Wir beschreiben ein Protokoll zur volumetrischen Abbildung von fluoreszierenden Protein-markierten Zellen tief in intakten embryonalen und postnatalen Herzen. Durch die Verwendung von Gewebereinigungsmethoden in Kombination mit der Whole-Mount-Färbung können einzelne fluoreszierende Protein-markierte Zellen in einem embryonalen oder postnatalen Herzen klar und genau abgebildet werden.
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Methodenartikel
Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Einzel klonalen Verfolgung und Analyse auf Vollherzhöhe kann Herzvorläuferzellverhalten und Differenzierung während der Herzentwicklung, bestimmen und für die Untersuchung der zellulären und molekularen Grundlagen von normalen und abnormalen Herzmorphogenese ermöglichen. Neue aufkommende Technologien der retrospektiven Einzel klonalen Analysen machen die Untersuchung von Herz-Morphogenese auf Einzelzellauflösung möglich. Allerdings Gewebe Opazität und Lichtstreuung des Herzens als Abbildungstiefe von ganzem Herzen Bildgebung auf Einzelzellauflösung hinder erhöht. Um diese Hindernisse zu überwinden, eine ganze Embryo Clearing-System, das das Herz hoch transparent für beide Beleuchtung und Detektion machen können, müssen entwickelt werden. Zum Glück, in den letzten Jahren, viele Methoden für die ganze Organismus Clearingsystemen wie CLARITY, Sca le, SeeDB, ClearT, 3DISCO, kubisch, DBE, BABB und PACT berichtet. Dieses Labor ist daran interessiert, die zellulären und molekularen Mechanismen der KarteIAC Morphogenese. Vor kurzem haben wir einzelne Zelllinie über die ERT2 ROSA26-Cre Tracing; ROSA26-Confetti System zu dünn Label - Zellen während der Herzentwicklung. Wir passten mehrere ganze Embryo-Clearing - Methoden einschließlich Sca le und CUBIC (klar, ungehinderte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) mit whole mount Färbung Bild einzelne Klone im Inneren des Herzens , den Embryo in Kombination zu löschen. Das Herz wurde erfolgreich auf Einzelzell Auflösung abgebildet. Wir fanden , dass Sca le die embryonale Herz beseitigen können, aber die postnatale Herz nicht effektiv beseitigen können, während CUBIC die postnatale Herz beseitigen können, sondern schädigt die embryonale Herz durch das Gewebe auflöst. Die hier beschriebenen Methoden wird die Untersuchung der Genfunktion in einem einzigen Klon Auflösung während kardialen Morphogenese ermöglichen, was seinerseits die zellulären und molekularen Basis angeborener Herzfehler aufdecken kann.
Einleitung
Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich - zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz 1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren 3 geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) 4 führen könnte. Die Stud....
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Protokoll
Alle Tierversuche wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) at Albany Medical College und ausgeführt zugelassen nach dem NIH Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren.
1. Lösung Vorbereitungen
HINWEIS: Die Rosa26Cre ERT2 15, R26R-Confetti 16, & alpha; MHC-Cre 17 und Rosa26-mTmG (mTmG) 20 Mauslinien wurden im Handel erworben cTnT-Cre 18 ein Geschenk von Dr. Jiao an der Universität von Alabama war NFATc1-Cre.. war 19 am Albert Einstein College of Medicine ....
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Ergebnisse
Abbilden der gelöscht embryonale Herz
Wirbelherzbildung ist ein räumlich - zeitlich geregelt morphogenic Prozess und hängt von der Organisation und Differenzierung von Vorläuferzellen aus vier verschiedenen Quellen 1. Zellen aus dem ersten Herzfeld des Herz Mondsichel wird in Richtung der ventralen Mittellinie falten, um eine lineare Herzrohr zu bilden. Die Zellen aus dem zweiten Herzfeld zunächst dorsomedial zum er.......
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Diskussion
Der Embryo Isolation ist ein sehr wichtiger Schritt. E9.5 Embryonen sind sehr zerbrechlich und klein, so besonders darauf geachtet werden, sollten nicht die Embryo / Herzstrukturen während der Isolierung nicht zu beschädigen. Die nicht-embryonale zusätzliche Schichten des Embryos / Herz umhüllt sollte sorgfältig besonders entfernt werden, wenn die gesamte Embryo-Bildgebung. Auf diese Weise können Antikörper und Clearing-Mischung Eindringen tief in den embryonalen Geweben und hilft auch das Hintergrundsignal bei der Entf.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.
Danksagungen
Wir danken den Mitgliedern des MW-Labors für die wissenschaftliche Diskussion. Diese Arbeit wird unterstützt durch AHA [13SDG16920099] für M.W. und durch Zuschüsse des National Heart, Lung, and Blood Institute [R01HL121700] für M.W. Die Bilder wurden in der Imaging Core Facility am Albany Medical College aufgenommen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 2,2&Primzahl;,2&Primzahl; '-Nitrilotriethanol | Sigma Aldrich | 90279 | |
| 4% Paraformaldehyd in PBS | Affymetrix | 19943 | |
| BSA | Fischer Scientific | ||
| N,N,N',N'-Terkis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Phosphatpuffer Kochsalzlösung | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Harnstoff | Sigma Aldrich | U-1250 | |
| Saccharose | Sigma Aldrich | 84097 | |
| Glycerin | Sigma Aldrich | G8773 | |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | |
| Sonnenblumenöl | Sigma Aldrich | S5007 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| PECAM (CD31) | BD Pharmingen | ||
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-21247 | |
| DAPI Nuklearfärbung | Sigma Aldrich | D9542 | |
| 37oC Inkubator | Thermowissenschaftlicher Fischer | Heratherm, kompakte mikrobiologische Inkubatoren | |
| 48-Well-Platten | Zellbehandlungs | 229148 | |
| Analysenwaage | Metler Toledo | PB153-S/FACT | |
| Konfokal Mikroskop | Zeiss | Zeiss 510 Konfokalmikroskop | |
| Präpariermikroskop | Unitron | Z850 | |
| Fluoreszenzmikroskop | Zeiss | Observer. Z1 | |
| Germinator 500 Glasperlensterilisator | CellPoint Scientific | GER-5287-120V | |
| Lichtquelle | SCHOTT ACE I | ||
| Paar | Scheren Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Petrischale 60 mm x15 mm | TPP Techno Plastic Products AG | 93060 | |
| Wippe II Plattformwippe | Boekel Scientific | 260350 | |
| Szintillierende Röhrchen | Fischer Scientific | 03-337-26 | |
| Transferpipette | Samco Scientific | 202 | |
| Pinzette | Fine Science Tools | 11251-20 |
Referenzen
- Vincent, S. D., Buckingham, M. E. How to make a heart: the origin and regulation of cardiac progenitor cells. Curr Top Dev Biol. 90, 1-41 (2010).
- Olson, E. N. A decade of discoveries in cardiac biology. Nat Med. 10, 467-474 (2004).
- Olson, E. N.
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Nachdrucke und Genehmigungen
