Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.

Zusammenfassung

Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ^ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.

Einleitung

Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz ^1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren ³ geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) ⁴ führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur ^5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild ^7,8.

3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo ⁷ zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz ^8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem ^8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent ^7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing - Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen ^8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel ^7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing - Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. ^7.

Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung 'Sca le' (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 - Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone ¹⁴ zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die "CUBIC" ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing - Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung ⁸ hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D - optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ^ERT2 verfolgt ^15, R26R-Confetti ^16, & alpha; MHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, NFATc1-Cre ¹⁹ und Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ Mauslinien. Die Kombination der whole mount - Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D - Volumen Kontext erlaubt zuvor ^21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine ​​während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

1. Lösung Vorbereitungen

HINWEIS: Die Rosa26Cre ^{ERT2 15,} R26R-Confetti ^16, & alpha; MHC-Cre ¹⁷ und Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre ¹⁸ ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war ¹⁹ am Albert Einstein College of Medicine ein Geschenk von Dr. Bin Zhou. Mäuse wurden für mindestens 60 Sekunden durch Kohlendioxidinhalation in einer geschlossenen Kammer euthanasiert gefolgt durch physikalische Mittel Todes Überprüfung durch bilaterale Thorakotomie, Enthauptung oder zervikale Dislokation.

1. Bereiten Sie Tamoxifen. Man löst 10 mg Tamoxifen in 10 ml Sonnenblumenkerne oil. Sobald es vollständig gelöst ist, aliquotieren und bei -20 ° C.
2. Bereiten phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Auflösen Na ₂ HPO ₄ (1,41960 g), KH ₂ PO ₄ (0,24496 g), NaCl (8,0669 g) und KCl (0,20129 g) in 1 l destilliertem Wasser und Einstellen des pH - Werts auf 7,4.
3. Bereiten PBST: 0,1% Tween-20-Lösung in PBS durch Auflösen von 100 & mgr; l Tween-20 in 100 ml PBS.
4. Bereiten Sie Puffer blockiert. Machen 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungslösung durch Lösen von 3 g BSA in 100 ml PBST, enthaltend 0,2% Tween-20.
5. Bereiten Sie CUBIC-1 (Reagenz 1). Mischungs 25 wt% Harnstoff, 25 Gew% N, N, N ', N'-Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin und 15 Gew% Triton X-100 in dH ₂ O.
6. Bereiten Sie CUBIC-2 (Reagenz 2). Mischungs 50 Gew% Saccharose, 25 Gew% Harnstoff, 10 Gew% 2, 2 ', 2' '- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100 in dH ₂ O.
7. Bereiten Sca le A2: 4 M Harnstoff, 10% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,7.
8. Bereiten Sca le B4: 8 M Harnstoff und 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O. Stellen Sie den pH-Wert auf 8,7.
9. Bereiten Sca le 70: 4 M Harnstoff, 70% w / v Glycerin und 0,1% w / v Triton X-100 in dH ₂ O.

2. Tamoxifen Induktion, Embryo Isolierung und Fixierung

1. Tamoxifen Induktion und Embryo Isolation
   1. Mit Hilfe eines gekrümmten Ernährungsschlauch genehmigten Protokoll (ACUP 13-12007), Schlundsonde die weiblichen R26Cre ^ERT2 Confetti Mäuse (gesteckt von R26Cre ^ERT2 männliche Mäuse) mit 10 ug / g Tamoxifen an embryonalen Entwicklungs Tag E7.75 ^33. Bei embryonalen Tag 9,5 (E9.5) oder E10,5, einschläfern die weibliche Mäuse mit CO ₂ und Genickbruch.
   2. Nach Überprüfung der Maus Tod, öffnen Sie die Maus Bauchhöhle mit einer Schere (Abschnitt 1 Hinweis sehen) und das Uterushorn sezieren aus, die Eileiter Schichten mit Hilfe von Schere und Pinzette entfernen und wiederleasen die Embryonen aus dem Eileiter ^23,24.
      1. Transfer der Embryonen auf eine Petrischale mit PBS (pH 7,4). Unter dem Binokular, entfernen Sie die nicht-embryonale Schichten (Chorion, Dottersack und Amnion) mit Hilfe einer Pinzette entfernen.
   3. Mit einer Pinzette und Schere, sammeln die weibliche Maus und Embryo Schwanz Proben für die Genotypisierung wie zuvor ²² berichtet. Mit Hilfe einer Plastikpipette, übertragen jeden Embryo in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte mit 1 ml 1x PBS.
   4. Unter einem Fluoreszenzmikroskop, identifizieren die GFP / RFP / GFP positive Embryonen über ein inverses Mikroskop mit einer Kamera. Schälen Sie die Herzbeutel mit einer Pinzette entfernt und drehen Sie das Herz / Embryo mit Hilfe von gebogenen Pinzette, um die Anzahl von fluoreszierenden Klone auf beiden Seiten des Herzens mit den GFP / RFP / CFP Filter zu bestimmen. Keine Schnitte erforderlich sind.
2. GFP / RFP / GFP positive Embryonen Nach der Identifizierung, schnell die Embryonen waschen zweimal (je 2 min) mit 1x PBS in the 48 Well-Platte auf einem Plattenschüttler bei Raumtemperatur (RT). Dies wird überschüssiges Blut zu entfernen.
3. Befestigen Sie den Embryo / embryonale Herz mit 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT. Die Fixierungszeit ist abhängig von der embryonalen Alter und Gewebegröße. Für E9.5 fixieren den Embryo für 2 h bei RT. Die späten embryonalen Stadium Embryonen erfordern längere Fixierungszeit, die sogar bis 24 Stunden für die postnatale Herz verlängert werden kann.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig, sollte der Kontakt mit Haut, Augen und Schleimhäute.
4. Nach der Fixierung, waschen Sie den Embryo / Herz in der 48-Well-Platte zweimal (jeweils 10 Minuten) mit 1x PBS auf einem Plattenschüttler bei RT. Dies entfernt die überschüssige PFA aus dem Embryo / Herz. Die Embryonen werden dann weiter verarbeitet für ganze Berg Färbung und Gewebe Lichtung.

3. Ganze Berge Färbung

HINWEIS: Nach dem PFA Fixierung der Embryo / Herz ganze Berg-Färbung wird wie folgt.

1. Permeabilisierung den Embryo / Herz in einer 48-Well-Platte mit 1 ml von 0,1% PBST für 2 Stunden auf Plattenschüttler bei RT.
2. Nach Permeabilisierung, tauchen Sie den Embryo / Herz in 1 ml Blockierungspuffer, für 2 Stunden oder über Nacht auf einem Plattenschüttler bei 4 ºC.
3. Tauchen Sie den Embryo / Herz in die Endothelzellen-spezifischen Antikörper PECAM (CD31), verdünnt (1: 100) in 0,3 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert.
4. Waschen Sie den Embryo / Herz mit PBST 5-mal, jeweils 30 min bei RT auf einem Plattenschüttler. Dies entfernt den Überschuß unspezifische gebundenen primären Antikörpers aus dem Gewebe.
5. Tauchen Sie den Embryo / Herz in Alexa Fluor 647 Ziege anti-Ratte-Sekundär-Antikörper, verdünnt (1: 1000) in 1 ml Puffer für 48 Stunden auf einem Plattenschüttler bei 4 ° C blockiert.
6. Wiederholen Sie Schritt 3.4 den sekundären Antikörper zu waschen.
7. Post-fix den Embryo / Herz mit 4% PFA für 1 h bei RT auf einem Plattenschüttler und waschen zweimal mit PBS jeweils 5 Minuten.
8. Stain den Embryo / Herz mit der Kernfärbung 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (verdünnt in PBST bei einer concentVerhältnis von 0,01 mg / ml) für 10 min auf Plattenschüttler bei RT. Folgen Sie mit zwei PBS Waschungen von jeweils 5 Minuten.

4. Embryo / Herz Clearing mit Sca l e oder CUBIC - Methode

HINWEIS: Nach der ganze Berg Färbung der Embryo / Herz entweder auf die Sca le oder CUBIC Gewebe Clearing - Verfahren unterzogen wird. Die Wahl des Verfahrens hängt von der Gewebegröße und embryonalen Alter. Für E11,5 oder früheren Alter Embryonen, l e Gewebe Clearing- Verfahren Verwendung Sca, während für ältere Embryonen oder postnatale Herzen der CUBIC Gewebe Clearing- Verfahren wird bevorzugt.

1. Scale-Tissue Clearing-Methode
   1. Inkubieren Sie den Embryo / Herz mit 1 ml Sca l e A2 - Lösung in einem Szintillationsphiole (eingewickelt in Alufolie) mit gelegentlichen sanften (von Hand) für 48 Stunden bei 4 ° C schütteln.
   2. L e A2 Inkubation Nach Sca, Inkubation des Embryos / Herz mit 1 ml Sca l e B4 Lösung bei 4 ° C in der gleichen Fläschchen mit gelegentlichen sanften für anot Schüttelnsie 48 Stunden.
   3. Inkubieren Sie den Embryo / Herz für weitere 48 Stunden mit 1 ml Sca l e 70 bei 4 ° C mit gelegentlichen leichtem Schütteln. Berg Embryo 90% Glycerin (siehe Abschnitt 5.1).
2. CUBIC Tissue Clearing-Methode
   1. Für ganze Embryo / Herz CUBIC Lichtung, tauchen jeden Embryo / Herz in 1 ml CUBIC-1 mit gelegentlichen leichtem Schütteln für 48 Stunden bei 37 ºC ^7. Nach 48 Stunden, um die Lösung mit dem gleichen Volumen an frischem CUBIC Reagenz 1, zu ersetzen und die Probe für weitere 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichem Schütteln mit der Hand inkubiert.
   2. Waschen Sie die CUBIC-1 behandelt Herz / Embryo mit 1x PBS mehrmals bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit der Hand. Dies entfernt die überschüssige CUBIC-1-Lösung.
   3. Nach CUBIC-1 mit PBS ausgewaschen, tauchen die Embryonen / Herzen in CUBIC-2-Lösung (1 g pro Embryo / Herz) für 48 Stunden bei 37 ° C mit gelegentlichen sanft mit der Hand schütteln. Dies folgt Embryo / Herz Montage Glycerin (siehe Abschnitt 50,2).

5. Proben Montage und Imaging

HINWEIS: Die geräumten Embryonen oder Organe in Sca l e 70 oder CUBIC-2 - Lösung kann mit Skala 70 und CUBIC-2 - Lösung als Abbildungsmedium direkt abgebildet werden, beziehungsweise. Betrachtet man jedoch die Anfälligkeit der embryonalen Proben Clearing Reagenzien, wenn die Proben nicht unmittelbar abgebildet werden, sondern langfristige, speichern Sie die Proben in 90% Glycerin nach dem Protokoll unten gespeichert.

1. Direkt die Sca le in 1 ml 90% Glycerin und lagern bei 4 ° C bis zur Bildgebung gelöscht Probe tauchen.
2. Waschen Sie die CUBIC behandelte Probe mit 1x PBS zweimal, jeweils 5 min und Inkubation sequentiell die Probe mit 1 ml 30%, 50%, 70% und 90% Glycerin-Lösung jeweils für 30 min.
3. Zur Bebilderung, Transfer der Probe auf Glasboden Petrischale mit einer minimalen Menge von 90% Glycerin und Bild Klone mit einem konfokalen Mikroskop mit zwei Photonen-Fähigkeiten ausgestattet.
4. Bild das Herz oder Embryo im Glycerin mit einer 10X / 0.3 NA, ein 25X / 0,8 NA Tauch-, oder ein 40X / 1.2 NA Wasser Korrekturobjektivlinse. Bild DAPI unter Verwendung von 2-Photonen-Anregung von einer kohärenten Titan: Saphir-Laser-Chamäleon. Die Wahl des Mikroskops und die Objektivlinse von dem Zweck der Experimente abhängen wird, beispielsweise für Superauflösung, ein Lichtbogen Fluoreszenzmikroskop verwendet werden könnten.

Ergebnisse

Abbilden der gelöscht embryonale Herz

Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen ^1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial zum er...

Diskussion

Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei der Entf...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
2,2&Primzahl;,2&Primzahl; '-Nitrilotriethanol	Sigma Aldrich	90279
4% Paraformaldehyd in PBS	Affymetrix	19943
BSA	Fischer Scientific
N,N,N',N'-Terkis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin	Sigma Aldrich	122262
Phosphatpuffer Kochsalzlösung	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Triton  X-100	Sigma Aldrich	T8787
Harnstoff	Sigma Aldrich	U-1250
Saccharose	Sigma Aldrich	84097
Glycerin	Sigma Aldrich	G8773
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648
Sonnenblumenöl	Sigma Aldrich	S5007
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379
PECAM (CD31)	BD Pharmingen
Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21247
DAPI Nuklearfärbung	Sigma Aldrich	D9542
37oC Inkubator	Thermowissenschaftlicher Fischer	Heratherm, kompakte mikrobiologische Inkubatoren
48-Well-Platten	Zellbehandlungs	229148
Analysenwaage	Metler Toledo	PB153-S/FACT
Konfokal Mikroskop	Zeiss	Zeiss 510 Konfokalmikroskop
Präpariermikroskop	Unitron	Z850
Fluoreszenzmikroskop	Zeiss	Observer. Z1
Germinator 500 Glasperlensterilisator	CellPoint Scientific	GER-5287-120V
Lichtquelle		SCHOTT ACE I
Paar	Scheren Fine Science Tools	14084-08
Petrischale 60 mm x15 mm	TPP Techno Plastic Products AG	93060
Wippe II  Plattformwippe	Boekel Scientific	260350
Szintillierende Röhrchen	Fischer Scientific	03-337-26
Transferpipette	Samco Scientific	202
Pinzette	Fine Science Tools	11251-20