Methodenartikel

Ein hoher Gehalt In Vitro Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

DOI:

10.3791/54298

⸱

16. Juli 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Verlust von insulinproduzierenden β-Zellen ist ein zentrales Merkmal von Diabetes. Während eine Vielzahl potenzieller Ersatztherapien erforscht wird, bleibt die Expansion von endogenen insulinproduzierenden Pankreasinseln β-Zellen eine attraktive Strategie. β-Zellen haben eine begrenzte spontane regenerative Aktivität; Daher besteht eine entscheidende Forschungsanstrengung darin, ein genaues Verständnis der molekularen Signalwege zu entwickeln, die das Wachstum β Zellen hemmen, und Medikamente zu identifizieren, die in der Lage sind, diese Einschränkungen zu überwinden. Hierin wird ein automatisiertes, bildbasiertes High-Content-Primärzell-Screening-Verfahren zur Identifizierung von β-Zellreplikations-fördernden kleinen Molekülen vorgestellt. Mehrere Einschränkungen früherer Methoden werden überwunden. Erstens maximiert die Verwendung von primären Inselzellen anstelle einer immortalisierten Zelllinie die Beibehaltung von in vivo Wachstumshemmnissen. Zweitens ermöglicht die Verwendung von Inselzellkulturen mit gemischter Zusammensetzung anstelle einer β-Zelllinie die Identifizierung sowohl linienbeschränkter als auch allgemeiner Wachstumsstimulatoren. Drittens macht die Technik die Verwendung von primären Inseln, einer begrenzenden Ressource, durch die Verwendung eines 384-Well-Formats praktisch. Viertens wird die nachteilige experimentelle Variabilität, die mit der unregelmäßigen Qualität der Inselkulturen verbunden ist, durch die Optimierung von Isolations-, Dispersions-, Plattierungs- und Kulturparametern überwunden. Fünftens werden die Schwierigkeiten bei der genauen und konsistenten Messung der niedrigen basalen Replikationsrate von endokrinen Inselzellen durch optimierte Immunfärbeparameter, automatisierte Datenerfassung und Datenanalyse überwunden; Die Automatisierung erhöht gleichzeitig den Durchsatz und begrenzt die Verzerrung des Experimentators. Bemerkenswerte Einschränkungen dieses Assays sind die Verwendung von dispergierten Inselkulturen, die die Inselarchitektur stören, die Verwendung von Nagetieren anstelle von menschlichen Inselzellen und die inhärenten Einschränkungen des Durchsatzes und der Kosten, die mit der Verwendung von Primärzellen verbunden sind. Wichtig ist, dass die Strategie leicht für Studien zur Replikation menschlicher Inselzellen angepasst werden kann. Dieser Assay eignet sich gut, um die mitogene Wirkung von Substanzen auf β-Zellen und die molekularen Mechanismen, die das Wachstum β-Zellen regulieren, zu untersuchen.

Einleitung

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Diabetes umfasst eine Sammlung von Störungen des gemeinsamen Endpunktes gestörter Glukose-Homöostase zu teilen. Obwohl die pathogenen Mechanismen von Diabetes - Subtypen unterschieden sind, sie die Folge einer verminderten β-Zellmasse teilen, dh Verlust von Insulin Produktionskapazität 1,2. Derzeit verlassen Diabetes Behandlungsstrategien auf die chronische Verabreichung von exogenen Insulin, pharmakologische Stimulation der Insulinproduktion oder Verbesserung der Insulinempfindlichkeit und in seltenen Fällen die Transplantation von Pankreas - Inseln oder ganze Bauchspeicheldrüse 3,4. Leider ist der Erfolg dieser Strategien ist von kurzer Dauer und / oder nicht in ausreichendem Maße die Funktion der endogenen Insulinproduktion rekapitulieren. Trotz der Nützlichkeit, ein Verfahren zur Entwicklung von β-Zell-Regeneration zu stimulieren, kein solcher Ansatz vorhanden ist. Folglich ist ein wichtiges Ziel der Diabetesforschung , Methoden zu entwickeln neue β-Zellen zu erzeugen , oder endogene β-Zellmasse 5 zu erweitern . Obwohl β-Zellregeneration aus erneuerbaren Quellen wie embryonale Stammzellen voranschreitet , Sicherheit und Effizienz betrifft , um die Verfolgung alternativer Strategien, einschließlich der Erweiterung der reifen β-Zellen, eine Priorität 6,7. Wichtig ist , ist die vorherrschende Quelle von neuen β-Zellen in vivo vorbestehenden β-Zellen und nicht spezialisierte Vorläuferzellen 8,9. Obwohl β-Zellen begrenzte Replikationskapazität, eine geringe Zunahme der β-Zellmasse zu haben scheinen (~ 30%) ausreichend sein Glucosehomöostase in viele Diabetiker wiederherzustellen. Darüber hinaus ist in situ pharmakologische Stimulation der β-Zellmasse eine potentiell kostengünstige und skalierbare Behandlungsstrategie. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung von kleinen Molekülen, die β-Zellwachstum stimulieren dargestellt.

Eine Vielzahl von in vitro experimentellen Methoden verwendet werden können Genprodukte und / oder Moleküle zu identifizieren , That fördern primäre β-Zell-Replikation. Frühe Bemühungen für β-Zell - Replikation Induktionsmessung verwendet fötalen Nagetier Bauchspeicheldrüsen Kultur oder intakte isolierte Inselkulturen zu messen [3 H] Thymidin - Einbau, BrdU - Einbau oder mitotischen Körper innerhalb der Aldehyd-Thionin oder Insulin gefärbten Population als Reaktion auf bestimmte Behandlungsbedingungen 10, 11. Diese in - vitro - Ansätze und nahe Varianten davon haben einige Einschränkungen. Prominent Mängel umfassen (1) die Verwendung von fetalen Zellen , die, im Gegensatz zu reifen β-Zellen, eine hohe basale 12 in einer bestimmten Weise reguliert β-Zellreplikationsrate und das Wachstum anzuzeigen; (2) die subjektive Natur der Experimentator abhängigen Jurierung von β-Zellen-Replikationsereignisse; (3) die arbeits- und zeitintensiv Natur der Experimentator abhängige Zählung von β-Zellen-Replikationsereignisse verzögert experimentellen Durchsatz; (4) die Nutzung der Kern Einbau / Fleck / Aussehen Replikation zu identifizieren, selbstts und eine nicht-überlappenden zytoplasmatischen stain β-Zellen zu identifizieren, führt zu Fehlattribution von proximalen nicht-β-Zell-Replikationsereignisse-Zellen ß.

In jüngerer Zeit reifen haben primäre β-Zellen , die die Auswirkungen von Transgen Überexpression sowie Genprodukts oder Verbindung Behandlung auf β-Zell - Replikation 13-16 zu bewerten verwendet worden. Allerdings haben diese Studien auch auf subjektive Zählen von Replikationsereignisse verlassen, zytoplasmatische staining- oder nicht-spezifischen Methoden für die β-Zellen - Identifikation und / oder arbeitsintensive Schritte , die den Durchsatz begrenzen, beispielsweise einzelne Einschub gut Plattieren von Zellen oder intakten islet Paraffineinbettung und Verarbeitung 17. Bemerkenswert ist , ein bildbasiertes menschliche β-Zellreplikation Screening Methode, ähnlich der hier vorgestellten, wurde 18 veröffentlicht wurde ; jedoch hat erfolgreiche Verwendung dieses Assays nicht nachgewiesen werden, und die Verwendung von menschlichen Inseln zur Vorabsiebung nicht breit sein FEAwortlich.

Eine alternative Strategie zur Identifizierung von Replikationsfördernde Substanzen das Wachstum Induktion von β-Zelllinien zu bewerten. Erste Versuche umgewandelt β-Zell-Linien verwendet wie MIN6 Zellen oder INS 832/13-Zellen 14,19-21. Allerdings zeigen diese Zelllinien ungebremst Wachstum und wenig Ähnlichkeit mit gut differenzierten β-Zellen 22. Folglich wachstumsInduktionsLeistung ist minimal, unklarer Relevanz und manchmal schwer zu rekapitulieren. Eine verbesserte Strategie für die zellbasierte Screening - Linie nutzt Zellen "reversibel umgewandelt" , das Wachstum in Abwesenheit von Tetracyclin (Doxycyclin) -abhängigen SV40 T - Antigen - Expression 23,24 verhaftet sind. Es ist jedoch unklar, ob diese Zellen zu einer "normalen" β-Zell-ähnlichen Zustand auf Doxycyclin Entfernung zurück. Leider hat die Verwendung dieser Zellen verallgemeinert wachstumsfördernden Verbindungen ergab, dass offenbar nicht unmittelbaren Nutzen haben24. Insgesamt ist die Verwendung von Zell-Linien Wachstumsregulation eines Zelltyp - Anzeige von minimal spontane Replikationsaktivität zu studieren , können begrenzte Anwendbarkeit aufweisen.

Die β-Zellreplikation präsentiert Screening - Plattform hierin verwendet reifen primären Ratten - β-Zellen in vivo Wachstumsregulierung in dem Maße möglich, Inselzellkulturen von gemischten Zelltyp - Zusammensetzung zu erhalten Identifizierung von Lineage-restricted wachstumsfördernden Aktivitäten zu ermöglichen, multi -well Formatierung Durchsatz und automatisierte Analyse zu maximieren Bias zu beseitigen und den Durchsatz zu erleichtern. Der erfolgreiche Einsatz dieser Plattform hat Identifizierung mehrerer Verbindungen aktiviert , die β-Zell - Replikation 25,26 fördern. Zusätzlich wurde der Test für die Struktur-Wirkungs-Beziehung Studien und chemischen epistasis Experimenten verwendet worden mechanistische Einblicke in die molekulare Regulation von β-Zell-Replikation zu ermöglichen. Die vorgestellte Plattform wurde erfolgreich angepasst for lentiviralen RNAi-basierte Untersuchung von β-Zell - Replikation Pfade 25. Einschränkungen des Tests umfassen Skalierbarkeit (Verwendung von Primärzellen) beschränkt, die Verwendung von Nagetier anstatt menschlichen Inselzellen (obwohl der Test auf menschlichen Insel Studien angepasst werden kann), Aufwendungen im Zusammenhang mit Antikörper-basierte Bildgebung und primäre Insel Nutzung, die Nutzung von dispergierten Inseln (gestört islet Architektur) automatisierten Bildaufnahme und die Abhängigkeit von der Verfügbarkeit eines automatisierten Mikroskop mit Bildaufnahme und Analysefähigkeit zu erleichtern. Obwohl eine leichte In - vivo - Screening - Methodik Genprodukte oder zur Identifizierung von Verbindungen , die β-Zell - Regeneration in situ stimulieren ideal wäre, eine solche Plattform ist noch nicht 27 zur Verfügung. Folglich ist die beschriebene Plattform geeignet für Forscher interessiert sich für die meisten Aspekte der β-Zell-Replikation zu untersuchen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll wurde in Übereinstimmung mit der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der Stanford University School of Medicine durchgeführt. 300 g - Das beschriebene Protokoll wird von sechs 250 für Inselisolierung skaliert (8 - 9 Wochen alte) männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 228 Wells einer 384-Well-Platte für die Inselzellen-Replikationsabschätzung zu erzeugen ausreichend ist.

1. Material Vorbereitung

  1. Bereiten Beschichtungsmedien vor Beginn der Inselisolierung durch den konditionierten Medien von 804G Rattenblasenkarzinom - Zellen bei Konfluenz für 3 Tage (20 ml RPMI1640) gehalten Sammeln in einer 15 cm - Gewebekulturschale 28. Sterilfilter und zu speichern (-20 ° C) das konditionierte Medium für die spätere Verwendung.
  2. Sterilisieren chirurgische Instrumente (eine 12 cm Zahngewebe Zange, ein 11,5 cm feinen Schere, ein 14,5 cm chirurgische Scheren, zwei 16 cm gebogenen Pinzette, ein 12 cm gebogen hemostat, ein 12 cm Skalpell Griff) und ein 30 mesh Gewebe Sieb vor initiating Inselisolierung.
  3. Vorbereitung pankreatischen Verdauungslösung durch eine 60% ​​zum Auflösen: 40% Mischung von gereinigtem Klasse I: Klasse II Kollagenasen (total Kollagenase - Aktivität von 300.000 - 400.000 Einheiten) in 60 ml 1x Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) , supplementiert mit Calcium und Magnesium. Last 10 ml Pankreasverdauungspuffer in 10 ml Spritzen (sechs) mit einem 1 "22 G Nadel und auf Eis.
    Anmerkung: 10 ml Aufschlußlösung pro Ratte injiziert. Skalieren entsprechend.
  4. Bereiten 4,5 ml des Anästhetikums Cocktail in einer belüfteten Haube von 1,3 ml Ketamin Mischen (100 mg / ml), 0,2 ml Xylazin (100 mg / ml) und 3 ml PBS. Bereiten Sie das Anästhetikum Cocktail innerhalb 1 Stunde von Inselisolierung zu initiieren.
  5. Bereiten Waschpuffer durch Zugabe von 25 ml Serum von neugeborenen Kälbern auf 500 ml HBSS. Legen Waschpuffer auf Eis für die spätere Verwendung.
  6. Bereiten Sie 1 Flasche Insel Medium , das 500 ml niedriger Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle - Medium (DMEM) ist, 50 ml fötales Rinderserum (FBS), 5.000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin.
  7. Bereiten Inselfunktion Medium von Funktionalität / Lebensfähigkeit Lösung (500 ml) mit 2% FBS, 2 mM Glutamin, 5 mM Glucose, 5,000 Einheiten / ml Penicillin und 5000 & mgr; g / ml Streptomycin. Speichern Sie die Inselfunktion Medien (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
  8. Vorbereitung 40 ml Puffer durch Zugabe von 2,5 ml Esel Blockierungsserum und 0,12 ml Triton X-100 bis 37,38 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Store Blockierungspuffer (4 ° C) für eine spätere Verwendung.
  9. Besorgen Sie sich die benötigten Antikörper vor, das Protokoll zu initiieren.
    Hinweis: PDX-1 (TRITC) und Ki-67 (FITC) Co-Färbung ist für die primäre β-Zell-Replikation-Screening verwendet. zusammen mit Kern (DAPI), PDX (Cy5) und Ki-67 (FITC) Färbung; Für linienspezifische Replikationsanalyse, Immunfluoreszenzanfärbung für zusätzliche Zellidentität Marker (TRITC Insulin, Glukagon, Vimentin oder Somatostatin) durchführen. Alternative replication Marker, beispielsweise PCNA, können ebenfalls verwendet werden.
  10. Bereiten Sie eine 228-Well-Behandlungsplan mit jedem in vierfacher Ausfertigung durchgeführt Behandlungszustand. Positiv- Fügen (5-Iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 & mgr; M]) und Fahrzeugkontrolle (DMSO 1: 666 Verdünnung) Brunnen.

2. Perfusion des Pancreas

  1. Anästhesieren Ratten durch intraperitoneale Injektion von verdünntem Anästhetikum Cocktail-Lösung (0,30 ml / 100 g Körpergewicht). Sobald die Ratte vollständig betäubten und reagiert nicht mehr auf schädliche Reize, führen Zervikaldislokation.
  2. Legen Sie die eingeschläfert Ratte in Rückenlage (kranial-kaudal-Orientierung) auf einem Stapel von Papiertuch und sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol.
  3. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einem U-Schnitt (Basis am Schambereich) und einfahren Haut in der rostralen Richtung über der Brust in die Bauchhöhle zu belichten.
  4. packen Sie vorsichtig das Duodenum mit zwei Paaren von gebogenen Pinzette, suchen Sie den duodenalen Eintrag der gemeinsamen bile Kanal (Sphinkter Oddi) und der Zwölffingerdarm-Öffnung an der Papille mit einer gekrümmten hemostat festzuklemmen.
  5. Heben Sie den gekrümmten hemostat verwendet, um den gemeinsamen Gallengang Papille zu klemmen und den Gallengang nahe an Leber schnappen Sie sich einen gebogenen Pinzette verwenden. Verwenden Sie stumpfe Präparation mit den gebogenen Pinzette zu isolieren und den Gallengang aus.
  6. Positionieren Sie die Ratte mit dem Kopf proximal und distal die Füße.
  7. Kanülieren den gemeinsamen Gallengang (CBD) an oder gerade distal zu der Verbindung der zystischen und gemeinsame -beladene Lebergänge mit einer pankreatischen Verdauungslösung 10 ml Spritze und 10 langsam ml der pankreatischen Verdauungslösung injizieren. Während die Injektion, die CBD mit einem Skalpell Griff unterstützen. Positionieren Sie die Nadel, wenn der Kanal und der Bauchspeicheldrüse aufzublasen scheitern.
  8. Entfernen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse die gebogenen Pinzette und einer feinen Schere mit ihm zu trennen von dem absteigenden Dickdarm, Darm, Magen und Milz. Legen Sie die aufgeblasenen Bauchspeicheldrüse auf Eis in einem 50-ml-Röhrchen mit 5 ml Pankreas - Verdauungslösung.
    Hinweis: Für eine maximale Inselausbeute, sammeln Sie alle Bauchspeicheldrüsen innerhalb von 30 min und Ort nur 1 oder 2 Bauchspeicheldrüsen in je 50 ml Aufschlußrohr.

3. Die Dissoziation des Pancreas

  1. Sobald alle Bauchspeicheldrüsen gesammelt, legen Sie die Verdauung Rohre in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Vorsichtig schwenken alle 3 Minuten die Röhrchen.
  2. Nach 15 min kräftig schütteln (vertikal) die Rohre 10 - mal und 10 ml kaltem Waschpuffer hinzufügen. Kräftig schütteln die Rohre zusätzlich 5 mal auf Eis stellen.
  3. Füllen Sie die Verdauung Rohre bis 50 ml mit kaltem Waschpuffer und Mischung von Röhren 5 - mal umgekehrt wird .
  4. Zentrifugiere die Röhrchen bei 97 × g bei 4 ° C für 1 min und giesst den Überstand. Achten Sie darauf, nicht die pelle Gewebe zu entfernen.
  5. 25 ml Waschpuffer und erneut zu suspendieren , das Gewebe durch sanftes Vortexen. Wiederholen Sie die Schritte 3.4 und 3.5 noch zweimal.
  6. Legen Sie ein 30 mesh Gewebe Sieb über eine sterile 250-ml-Becher und gießen Sie die Gewebesuspension auf das Sieb. Spülen Sie das Aufschlußrohr mit zusätzlichen 20 ml Waschpuffer und gieße auf das Netz. Die unverdaute Pankreas und Fettgewebe sind bei diesem Schritt entfernt.
  7. Gießen Sie das gefilterte Material in zwei frische 50-ml-Röhrchen und das Gewebepellet durch bei 4 ° C bei 97 × g für 1 min drehen. Decant Überstand und Invert-Röhren überschüssige Puffer zu entleeren.

4. Reinigung von Inselchen

  1. 20 ml kaltem Polysaccharose / Natriumdiatrizoat-Lösung (1,119 g / ml Dichte) an die pelletierten Pankreasgewebe. Homogen erneut zu suspendieren, den Inhalt jedes Röhrchen durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren fünfmal.
  2. Overlay vorsichtig die Polysucrose / Natriumdiatrizoat Lösung mit 10 ml HBSS. Pflegen Sie eine scharfe Flüssigkeit-Grenzfläche durch langsam die HBSS entlang der Rohrwand hinzufügen.
  3. Zentrifugieren der verdauten Bauchspeicheldrüsen bei 560 × g für 15 min (4 ° C) mit langsamer Beschleunigung und ohne Bremse.
  4. Collect die Inselschicht von der Oberfläche einer 10 ml Pipette und Platz Inselchen in frischen 50-ml-Röhrchen mit. Pool nicht Inselchen in diesem Stadium.
  5. Werden 40 ml Waschpuffer in jede 50 - ml - Röhrchen und Schleuder für 1 min bei 140 × g bei 4 ° C.
  6. Gießen Sie den Überstand ab und erneut zu suspendieren gepoolt Inseln in 50 ml Waschpuffer durch die Rohre mehrmals umgekehrt wird . Zentrifugiere die Röhrchen für 1 min bei 97 × g bei 4 ° C Inselchen in einem Pellet zu sammeln.
  7. Gießen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche ab. Bringen Inseln in die Gewebekultur Haube und den Überstand aspirieren.
  8. Re-suspend jedes Rohr von Inseln in 6 ml Insel Medium.
  9. Übertragen Sie die Inseln von je 50 ml Tube in eine Vertiefung Sechs-Well-Gewebekulturschale. Schwenken Sie die 6-well Schale Inseln in der Mitte des Brunnens zu sammeln und Inselchen Qualität und Reinheit unter dem Mikroskop beobachten.
  10. Manuell sammeln Inselchen einer 1 ml Pipette und übertragen die aufgenommenen Inseln in die benachbarte Verwendungenthält, gut 6 ml Insel Medien. Wiederholen Sie Inselchen Verwirbelung und Kommissionierung bis> 90% Reinheit erreicht.
  11. Übertragen Sie die gereinigten Inseln zu einer 10 cm Gewebekulturschale mit 20 ml Insel Medium.
  12. Ort Inselchen in einem Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2) über Nacht (1A).
  13. In Vorbereitung der Inselzellen Plattieren, Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 384 Vertiefungen mit 40 ul 804G konditionierten Medium pro Well. über Nacht in einem Gewebekultur-Inkubator inkubieren.

5. Dispersion und Beschichtung von Inselzellen

  1. Am folgenden Tag, nehmen Sie sanft kleine Inseln aus dem 10-cm-Schale mit einem Zellschaber und übertragen Sie die Inseln in einen 50-ml-Tube.
  2. Pellet die Inseln durch Zentrifugation für 1 min bei 22 · g bei Raumtemperatur. Den Überstand aspirieren.
  3. Waschen Sie die Inselchen mit 20 ml warmem PBS und wie oben dekantiert.
  4. Re-suspend Inseln in 0,25% Trypsin (150 & mgr; l pro Ratte Bauchspeicheldrüse) Und für 10 min bei 37 ° C inkubieren. Pipette Inselchen nach oben und unten 10-mal mit 1 ml Pipette nach 5 und 10 Minuten Inkubation.
  5. Nach 10 min wurde eine 20 ul Probe der trypsiniert Inseln unter dem Mikroskop ausgewertet vollständige Verdauung zu gewährleisten und die Inselzellen mit einem Hämocytometer gezählt. Wenn unverdaute Inseln bleiben, weiterhin Inkubation für eine weitere 3-5 min und Pipette auf und ab 10 weitere Male. Bei Bedarf wiederholen.
    Hinweis: Die typische Ausbeute von ~ 125.000 - 150.000 Insel-Zellen pro Ratte.
  6. Entfernen 804G konditionierten Medien beschichteten 384-Well-Platte aus dem Inkubator und entfernen Medien eine 12-Well-Verteiler Absauger verwenden.
  7. Suspend - Inselzellen in einer Dichte von 45.000 Zellen pro ml in Islet Funktionsmedium und der Platte 70 & mgr; l (3.150 Zellen) pro Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette (1B).
    Hinweis: Da in den äußeren Wells β-Zellen sind in der Regel 4 in Richtung des Umfangs der Platte Verwendung Reihen C bis N und Spalten zu migrierenbis 21 228 Vertiefungen mit den Inselzellen von 6 Ratten isoliert auf den Teller.
  8. Die Platte wird in der Gewebekultur-Inkubator für 48 Stunden Zelladhäsion zu ermöglichen.

6. Islet-Zellkultur-Behandlung, Fixierung und Färbung

  1. Bereiten 200 ul Vehikel und Verbindungen (Behandlungsbedingungen werden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt) bei einer 2x - Konzentration in Islet Funktionsmedium. Anordnen Verbindungen in einer sterilen 96-Well-Platte mit mehreren Vertiefungen Pipettieren zu erleichtern.
  2. Sorgfältig Inselchen Medium mit einer 12-Well-Verteiler Absauger entfernen und mit Inselfunktion Medium (35 & mgr; l / Well) unter Verwendung eines 12-Well-Pipette ersetzen. Entfernen und Ersetzen Medien von einer Zeile zu einer Zeit , Risiko zu begrenzen , Trocknen (1C).
  3. Initiieren Behandlung von 35 ul / Vertiefung der 2x Verbindungslösungen zu übertragen. Rückplatte in den Inkubator für die 48 Stunden Behandlungsdauer.
  4. Nach 48 Stunden der Behandlung, dekantiert die Behandlungsmedien durch Umdrehen der Platte.
  5. Waschen Sie sich leicht die Inselzellen mit 50 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS (1 min). Fügen Sie den PBS einen Mehrkanal-Pipette.
  6. Dekantiert die PBS und die Zellen beheben, indem 50 ul Zugabe pro Vertiefung von kaltem 4% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in 1x PBS. Inkubiere Zellen für 15 min bei 4 ° C.
  7. Waschen Sie die Zellen dreimal (jeweils 5 min) durch die Platte Invertieren des PFA zu entfernen, und die Zugabe vorsichtig 60 ul PBS pro Vertiefung wie oben.
  8. Vorbereitung 15 ml Antigen-Retrieval-Lösung durch Mischen von 14,25 ml Formamid und 0,75 ml 0,15 M Natriumcitrat (pH 6). Sprechen Sie die Antigen-Retrieval-Lösung unmittelbar vor der Verwendung.
  9. Entfernen PBS aus den Vertiefungen durch Umdrehen der Platte und fügen Sie zu jeder Vertiefung 60 ul Antigen-Retrieval-Lösung. Anschließend wird die Platte in 70 ° C warmen Wasserbad für 45 min. Platzieren einem Heizblock auf der Oberseite der Platte während dieser Inkubation Verziehen der Multiwell-Platte zu verhindern.
    Hinweis: Das Wasser sollte bis zur Hälfte der Platte Rock sein; Die Platte sollte nicht in Wasser getaucht werden.
  10. Die Platte aus Wasserbad und lassen Sie es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Stellen Sie sicher, dass die Platte durch visuelle Inspektion nicht verzogen wird.
  11. Waschen Sie die Zellen mit 60 & mgr; l pro Vertiefung 1x PBS dreimal (jeweils 5 min). Hinzufügen PBS mit einer Mehrkanalpipette und dekantieren PBS durch Umdrehen der Platte.
  12. Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 40 ul pro Vertiefung Blockierungspuffer hinzufügen und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie den Blockierungspuffer durch Umdrehen der Platte und dekantiert.
  13. Werden 40 & mgr; l Maus-anti-human Ki-67 (1: 200) und Ziege-anti-human PDX-1 (1: 100) in Blockierungspuffer auch mit jedem verdünnten Antikörper und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
  14. Am nächsten Tag, dekantiert die Antikörperlösung und wasche die Zellen mit 1x PBS dreimal (jeweils 5 min), wie oben beschrieben. Umfüllen PBS.
  15. In 40 ul pro Vertiefung verdünnt (1: 200) biotinyliertes Esel-anti-Maus-IgG und Rhodamin-konjugierten Esel-Anti-Ziegen-IgG in Blocking-Puffer. Inkubieren für 1 Stundebei Raumtemperatur.
  16. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. Werden 40 & mgr; l verdünnt (1: 400 in Blockierungspuffer) fluorescein-konjugiertem Streptavidin zu jeder Mulde. Inkubiere 30 Minuten bei Raumtemperatur.
  17. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS dreimal, jeweils 5 Minuten. In 40 ul pro Vertiefung DAPI (300 nM in Blocking-Puffer) und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
  18. Wash-Zellen mit 1x PBS zweimal und lassen Zellen in 40 ul 1x PBS. Die Platte ist nun bereit, analysiert zu werden.

7. β-Zellreplikation Analyse

Hinweis: Ein Testprotokoll für das High Content Screening-Mikroskop hergestellt werden muss verwendet, um β-Zell-Replikation zu messen. In seiner einfachsten Zusammensetzung Dieses Protokoll ist ein Zwei-Farben - Assay in dem ein Identitätsmarker verwendet wird β-Zellen (PDX-1 + -Zellen) und einen Replikationsmarker (Ki-67) zu definieren Zellteilung Ereignisse zu definieren.

  1. Identifizieren Sie Objekte (β-Zellen), basierend auf dem average Fluoreszenzintensität von PDX-1 - Färbung (549 - nm - Filter) innerhalb eines angenäherten Kreises (Länge: Breite <1,6) innerhalb des erwarteten Pixelbereich einer β-Zellkerns (2A).
  2. Als nächstes etablieren Einstellungen Replikationsereignisse (Ki-67-Positivität) , basierend auf der durchschnittlichen Fluoreszenzintensität (485 nm Filter) innerhalb des PDX-1 + Fläche (2B) zu identifizieren.
    Hinweis: Die Belichtungszeiten muss festgelegt werden, um Pixelintensität Vergleiche zwischen den Bildern ermöglichen. Assay-Protokoll-Parameter werden so eingestellt, dass Anrufe Maschine konstant unspezifische Färbung, Schutt und Zellaggregate auszuschließen, die sich nachteilig auf die Datenqualität beeinträchtigen könnten.
  3. Analysieren Sie ein Minimum von 500 β-Zellen pro Well Genauigkeit und Grenz Variabilität zu maximieren.
    Anmerkung: Die basale β-Zell-Replikation in Kulturen Index rat islet erwartet wird, 0,5 bis - 3%. Typischerweise beträgt 40 Bilder pro Vertiefung mehr als ausreichend 500 β-Zellen zu identifizieren.
  4. Vor der Analyse dergesamte Platte, Analyse ausgewählt Negativ- (DMSO-behandelten) und Positivkontrolle (5-iodotubercidin [1 uM] oder Dipyridamol [15 uM]) -behandelten Vertiefungen die Gültigkeit des Testprotokolls zu bewerten. Wenn der Test richtig hergestellt ist, induzieren positive Kontrollverbindungen mindestens eine zweifache Erhöhung des Prozentsatzes β-Zellen zu replizieren.
  5. Lesen Sie die gesamte Platte, sobald das Testprotokoll bestätigt wird.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zu β-Zelle oder α-Zellreplikation, eine Vierfarben-Assay-Protokoll ist erforderlich, zu beurteilen. Zuerst werden Objekte durch DAPI-Färbung (Kanal 1, 386 nm) identifiziert. Als nächstes gezählt β-Zellen (Ereignis 1): Objekte , die und peri-Kern Insulin (Kanal 3, 549 nm) PDX-1 + (2, 650 nm - Kanal) zusammen auszudrücken. Anschließend replizieren β-Zellen (Ereignis 2) gezählt: ß-Zellen (Ereignis 1) coexprimierender Ki-67 (Kanal 4, 485 nm) (Abbildung 3). Der Pro...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Experimentelle Methoden für die molekularen Mechanismen zu studieren, die β-Zellwachstum und Regeneration zu steuern sind wichtige Werkzeuge für die Diabetes-Forscher. Hierbei wird eine Ratte-Insel-basierte Screening-Plattform für kleine Molekül Stimulatoren der β-Zell-Replikation identifizieren und zu charakterisieren, wird präsentiert.

Während die meisten Aspekte dieses Protokolls leicht von erfahrenen Forschern durchgeführt werden, erfordern ein paar Schritte besondere Technik. Erstens, w...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch NIDDK-Zuschüsse DK098143 und DK101530 des NIH (JPA), des Stanford's Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) und SPARK (UL1 TR001085, JPA) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
250 g männlich männlich Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 cm Zähne Tisuue PinzetteFine Science Tools11021-12
11,5 cm feine SchereFine Science Tools14058-11
14,5 cm chirurgische SchereFine Science Tools14001-14
16 cm gebogene PinzetteFine Science Tools11003-16
12 cm gebogener HepostatFine Science Tools13011-12 12
cm SkalpellstielFine Science Tools10003-12
Gewebesieb-30 MaschenBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375.000 CDA-EinheitenVitaCyte005-1030
Hanks' Balanced Salt Lösung (Ca++ und Mg++)Gibco24020-117
Ketamin HCl (200 mg/20 ml)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10zur Herstellung eines Betäubungscocktails 
Xylazin (5 g/50 ml)LLOYDNADA# 139-236zur Herstellung eines Betäubungscocktails 
Histopaque 1077SigmaH-1077zur Herstellung von Histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119zur Herstellung von Histopaque 1100
Neugeborenen-Kälberserum 500 mlHycloneSH30118.03
Hanks' Balanced Salt LösungHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose HycloneSH30021.01
Lösung für Funktionalität/Lebensfähigkeit Mediatech99-768-CV
RPMI1640 Medien HycloneSH30096.01zur Herstellung von konditioniertem Medium
804G Zelllinie für RattenblasenkarzinomErhältlich auf Anfragezur Herstellung von konditioniertem Medium
Fötales Rinderserum, qualifiziertGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
Penicillin (5.000 I.E./ml/Strptomycin (5 mg/ml) MP Biomedicals1670049
Formamid 500 mlFisher BioReagentsBP227-500
Antigen-Demaskierungslösung 250 ml (pH 6,0)Vector LaboratoriesH-3300zur Herstellung von 0,15 M Natriumsitrat-Lösung
Dextrose, wasserfreiEMD ChemikalienDX0145-1zur Herstellung von 1 M Glukoselösung
Nomal Donkey Serum (Pulver)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
Maus Anti-Mensch Ki67 AntikörperBD Biosciences556003
Ziege Anti-Mensch PDX-1 AntikörperR& D SystemsAF2419
Polyklonaler Meerschweinchen-Anti-Insulin-AntikörperDako2016-08
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Glucagon-AntikörperDako2014-06
Polyklonaler Kaninchen-Anti-Somatostatin-AntikörperDako2011-08
Polyklonaler Hühner-Anti-Vimentin-Antikörperabcamab24525
Biotin-SP-konjugiert, Esel Anti-Maus IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, Alex Mehl 488 konjugiert InvitrogenS32354
Rhodamin-konjugierter Esel Anti-Ziegen-IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
Rhodamin-konjugierter Esel Anti-Meerschweinchen-IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
Rhodamin-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-konjugiertes Esel-Anti-Meerschweinchen-IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-konjugiertes Esel-Anti-Ziegen-IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-konjugiertes Esel-Anti-Kaninchen-IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-konjugiertes Esel-Anti-Hühner-IgGJackson ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
Einweg-Reagenzreservoir 25 mlSorenson BioScience39900
384 Well, schwarz/klar, mit Gewebekulturen behandelte PlatteBD Falcon353962
96 Well, schwarz/klar, mit Gewebekulturen behandelte PlatteCostar3603
MehrkanalpipetteCostar4880
12-Kanal-VakuumsaugerDrummond3-000-096
ZellschaberFalcon353085
Isotemp Wasserbad Modell 2223 Fisher Scientific
High-Content-Screening-Gerät: ArrayScan VTIThermo Scientific

Referenzen

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