Methodenartikel

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

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DOI:

10.3791/54294

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25. September 2016

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1Molecular Imaging and Neurovascular Research Laboratory, Dongguk University College of Medicine, 2Biomedical Research Center, Korea Institute of Science and Technology, 3Research Institute of Advanced Materials, Department of Materials Science and Engineering, Seoul National University, 4Departments of Radiology and Cancer Systems Imaging, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Anwendung von kombinierten nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) Bildgebung und Mikrocomputertomographie (microCT) für zerebrale Thromboemboli zu visualisieren. Diese Technik ermöglicht die Quantifizierung von Thrombus Belastung und Evolution. Die NIRF-Bildgebungstechnik zur Visualisierung von Thrombus innerhalb lebenden Tieren unter Verwendung von Gold-Nanopartikeln Thrombus in exzidierten Gehirn fluoreszenzmarkierte, während die microCT Technik visualisiert.

Zusammenfassung

Direkte Abbildung von Thromben visualisiert die Ursache von thromboembolischen Infarkt. Die Möglichkeit, direkt mit Bild Thrombus ermöglicht viel bessere Untersuchung von Schlaganfall als auf indirekte Messungen angewiesen ist, und wird eine starke und robuste vaskuläre Forschung Werkzeug sein. Wir verwenden eine optische Abbildungs ​​Ansatz, der Thromben mit einem molekularen Bildgebung Thrombus Marker-Etiketten - a Cy5.5 nahen Infrarot fluoreszierende (NIRF) -Sonde, die an die Fibrinstränge des Thrombus durch die Fibrin-Vernetzungs enzymatischen Wirkung des aktivierten Gerinnungsfaktors XIIIa während des Prozesses der Gerinnsel Reifung kovalent verknüpft ist. Ein Mikro-Computertomographie (microCT) -basierte Ansatz nutzt Thrombus such Gold-Nanopartikel (AuNPs) die Hauptkomponente des Gerinnsels Ziel funktionalisiert: Fibrin. Dieses Dokument beschreibt ein detailliertes Protokoll für den kombinierten in vivo und ex vivo microCT NIRF Bildgebung von Thromboembolien in einem Mausmodell der embolischen Schlaganfall. Wir zeigen , dass in vivo </ em> microCT und Fibrin-bezogene Glykol-Chitosan - AuNPs (fib-GC-AuNPs) kann zur Visualisierung sowohl in situ Thromben und zerebraler embolischer Thromben verwendet werden. Wir beschreiben auch die Verwendung von in vivo microCT basierten direkten Abbildung von Thromben zu seriell die therapeutische Wirkung von Gewebe - Plasminogen - Aktivator-vermittelte Thrombolyse überwachen. Nach dem letzten Imaging - Sitzung zeigen wir durch ex vivo NIRF das Ausmaß der Abbildung und die Verteilung der Rest Thromboembolien im Gehirn. Schließlich beschreiben wir quantitative Bildanalysen von microCT und NIRF Bilddaten. Die kombinierte Technik der direkten Abbildung von Thromben können zwei unabhängige Methoden der Thrombus Visualisierung verglichen zu werden: der Bereich des Thrombus bezogenen Fluoreszenzsignal auf ex vivo NIRF Bildgebung gegenüber dem Volumen von hochdichtem Fliess microCT Thromben in vivo.

Einleitung

Eine in 6 Menschen irgendwann in ihrem Leben einen Schlaganfall. Der ischämische Schlaganfall ist bei weitem das häufigste Schlaganfall-Typ, und macht etwa 80 Prozent aller Schlaganfällen. Weil Thromboemboli die meisten dieser ischämische Schlaganfälle verursachen, gibt es ein wachsendes Interesse in direkten Abbildung von Thromben.

Es wurde geschätzt , dass etwa 2 Millionen Gehirnzellen während jeder Minute der Arteria cerebri media Okklusion 1, was zu dem Motto "Zeit ist Gehirn" sterben. Die Computertomographie (CT) Untersuchungen können schnell durchgeführt werden und sind weit verbreitet; Aus diesem Grund bleibt die Abbildungs ​​CT der Wahl für die Erstdiagnose und Behandlung von hyper ischämischen Schlaganfall. CT ist besonders wertvoll , um die kritischen frühen Entscheidungen zur Information: die Verabreichung Gewebe - Plasminogen - Aktivator (tPA) für die Thrombolyse und / oder Selektierung endovaskuläre Gerinnsel-Retrieval - 2. Strom CT-basierten Thrombus-Bildgebung kann jedoch nicht seriell verfolgen cerebral Thromboembolien in vivo, da es indirekte Methoden verwendet Thromben zu demonstrieren: nach Kontrastierung des Blut - Pool von jodhaltigen Kontrast werden die Thromben nachgewiesen als Defekte in den Gefäßen zu füllen. Es gibt Dosisgrenzwerte und Risiken im Zusammenhang mit der wiederholten Gabe von jodhaltigen Kontrast, die Abbildung von Thromben auf diese Weise wiederholt nicht aus.

Somit besteht ein kritischer Bedarf an einem direkten Abbildungsmethodik für zerebrale Thromben bei Schlaganfall-Patienten, zu ermöglichen schnellere und bessere Behandlungsentscheidungen getroffen werden. Wir schlagen vor, um dies zu erreichen, indem der Wert von CT Verbesserung der derzeit verwendeten Front Bildgebungsmodalität für Schlaganfall, bei der Verwendung eines Thrombus such nanopartikuläre molekularen Bildgebungsmittel.

Wir haben die Verwendung dieses Mittels mit Mikro-Computertomographie (microCT) gezeigt, ein hochauflösendes ex vivo oder in vivo (kleines Tier) -Abbildung Version von CT, die eine schnelle Datenerfassung ermöglicht 3,4. Auch mit der relativ schlechten Weichteilkontrast für Kleintier microCT (viel schlechter als die von menschlichen Größe Scanner), war das Bildgebungsmittel und Thromben zu suchen können, markieren, indem sie hochdichtem Fliess auf CT machen, ein "dichtes Gefäß Zeichen" durch molekulare verbessert Bildgebung.

Ergänzt wird das CT - Technik hat sich unsere Gruppe entwickelt zuvor eine optische direkten Thrombus Imaging - Technik unter Verwendung von Cy5.5 Nah-Infrarot - Fluoreszenz (NIRF) Sonde zerebralen Thrombus Last 5 zu visualisieren. Dies ist ein Ex - vivo - Technik , die auf post mortem Gehirnen, aber ist sehr empfindlich, und dient in - vivo - Daten in der Forschung Einstellung zu bestätigen.

CT und NIRF basierten Thrombus suchBildgebungsTechniken Nachdem ermöglicht es uns, diese Techniken zu vergleichen und sehr informative Daten über die Rolle des Thrombus und Thrombus-Bildgebung in den Prozess des ischämischen Schlaganfalls Entwicklung zu erreichen.

Here beschreiben wir ein detailliertes Protokoll einer kombinierten Technik der in vivo und ex vivo microCT NIRF Bildgebung direkt Thromboembolien in einem Mausmodell der embolischen Schlaganfall zu visualisieren. Diese einfache und robuste Methoden sind nützlich , unser Verständnis von thrombotischen Erkrankungen voranzubringen , indem ermöglicht die genaue In - vivo - Beurteilung von Thromben Belastung / Verteilung und Charakterisierung der dynamischen Thrombus Evolution in einer raschen und quantitativen Weise in vivo während der Therapie, gefolgt von Ex - vivo - Daten , die dazu dient als Kontrolle und Referenz - Standard für den Nachweis der in vivo - Bildgebung Befunde.

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Protokoll

Alle Tier Verfahren in diesem Protokoll demonstriert wurden von der Dongguk Universität Ilsan Krankenhaus Animal Care und Use Committee und durchgeführt in Übereinstimmung mit den Grundsätzen und Verfahren der Beschreibung in der NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren überprüft und genehmigt.

1. Herstellung von exogen Formed Clot Beschriftet mit Fluoreszenzmarker (Abbildung 1)

  1. Anästhesieren eine Maus in einer Induktionskammer unter Verwendung von 3% Isofluran mit 30% Sauerstoff gemischt (1,5 l / min 100% Sauerstoff). Für ausreichende Tiefe der Anästhesie durch den Muskeltonus zu beobachten und das Fehlen der Zehe Prise Reflex bestätigt.
  2. Legen Sie das Tier auf einem sterilen Tuch in Bauchlage, und halten Sie sie unter Narkose mit einem Inhalationsmaske und 2% Isofluran mit 30% Sauerstoff gemischt. Führen Sie die folgenden Verfahren unter aseptischen Bedingungen und sterile Kittel / Masken / Handschuhe / Instrumente. Pflegen sterilen Bedingungen durch die Reinigung und Desinfektion der Versuchsfläche mit 70% Alkohol, bevor einnd nach den Verfahren.
  3. Sammeln Sie etwa 300 ~ 1000 & mgr; l arteriellen Blut nach Herzpunktur 6. Mischen Sie 70 ul Vollblut mit 30 ul C15 Sonde 5 (20 & mgr; mol / L Konzentration), eine Cy5.5 fluoreszierende Sonde empfindlich auf die Fibrin-Vernetzungs Aktivität von aktiviertem Faktor XIII (FXIIIa) Koagulationsenzym, um fluoreszenz das Gerinnsel zu markieren (Abbildung 1A ). Injizieren Sie die Mischblut unter Verwendung einer 3-ml-Spritze (23-Gauge-Nadel) in einen 20 cm langen Polyethylenschlauch (PE-50, ID 0,58 mm). PE-Schlauch muss sterilisiert (durch Hersteller steril oder zertifiziert) und die Gerinnsel müssen aseptisch in einer Gewebekultur Haube hergestellt werden.
  4. Überprüfen Sie den Tod des Tieres durch das Fehlen der Atmung und Herzpuls beobachtet.
  5. Lassen Sie das Blut gespannte Schlauch bei Raumtemperatur für 2 Stunden, dann bei 4 ° C für 22 Stunden, und die folgenden Verfahren aus , wie zuvor 7 berichtet.
  6. Schneiden Sie den Thrombus enthaltende Rohr in 1,5 cm lange Stücke. Verwendung einer 3 ml-Spritze mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, auszustoßen Thrombus auf eine Platte PBS enthaltenden 6-well durch vorsichtiges PBS in jedes Rohrstück eingespritzt wird. Waschen Sie die Thromben dreimal mit PBS (1B).
  7. Laden den distalen Endabschnitt eines 15 cm langen PE-10-Rohr (ID 0,28 mm) mit einer 1,5 cm langen Thrombus durch vorsichtiges des gewaschenen Thrombus zeichnen, während Luftblasen vermieden wird, mit einer Kochsalzlösung gefüllten 1 ml Spritze mit einer 30 Gauge-Nadel, die in das proximale Ende des Rohres eingeführt wird.
  8. Verbinden des Thrombus belasteten PE-10-Schlauch mit einer 3 cm langen PE-50-Schlauch (ID 0,58 mm) modifiziert, um ein verjüngtes Ende aufweist (ID 200 um), die auf der mittleren zerebralen Arterie (MCA) platziert wird - anterioren zerebralen Arterie (ACA) Bifurkation Bereich der A. carotis interna (ICA) in einem Mausmodell der embolischen Schlaganfall (1C).

2. Modellieren eines Maus-Modell von thromboembolischen Schlaganfall (Abbildung 2)

  1. Anesthetizea verschiedenen Maus strich zu werden , wie zuvor berichtet , 7 in einer Induktionskammer unter Verwendung von 3% Isofluran mit 30% Sauerstoff gemischt (1,5 l / min). Injizieren Meloxicam (5 mg / kg) subkutan postoperative Schmerzen zu lindern. Für ausreichende Tiefe der Anästhesie durch den Muskeltonus zu beobachten und das Fehlen der Zehe Prise Reflex bestätigt.
  2. Eine kleine Menge von Tier Salbe für jedes Auge Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern. Führen Sie die folgenden chirurgische Eingriffe unter aseptischen Bedingungen und sterile Kittel / Masken / Handschuhe / Instrumente. Aufrechterhaltung steriler Bedingungen, die Reinigung und Desinfektion des Operationsfeldes mit 70% Alkohol vor, während und nach der Operation.
  3. Bewegen Sie die Maus auf einem Operationstisch. Legen Sie das Tier auf einem sterilen Tuch in Bauchlage, und halten Sie sie unter Narkose mit einem Inhalationsmaske und 2% Isofluran. Dann klemmen die Körpertemperatur bei 36,5 ° C eine homeothermic Decke unter Verwendung mit Feedback von einem Rektalthermometers.
  4. Nach surgical prep mit Betadin und 70% Alkohol, ein 1 cm vertikalen Einschnitt durch ein Skalpell auf der Kopfhaut zwischen dem linken Ohr und Auge mit. Kleben, das distale Ende der optischen Faser von einem Laser Doppler Flowmeter auf die freiliegende linke Schläfenbeinfläche (1 mm nach links und 4 mm unterhalb vom Bregma). Starten Sie dann Doppler Flussüberwachung (2A).
  5. Legen Sie das Tier nach unten. Richten Sie den Hals, indem sie mit einer Schnur an der oberen Frontzahn ziehen an einem Stift befestigt ist und den Halsbereich rasieren. Dann machen Sie eine 3 cm vertikalen Mittelschnitt, verbreiten sie auf, und setzen Sie die linke Carotis Glühbirne Bereich von peri-vaskulären Weichgewebe seziert. Seien Sie vorsichtig, nicht den Vagus-Nerv zu verletzen.
  6. Ligieren der linken proximalen Arteria carotis communis (CCA) eine sterile 6-0 schwarze Seidennaht mit und abzubinden den linken ICA und die linke pterygopalatinum Arterie (PPA) mit sterilen 7-0 schwarzen Seidenfäden.
  7. Cauterize die linke Arteria thyreoidea superior, die ein Zweig der linken Arteria carotis externa usi istng eine monopolare Elektrokauter und abzubinden der linken proximalen A. carotis externa (ECA) lose und die weiter entfernten Standort fest steril 7-0 schwarze Seidenfäden verwendet.
  8. Mit Hilfe eines Mikro-Schere, machen ein kleines Loch (etwa 0,2 bis 0,25 & mgr; m Durchmesser) zwischen den ligierten Stellen des ECA.
  9. Setzen Sie den Thrombus enthaltenden Katheter in das Loch in der ECA, während das proximale ECA Ligatur lösen. Ziehen Sie die proximale ECA Ligatur wieder, nachdem der Katheter in die CCA um Vorschieben des Katheters an Ort und Stelle auf Cinch.
  10. Cauterize die ECA distalen Teil zu schneiden, die an das distale Ligierungsstelle entfernt ist, und drehen Sie das freie proximale ECA im Uhrzeigersinn es der ICA auf die Richtung ausrichten, während der Katheter aus dem CCA zurückzuziehen. Dann Voraus, um den Katheter etwa 9 mm in den MCA - ACA Gabelung Bereich des distalen ICA unmittelbar nach der ICA-Ligatur lösen. Dann ziehen Sie die ICA-Ligatur.
  11. Setzen Sie den Thrombus in den Bereich Gabelung von sanftDie Spritze 1 ml Drücken des Thrombus zu injizieren. Überprüfen die Abnahme der Doppler zerebralen Blutflusses (CBF), die um 30% oder weniger im Vergleich zum Ausgangswert gesenkt werden sollte, wenn der Thrombus erfolgreich das Gefäß (2B) okkludiert.
  12. Entfernen Sie den Katheter und abzubinden die ECA proximalen Stelle unmittelbar und fest. Darüber hinaus unligate die CCA und die PPA.
  13. Schließen Sie die Inzisionsstelle mit 6-0 Seidennähten. Stopp Anästhesie nach der Doppler-Überwachung über eine erforderliche Zeitspanne weiter (hier für 30 Minuten nach der Thrombus Injektion). Bringen Sie die Maus in einem leeren Käfig und warm halten mit einer Wärmelampe. Sie nicht die Maus unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage gewonnen hat.

3. In Vivo Imaging MicroCT der zerebralen Thrombus (Abbildung 3)

  1. Re-anästhesieren die Maus mit 2% Isofluran, wie im Schritt 2.1 in einer vorgegebenen Zeitpunkt beschrieben (hier 1 h) nach dem Beginnembolischer Schlaganfall aufgrund der Platzierung des Thrombus in der Arteria cerebri. Für ausreichende Narkosetiefe durch das Fehlen des Zehen pinch reflex bestätigt. Eine kleine Menge von Tier Salbe für jedes Auge Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
  2. Resuspendieren Fibrin-bezogene Goldnanopartikel (fib-GC-AuNP 4) in einer Konzentration von 10 mg Au / ml in 10 mM PBS, und beschallen den Thrombus Bildgebungsmittel für 30 min Auflösung und Dispersion der Nanoteilchen zu gewährleisten. Inject 300 ul fib-GC-AuNP (10 mg / ml) in den Penis injiziert.
  3. Legen Sie das Tier auf dem Bett eines microCT Maschine und strecken den Hals durch die obere Frontzahn mit einer Schnur ziehen an einem Stift befestigt Bewegungsartefakte zu reduzieren.
  4. Bei 5 min nach der Injektion von fib-GC-AuNP beginnen microCT Bilder des Gehirns zu erhalten. Für die hier beschriebenen Experimente, verwenden Sie die folgenden Abbildungsparameter: 65 kVp, 60 & mgr; A, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 Sichtfeld, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 Voxelgröße, 100 Millisekunden pro Frame, 1 Mittelung, 360 Ansichten, 512 x 512 Rekonstruktionsmatrix, 600 Scheiben, 64 sec Scan - Zeit.
  5. Bringen Sie die Maus in einem leeren Käfig und warm halten mit einer Wärmelampe. Sie nicht die Maus unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage gewonnen hat.
  6. Verwandeln Sie die rohen Bilddaten in Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) Format der 'Start' Befehl des "Reconstruction" Panel in einem Software - Paket auf dem microCT Scanner installiert ist .
  7. Für die quantitative Analyse der Bilder (in Schritt 6), transformieren die DICOM-Daten in TIFF-Format, das von einem im Handel erhältlichen Software-Paket gemäß den Anweisungen des Herstellers.
  8. Für die qualitative als auch quantitative Analysen wie in einer einfacheren und schnelleren Weg analysiert, verwenden Sie das Software-Paket und die ursprünglichen 0.054 mm dicke Bilder im DICOM-Format für einen neuen Satz von ErzeugungAxial- und koronalen Bildern gemacht 1 oder 2 mm haben (hier: 2 mm) Dicke, wie folgt.
    1. Wählen Sie den DICOM - Ordner auf der 'Datenquelle' Baum, klicken Sie mit der rechten Maustaste, und importieren Sie den Ordner 'MasterDb' oder 'PrivateDB'.
    2. Klicken Sie auf die 'MasterDb' oder 'PrivateDB' in der 'Datenquelle' Baum und wählen Sie den Ordner importiert. Nach einem Klick auf die Registerkarte "3D" auf der linken Tafel, wenn das Fenster "Ladeoptionen" erscheint, drücken Sie auf "OK" eine Folge von Bildern im Ordner als Stapel zu importieren.
    3. Ändern Sie die Bilddarstellung auf Maximum Intensity Projection (MIP) Format durch das Wort das Anklicken von 'MRP' in der axialen und koronalen Bildfenster und wählen Sie "MEP" auf dem Pop-up - Menü. Dann ändern Sie die Bilddicke bis 2 mm nach 'TH: 0 [mm] "klicken in den gleichen Fenster.
    4. Mit der 2 mm Breite 3D-navigator Bar, die für die Erkundung eines Bildstapels und schneiden es in einem geeigneten Winkel und Lage, bereiten eine 2 mm dicke axiale Schnittbild mit voller Deckung des Kreises von Willis (KUH), die Thromben birgt ermöglicht. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste (Kamerasymbol) auf der 'Ausgang' Panel. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.
  9. Dann bereiten fünf 2 mm dicke koronale Schnittbilder, die zusammenhängend von der Frontallappen des Kleinhirns decken.
    1. Zuerst bereiten die zweite Scheibe durch sorgfältig die Navigationsleiste auf der axialen Bild ausrichten, so dass das koronale Bild am besten, den MCA zu visualisieren - ACA Thromben.
    2. Als nächstes die anderen vier Scheiben in einer zusammenhängenden Weise vorzubereiten. Klicken Sie auf die Aufnahmetaste (Kamerasymbol) auf der 'Ausgang' Panel. Speichern Sie die Bilder im TIFF-Format.

4. Die Thrombolyse und In - vivo - Imaging von MicroCT Cerebral Thrombus (Abbildung 3)

  1. Bereiten Sie eine 100 cm lange PE-10 Rohr mit einer 30-Gauge-Nadel an einem Ende und einer 1 ml Spritze am anderen Ende. Füllen Sie das Rohr mit entweder Kochsalzlösung (600 ul) oder tPA (hier 24 mg / kg, 600 & mgr; l), während Luftblasen vermeiden.
  2. Wieder anästhesieren die Maus wie in Schritt 2.1 beschrieben. Legen Sie die Nadelspitze innerhalb des Penis Vene des Tieres. Legen Sie das Tier vorsichtig auf das Bett der microCT Maschine. Dann immobilisieren und die intravenös injiziert Teil des Kathetersystems zu stabilisieren, indem sie auf das Bett Taping.
  3. Führen Sie eine Follow-up-Imaging-Sitzung als Vorbehandlung Baseline. Dann injizieren entweder 60 & mgr; l normaler Salzlösung oder tPA durch den Spritzenkolben in den Kathetersystem gedrückt wird. Nach der Bolus-Injektion, beginnen, die verbleibende Lösung (540 ul) über einen Zeitraum von Zeit zu infundieren (hier: 30 min).
  4. Erhalten microCT Bilder die gleichen Parameter wie in dem Schritt 3.4 an vorgegebenen Zeitpunkten: hier bei 3 und 24 Stunden nach der Bolus-Injektion. Zur Durchführung der folgenden ex vivo NIRF ThromBus-Bildgebung des Gehirns, das Tier unter Narkose durch Genickbruch einschläfern.

5. Ex Vivo NIRF Thrombus Imaging und Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) Anfärbung von Gehirngewebe (Figur 4)

  1. die Kopfhaut Nach Enthauptung, zu entfernen und mit einer Schere aus dem Foramen magnum nach oben in Richtung der Pfeilnaht durch den Schädel geschnitten. Entfernen Sie die Schädelkalotte durch sorgfältig die Ränder des eingeschnittenen Schädel erhebend Schere, während eine Verletzung des zugrunde liegenden Gehirns zu vermeiden, wodurch die Hemisphären Freilegung.
  2. Schneiden die Sehnerven im Gehirn Basis aus möglichst nahe an der Hirnoberfläche, weil sie mit dem Kreis von Willis Arterien überlappen könnten, die auf NIRF Bildgebung sichtbar gemacht werden sollen. Dann, um deutlich die Y-Form 'MCA / ACA / distal ICA' für die NIRF Thrombus-Bildgebung sichtbar zu machen, schneiden Sie das distale ICAs so weit wie möglich, um die Gehirnoberfläche nach sanft die zerebelläre Basis Komprimieren th aussetzene Schnittstellen (4A).
  3. Führen Sie NIRF Bildgebung (Anregung / Emission 675/690 nm; 1 s Belichtung) des entfernten Gehirngewebe mit seiner Basis nach oben zeigt (4B, C), die die fluoreszenzmarkierten Thromboembolien in den Arterien des COW (4D) visualisiert . Führen Sie dann zusätzliche Bildgebung mit dem Scheitel des Gehirns zeigt nach oben, die kortikale Thromboembolien visualisiert. Vermeiden Trocknen des Gehirns durch ein paar Tropfen Kochsalzlösung auf das Gewebe setzen.
  4. Mit einer Gehirnmatrixvorrichtung gemäß den Anweisungen des Herstellers, schnell 2 mm dicke Gehirnscheiben bereiten koronalen: 6 Stücke von 2 mm dicke Scheiben (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm vom Bregma). Vermeiden Trocknen der Hirnschnitten durch saline Tropfen verwenden, und führen NIRF Bildgebung von der Vorder- und Rückfläche der Abschnitte.
  5. Setzen Sie die Gehirnscheiben in 2% Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) -Lösung für 20 Minuten, während Exposition vermeiden zu light. Dann bewegen sich die Scheiben in 4% Formaldehyd-Lösung bei 4 ° C, während der Belichtung zu vermeiden.

6. Quantifizierung der Thrombus Bereich über MicroCT Bilder und ImageJ (1.49d) Software (Abbildung 5)

  1. Bilder öffnen (5A).
    1. Bild öffnen Sequenzdateien , indem Sie "Datei> Importieren> Bildsequenz" oder "Datei> Öffnen" einen Stapel - Datei zu erstellen. Konvertieren Sie die Bilder in 8-Bit - Graustufen unter Verwendung von 'Bild> Typ> 8-Bit ".
  2. Konvertieren Sie die Einheit von Zoll auf Millimeter (5A).
    1. Wenn ein Pixel von Dateien CT - Bild zu 0.053 mm entspricht, verwenden Sie 'Analysieren> Set - Skala' eingeben '1', '0.053 "und" mm "für" Abstand in Pixeln "," bekannte Strecke "und" Längeneinheit ', beziehungsweise.
    2. Wenn (nur) ein Maßstab zur Verfügung steht,mit dem "Straight Line" Werkzeug, um eine Linie mit einer Länge gleich der der Skalenleiste ziehen. Verwenden Sie dann 'Analysieren> Set - Skala " , um die Länge der Maßstabsleiste in Millimeter eingeben.
  3. Hintergrundsubtraktion (5B)
    1. Durch die Verwendung von "Bearbeiten> Auswahl> Geben Sie " Ort , um einen kreisförmigen oder rechteckigen Region von Interesse (ROI) auf einer Fläche von Hirnparenchym ohne Thrombus oder knochenbezogenen dichtem Fliess Regionen. Da der angegebene ROI zu jeder Scheibe des Stapels gilt, vergewissern Sie sich, wenn es nicht mit hochdichtem Fliess Regionen in jeder Scheibe überlappt wird.
    2. Wählen Sie 'Plugin> ROI> BG Subtraktion von ROI' und geben Sie 2.0 für die "Anzahl der STABW von mean '.
  4. Segmentierung von Thromboembolie bezogenen dichtem Fliess Läsionen (5C)
    1. Wählen Sie "Bild> Anpassen> Threshold" und geben Sie die Werte von "Lower zum Schwellenwert "und" Obere Schwelle Ebene "als 22 bzw. 255. Wählen Sie "Over / Under" Pixel unter dem unteren Grenzwert anzuzeigen , in blau, schwellen Pixel in Graustufen und Pixel über dem oberen Grenzwert in grün.
    2. Verwenden Sie das "Freehand Selection Tool 'ROIs zu zeichnen, die Thromboembolien bezogene dichtem Fliess Läsionen umgeben ohne knöchernen Bereiche einschließlich. Während der Zeichnung, halten Sie entweder [Shift] drücken oder [alt] hinzufügen oder eine Region zu entfernen sind.
      Hinweis: Wenn dichtem Fliess thromboembolischen Läsionen entfernt sind von knöchernen Strukturen, statt des "Freihandauswahl-Werkzeug", "Zauberstab-Werkzeug" kann sicher ohne seine "Toleranz" Ebene verwendet werden, zu verändern.
  5. Quantifizierung der segmentierten Läsionen (5D)
    1. Verwenden Sie "Analysieren> Set Messungen 'wählen' Area ',' mittlere Grauwert" und "Integrierte Dichte (Area X Mittelwert)9 ;. Überprüfen Sie die folgenden Optionen: "Beschränken auf Threshold" und "Display Label". Verwenden Sie "Analysieren> Messen" die quantifizierten Daten zu erhalten. Speichern Sie dann die Ergebnisse als ".xls" Datei.
    2. Speichern Sie die Stapeldatei im TIFF-Format. 'Analysieren> Tools> ROI - Manager' Darüber hinaus nutzen die ROIs zu speichern.

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Ergebnisse

Baseline microCT Bilder, in vivo , erhalten nach Verabreichung fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 & mgr; l) bei 1 h nach embolischen Schlaganfall, deutlich zerebralen Thrombus im MCA visualisiert - ACA Bifurkation Bereich des distalen Arteria carotis interna (Abbildung 6 ). Follow-up microCT Bildgebung zeigte keine Veränderung in der COW Thrombus mit Salzbehandlung. Die Behandlung mit tPA zeigte eine allmähliche Auflösung des Thrombus COW (blaue Pfeile in ...

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Diskussion

Wir haben gezeigt , die Verwendung von zwei komplementären molekularen Bildgebungstechniken für die direkte Abbildung von Thromben in experimentellen Modellen der embolischen Schlaganfall: eine Fibrin- Goldnanopartikel gezielte (fib-GC-AuNP) für in vivo microCT basierte Abbildungs und eine FXIIIa gezielte optische Abbildungssonde zur ex vivo Fluoreszenz - Bildgebung.

Nach intravenöser Verabreichung von fib-GC-AuNPs wurde Thromben sichtbar CT als dichte Strukturen, verursach...

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Offenlegungen

DE.K., JY.K, CH.A und KK sind die Patentinhaber des Fibrin-bezogenen Gold-Nanopartikel (10-1474063-0000, Korean Intellectual Property Office). Die übrigen Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der Korea Healthcare Technology R & D-Projekt, das Ministerium für Gesundheit und Soziales (HI12C1847, HI12C0066) unterstützt, die Bio & Medical Technology Development Program (2010-0019862) und Global Research Lab (GRL) Programm (NRF-2015K1A1A2028228) des national Research Foundation, von der koreanischen Regierung finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Machines
microCTNanoFocusRay, JeonJu, KoreaNFR Polaris-G90
NIRF-BildgebungssystemRoper-scientific, Tucson, AZcoolsnap-Ez Laser Doppler
DurchflussmesserPerimed, Stockholm, SchwedenPeriFlux System 5000
OperationsmikroskopLeica Microsystems, Seoul, KoreaEZ4HD
Inhalations-AnästhesiegerätPerkinElmer, Massachusetts, USAXGI-8
SoftwareNFR-Steuerung
LucionInfinitt, Seoul, KoreaLucion3D-Rendering-Imaging-Software
Labordiagramm 7ADInstruments, Colorado, USALabordiagramm 7rCBF
ImageJ SoftwareWanye Rasband, NIH, USA1.49dBildanalyse
Geräte/Instrumente
InfusionspumpeHarvard, Massachusetts, USAPumpe 22(55-2226)
Homöotherme DeckePanlab, Barcelona, SpanienHB101
TaschenkauterDaejong, Seoul, KoreaDJE-39
GehirnmatratzeTed pella, CA, USA15003koronaler Schnitt
PE-50 SchlauchNatsume, Tokio, JapanSP-45(PE-50)I.D. 0,58 mm AD 0,96 mm
PE-10 SchlauchNatsume, Tokio, JapanSP-10(PE-10)I.D. 0,28 mm AD 0,61 mm
30 Gauge NadelSungshim-medical, Seoul, Korea
SpritzeCPL-medical, Ansan, Korea1 & 3 cc
GazePanamedic, Cheonan, Korea
TapeScotch, Seoul, Korea3M-810
MikropinzetteFine Science Tools, Vancouver, Kanada  11253-27Dumont #L5
MikroschereFine Science Tools, Vancouver, Kanada15000-03Vannas
FederschereFine Science Tools, Vancouver, Kanada14084-088,5 cm
Naht aus schwarzer SeideAilee, Busan, KoreaSK6071, SK7286-0 und 7-0
Reagenzien
meloxicamYuhan, Seoul, Korea
TierarztsalbeNovartis, Basel, Schweiz
10% Povidon-Jod (Betadin)Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3Sigma, Missouri, Vereinigte Staaten157740-5G
TTCAmresco, Ohio, USA0765-100g
IsofluranHana-Pham, Gyeonggi, KoreaIfran100 ml
PBSWelgene, Daegu, KoreaLB001-02500 ml
GoldnanopartikelSynthese
C15 optisches MittelSynthese
GewebeplasminogenaktivatorBoehringer Ingelheim, Biberach, DeutschlandrtPA(actilyse)20 mg
Normale KochsalzlösungDaihan Pham, Seoul, Korea48N3AF320 ml
NanoFocusRay, JeonJu, Korea NFR Polaris-G90 microCT-Steuerungssoftware

Referenzen

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  2. Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
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