH-Pullulan	Aureobasidium pullulans
CPH-Rhamnogalacturonan I (RG I)	Kartoffel
CPH-Rhamnogalacturonan I (-Gal) *	Kartoffel
CPH-Rhamnogalacturonan	Sojabohnen
CPH-Xylan	Buchenholz
CPH-Xyloglucan	Tamarinde
CPH-β-Glucan aus Gerste	Gerste
CPH-β-Glucan aus Hafer	Hafer
CPH-β-Glucan aus Hefe	Hefe
ICB-Arabidopsis	Rosette Blätter von Arabidopsis thaliana Col-0 (Erwachsene Pflanze)
ICB-Arabidopsis Samen	Arabidopsis thaliana
ICB-Bagasse	Saccharum officinarum (getrocknete erwachsenen Pflanze, Stengel und Blätter)
ICB kristalline Cellulose (Filterpapier)	kommerzielle Whatman 3MM Chr Chromatographie Papier
ICB-Bockshornkleesamen	Trigon spp. Samen
ICB-Hanf	Cannabis spp. (Getrocknete erwachsenen Pflanze, Stengel und Blätter)
ICB-Lupinensamen	Blaue Lupine Samen
ICB-Pollen P. pratense	Phleum pratense Pollen
ICB-Fichte	Picea spp. (Miullt Baumstamm)
ICB-Tabak	Blätter von Nicotiana benthamiana (junge Pflanze)
ICB-Weizenstroh	Triticum spp. (Getrocknete erwachsenen Pflanze, Stengel und Blätter)
ICB-Weide	Salix spp. (Getrocknete erwachsenen Pflanze, gefräste Baumstamm)
ICB-Sorghum	Sorghum spp. (Blätter von erwachsenen Pflanze)
* (β-1,4-D-Galactan Seitenketten entfernt mit endo -β-1,4-D-Galactanase)

Tabelle 1 : Liste der verfügbaren Chromogene Polymer - Hydrogel (CPH) und unlöslich Chromogene Biomasse (ICB) Substrate.

Diskussion

Wir sind eine neue Generation von mehrfarbigen CPH und ICB Substraten , die auf Basis angeordnet sind entworfen Kit im Handel erhältlichen Test in einem benutzerdefinierten auf Chlortriazin Farbstoffe (vollständige Liste der Substrate in Tabelle 1). Enzymverdauung der Substrate ergibt kleinen, löslichen, gefärbten Produkte , die in der Testlösung nachweisbar sind und ⁹ unter Verwendung eines Plattenlesegerät quantifiziert werden. Dieser Test zur Bewertung der endo - wirkende Enzyme und die Empfindlichkeit des Assays entwickelt wird , ist ähnlich der, Azurin vernetztem (AZCL) Substrate ¹⁰ verwendet, während andere Verfahren zur exo - wirkenden Enzymen ^11,12 verfügbar sind. Die Einschränkung dieser Testkit liegt in der Erkennung von endo -Enzym - Aktivität, wie CPH sowie die ICB Substrate nicht abgebaut werden durch exo -enzyme wahrscheinlich aufgrund der sterischen Hinderung die sich aus dem Farbstoff und Vernetzermoleküle ^8.

Der Test wird in einer 96-wel durchgeführtl Format und individuelle Reaktionen in den Vertiefungen. Die Reaktion muss in der Platte gemischt werden reproduzierbare Daten zu empfangen. Die resultierenden Überstände werden in eine Produktplatte filtriert, wo die Absorption jeder Vertiefung quantifiziert werden können Absorptionsspektroskopie verwendet wird. Die Grundprinzipien und die Anordnung des Assays sind in Abbildung 1 dargestellt. Der Assay einer Testplatte aus (a 96-Well - Filterplatte) mit den Substraten, und nach der Inkubation mit den Enzymen wird der Überstand durch in eine klare Well - Platte gefiltert und die Extinktionen gelesen eine semi-quantitative Messung der Enzymspezifität und Aktivität bietet. Es hat sich gezeigt, dass diese Screening - Assay CPH Substraten können auch in einer Agarplatte Format verwendet werden, wobei die löslichen Reaktionsprodukte eines farbigen Halo Nach Inkubation über Nacht erstellen. ⁸

Die Assay-Kits können verwendet werden, gereinigte Enzyme zu screenen und ihre möglichen Nebenaktivitäten wie gezeigt inFigur 2. Nebenaktivitäten aus einem einzigen Enzym entstehen und seine promiskuitive Spezifität , sondern auch von einer Tatsache , dass die analysierte Probe eine Mischung von verschiedenen Enzymen und deren synergistischen Effekt muss untersucht werden. Zusätzlich kann , wie es in früheren Studien gezeigt wurde, das Enzym - Cocktails, Darmmikrobiota ¹³ und Kulturbrühen aus Pilzen ⁸ sowie endogene Pflanzenenzym und Bakterien (nicht veröffentlichte Daten) können als Enzymquelle verwendet werden.

ICB Substrate adressieren komplexe Mischungen von Zellwandkomponenten, die häufig in industriellen Prozessen von Biomasse Abbau aufgetreten. Diese Substrate sind so konzipiert, Polysaccharid Verfügbarkeit zu bewerten und geben Auskunft darüber, wie effektiv Abbau Cocktails für eine effizientere Abbau Ausgabe zu optimieren. Wie in Figur 3 CPH und ICB dargestellten Substrate können in Enzymscreening nebeneinander verwendet werden , - eine Fülle von Informationen über eine Enzymspezifität enthülltd Aktivität sowohl im Zusammenhang mit dem bevorzugten Substrat (CPH) und eine natürlichere Komplex enthält andere Komponenten zusätzlich zu dem bevorzugten Substrat enger eine makromolekulare Anordnung in der Natur (ICB) gefunden nachahmt. Die Verwendung mehrerer Farben ermöglicht die gleichzeitige Detektion verschiedener Enzymaktivitäten gegen verschiedene Substrate, die den Hochdurchsatz und Multiplexität des Assays erhöht. Spektren verschiedener Farbstoffe können durch einfache lineare Regression und in den meisten Fällen Multisubstrat-Aktivität durch visuelle Inspektion können allein beobachtet gelöst werden. Ein simuliertes Beispiel eines solchen Experiments und die Ergebnisse ist in Figur 4 dargestellt ist .

Dieser Test Toolbox und die Vielseitigkeit ihrer Anwendung sind sehr gut geeignet für die First-Level-Screening von Enzymen und Kulturbrühen mit unbekannten Aktivitäten. Die wichtigsten Aspekte dieses Assays sind die Hochdurchsatz-Art, Anpassbarkeit, Benutzerfreundlichkeit und Flexibilität. Mit dem im Verstand, we glauben, dass diese neue Reihe von Werkzeugen wird erheblich verbessern und Enzym Screening-Verfahren in der industriellen sowie akademischen Anwendungen beschleunigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Assay-Kit-Platten	Glycospot		kundenspezifische Assay-Kit-Platten
Aktivierungslösung	Glycospot		zur Aktivierung von CPH-Substraten
350 ml Empfängerplatten-Abstandsblock für Vakuumverteiler	Pall Corporation	5015	Spacer-Block
96-Well-MultiScreen HV-Filterplatte, 0,45 & Mikro; m, klare, unsterile	Millipore	MSHVN4510	Assay Plate
96-Well Microtiterplatten, Polypropylen	Greiner Bio-One	651201	Auffangplatte nach dem Waschen der
Substrate Nunc MicroWell 96-Well Microplatten	Thermo Scientific	269620	Produktplatte
Membranpumpe MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	Vakuumpumpe zur Verwendung mit dem Vakuumverteiler
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	horizontaler Schüttler
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-Well-Platten-Absorptions-Reader
Vakuumverteiler Pall	Corporation	5017	Vakuumverteiler
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	Cellulase [cel]
endo-β-1,4-Mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	Mannanase [man]
endo-β-1,3-Glucanase (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-Glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-Galactanase (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	Galactanase [gal]
endo-β-1,4-Xylanase M4 (Aspergillus niger)	Megazyme	E-XYAN4	Xylanase [xyl]
endo-Xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	Xyloglucanase [xg]
α-Amylase (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM-Amylase	[amy]