Methodenartikel

Messung In Vitro ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

DOI:

10.3791/54305

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23. August 2016

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Michigan

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

Zusammenfassung

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Adenosintriphosphat-hydrolysierende Enzyme oder ATPase, eine entscheidende Rolle in einer Vielfalt von Zellfunktionen spielen. Diese dynamischen Proteine ​​können Energie für die mechanische Arbeit, wie zum Beispiel Proteintransport und Abbau, Transport gelöster Stoffe und zelluläre Bewegungen erzeugen. Das hier beschriebene Protokoll ist ein einfaches Assay zur Messung der in vitro - Aktivität von gereinigtem ATPasen für die funktionelle Charakterisierung. Proteine ​​hydrolysieren ATP in einer Reaktion, die in anorganischen Phosphatfreisetzung resultiert, und die Menge an Phosphat freigesetzt wird dann quantifiziert eines kolorimetrischen Assay. Das hochflexible Protokoll kann eingestellt werden ATPase-Aktivität in kinetische oder Endpunkt-Assays zu messen. Ein repräsentatives Protokoll ist vorgesehen , bezogen auf die Aktivität und Anforderungen EPSE umfasste die AAA + ATPase in Type II Secretion in dem Bakterium Vibrio cholerae. Die Menge an gereinigtem Protein benötigt Aktivität zu messen, die Länge des Tests und der Zeitpunkt und die Anzahl der sampling Intervallen, Puffer und Salzzusammensetzung, der Temperatur, Co-Faktoren, Stimulantien (falls vorhanden), usw. können hier von den beschriebenen abweichen, und somit kann eine gewisse Optimierung erforderlich sein. Dieses Protokoll stellt ein Grundgerüst für die Charakterisierung ATPasen und kann schnell und einfach eingestellt wie erforderlich durchgeführt werden.

Einleitung

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ATPasen sind integrale Enzyme in vielen Prozessen in allen Lebensbereichen. ATPasen fungieren als molekulare Motoren, die die Energie der ATP-Hydrolyse nutzen, um so unterschiedliche Reaktionen wie Proteintransport, -entfaltung und -assemblierung anzutreiben. Replikation und Transkription; Zellstoffwechsel; Muskelbewegung; Zellmotilität; und Ionenpumpen1-3. Einige ATPasen sind Transmembranproteine, die am Transport gelöster Stoffe durch Membranen beteiligt sind, andere sind zytoplasmatisch und können mit einer biologischen Membran wie der Plasmamembran oder denen von Organellen assoziiert sein.

AAA+ ATPasen (ATPasen, die mit verschiedenen zellulären Aktivitäten assoziiert sind) bilden eine große Gruppe von ATPasen, die eine gewisse Sequenz- und Strukturkonservierung teilen. Diese Proteine enthalten konservierte Nukleotidbindungsmotive wie Walker-A- und -B-Boxen und bilden in ihrem aktiven ZustandOligomere (im Allgemeinen Hexamere) 1. Große Konformationsänderungen dieser Proteine bei der Nukleotidbindung wurden bei verschiedenen Mitgliedern der AAA+-Familie charakterisiert. EpsE ist eine AAA+ ATPase und Mitglied der bakteriellen Typ II/IV Sekretionsunterfamilie der NTPasen4-6. EpsE treibt die Typ-II-Sekretion (T2S) bei Vibrio cholerae, dem Erreger der Cholera, an. Das T2S-System ist für die Sekretion einer Vielzahl von Proteinen verantwortlich, wie z. B. des Virulenzfaktors Choleratoxin, das bei der Besiedlung des menschlichen Dünndarms durch V. cholerae starken wässrigen Durchfall verursacht7.

Techniken zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität sind vielfältig, messen aber üblicherweise die Phosphatfreisetzung mit kolorimetrischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Substraten8-11. Wir beschreiben eine grundlegende Methode zur Bestimmung der in vitro ATPase-Aktivität von gereinigten Proteinen mit Hilfe eines kolorimetrischen Assays, der auf einem kommerziell erhältlichen Malachitgrün-haltigen Substrat basiert und freigesetztes anorganisches Phosphat (Pi) misst. Bei niedrigem pH-Wert bildet Malachitgrünmolybdat einen Komplex mit Pi und der Grad der Komplexbildung kann bei 650 nm gemessen werden. Dieser einfache und empfindliche Assay kann verwendet werden, um neue ATPasen funktionell zu charakterisieren und die Rolle potenzieller Aktivatoren oder Inhibitoren zu bewerten, um die Bedeutung von Domänen und/oder spezifischen Resten zu bestimmen oder um die Wirkung bestimmter Behandlungen auf die enzymatische Aktivität zu bewerten.

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Protokoll

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1. Führen Sie die ATP-Hydrolyse-Reaktion mit gereinigtem Protein

  1. Bereiten Sie Bestände an alle notwendigen Reagenzien für die Inkubation mit gereinigten Protein.
    1. Bereiten 5x HEPES / NaCl / Glycerin (HNG) -Puffer, enthaltend 100 mM HEPES pH 8,5, 65 mM NaCl und 5% Glycerin (oder anderen Assaypuffer wie geeignet).
    2. Bereiten 100 mM MgCl 2 (oder einem anderen Metall, wenn ATPase Metall abhängig ist) in Wasser.
    3. Bereiten Sie frische 100 mM ATP in 200 mM Tris Base (nicht einstellen pH-Wert weiter) hoher Reinheit ATP verwendet wird. Aliquotieren und lagern Sie das ATP-Lager bei -20 ° C nicht länger als ein paar Wochen, als ATP im Laufe der Zeit zusammenbrechen wird, und unterlassen das Einfrieren und die ATP-Lager Auftauen.
    4. Premix MgCl 2 und ATP in einem Verhältnis 1: 1 kurz vor der ATP - Hydrolyse - Reaktion einrichten.
  2. Bereiten Sie und beschriften 1,5-ml-Röhrchen für das Sammeln von Proben in regelmäßigen Abständen während der Reaktion. Bereiten Röhrchen zu sammeln Proben zum Zeitpunkt 0 und zum Zeitpunkt 15, 30,45 und 60 min.
    HINWEIS: Als Alternative zu sammeln Proben nur zum Zeitpunkt 0 und dem Endpunkt.
    1. In 245 ul 1x HNG Puffer in jedes Röhrchen, um Proben von den ATP-Hydrolysereaktionen 01.50 gesammelt zu verdünnen.
  3. Bereiten Sie ein Bad aus Trockeneis und Ethanol schnell Proben Einfrieren der Reaktion zu stoppen. In einem Gummi Eiskübel oder anderen sicheren (nicht Kunststoff) Behälter, fügen Sie mehrere Stücke von Trockeneis und sorgfältig genug 70-100% Ethanol gießen Sie das Trockeneis zu decken.
  4. Verdünnen gereinigtes Protein in 1x HNG-Puffer, gegebenenfalls (in der Regel 5 bis 10 & mgr; M), und halten Sie auf dem Eis.
  5. Stellen Sie die ATP-Hydrolyse-Reaktionen auf.
    1. In separaten 0,5 - ml - Röhrchen für jede Probe, die folgenden Reagenzien (in dieser Reihenfolge): H 2 O (bis zu einem Gesamtvolumen von 30 & mgr; l), 6 ul 5x HNG oder andere Puffer, 3 ul 100 mM MgCl 2 -ATP Mischung, und 0,25-5 uM Protein.
    2. Fügen Sie einen Puffer-nur negative Kontrolle Zustand, in dem kein Protein zugesetzt wird.
  6. Entfernen Sie 5 ul aus der Reaktion zum Zeitpunkt 0, verdünnte 01.50 in den vorbereiteten 1,5 ml Röhrchen mit 245 ul HNG-Puffer, und sofort gefrieren die Probe in der Trockeneis / Ethanol-Bad.
  7. Inkubieren Reaktionen bei 37 ° C ATP Hydrolyse zu ermöglichen, für 1 h auftritt. In jedem Intervall (15, 30, 45 und 60 min), Entfernen 5 ul Aliquots aus dem Reaktions und fügen Röhren markierte Probe enthält HNG-Puffer, wie in Schritt 1.6.
  8. Am Ende der ATP Hydrolysereaktion bewegen verdünnten Proben auf einen -80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung. Um sicherzustellen, dass alle Proben vollständig gefroren sind, warten Sie mindestens 10 Minuten, bevor Sie fortfahren.

2. Inkubieren Proben mit freien Pi mit Nachweisreagenz

  1. Auftau verdünnten Proben Aliquots ATP Hydrolysereaktion zu jedem Zeitpunkt enthält, (erhalten aus den Schritten 1.6 und 1.7) bei Raumtemperatur.
  2. Richten Sie eine 96-Well-Platte mit Proben und Phosphat-Standards.
    1. In einer 0,5 ml tusein, verdünnen das Phosphat-Standard (mit Pi Nachweisreagenz versehen) von 800 um bis 40 um 5,5 ul der 800 um Standard zu 104,5 ul HNG Puffer hinzuzufügen. Gut mischen, und fügen Sie 100 ul dieser 40 uM Pi-Standard gut A1 einer 96-Well-Platte.
    2. In 50 ul HNG-Puffer in Vertiefungen B1-H1 für 1: 1 serielle Verdünnungen des Pi-Standard.
    3. Entfernen Sie 50 ul 40 uM Pi aus gut A1 und in den 50 & mgr; l Testpuffer in gut B1, mischen, und entfernen Sie 50 ul von gut B1 und in den gut C1, weiterhin Verdünnungen durch gut G1. Entsorgen 50 ul von gut G1 nach dem Mischen jeder Vertiefung, um sicherzustellen, das gleiche Volumen hat. Nun H1 sollte nur Puffer enthalten, um einen Pi-Standard 40-0 uM erstellen.
      HINWEIS: Wenn ein zusätzlicher Faktor (wie ein Inhibitor) wurde zu den Proben hinzugefügt wurde, erstellen Sie eine Standardkurve, diesen Faktor für Veränderungen in der Phosphatfreisetzung oder Absorption unter diesen Bedingungen zu steuern, enthält.
    4. In 50 ul jeder sample in zweifacher Ausfertigung an die Platte. In Proben aus dem gleichen Zeitpunkt in Spalten vertikal (Probe 1 Zeit 0 = A2, A3; Probe 2 Mal 0 = B2, B3) und verschiedenen Zeitpunkten in horizontaler Richtung. Auf diese Weise können bis zu 8 Proben und 5 Zeitpunkten pro Platte.
  3. Eine sterile Pipette genug Malachitgrün / Molybdat Pi Nachweisreagenz zu entfernen, um eine Schale zum einfachen Pipettieren mit 100 & mgr; l zu jeder der Vertiefungen, die Proben und Standards (Reagenz benötigt (ml) = 0,1 x Anzahl der Proben und Standards) und fügen mit einer Mehrkanalpipette. gießen Sie das Nachweisreagenz Sie nicht direkt in die Schale, wie Pi Verunreinigung auftreten dürfte.
  4. durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren eine konsistente Anzahl von Zeiten ohne Einführung von Blasen, vorzugsweise in der Reihenfolge von der letzten Zeitpunkten zu den ersten Zeitpunkten mit einer Mehrkanalpipette, 100 & mgr; l des Pi-Nachweisreagens in jede Vertiefung und mischen.
  5. Die Platte für 25 Minuten bei Raumtemperatur oder nach der mahersteller der Richtungen.

3. Quantifizieren Ergebnisse eines Mikroplatten-Reader verwenden

  1. Die Extinktion der Proben bei 650 nm eine Extinktion Mikrotiterplatten-Lesegerät verwendet wird.
  2. Machen Sie einen Pi-Standardkurve. Mit einer Grafiksoftware, Graph, der die Absorptionswerte für die Pi-Standardproben gegen die Konzentration, um eine Gleichung zu finden verwendet, um die Menge an Phosphat, die in jeder Probe zu lösen.
  3. Berechnen Sie die ATPase-Aktivität für jede Probe, indem sie mit dem Phosphat-Standard zu kalibrieren. Phosphat freigesetzt = (OD 650 - Y Intercept) / Steigung.
    1. Der Mittelwert der Gesamt Pi aus Duplikate jeder Probe. Subtrahieren Sie die Puffer nur Absorptionswert der Kontrolle von dieser Nummer. Multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor (50 in unserem Beispiel).
    2. Bestimmen Sie die Pi nmol pro umol Protein freigesetzt. Graphische Darstellung dieser Werte für jeden Zeitpunkt in einem kinetischen Test sollte linear Anfällen von mindestens R = 0,99 (Abbildung 1) ergeben; wenn not, kann der Test mit mehr oder weniger Protein oder eine längere oder kürzere Inkubationszeit eingestellt werden.
  4. Stellen die Ergebnisse als nmol Pi / umol Protein / min (2, 3) oder als nmol Pi / & mgr; g Protein / min , falls gewünscht.

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Ergebnisse

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Die in vitro Aktivität der ATPase T2S EPSE kann durch gemeinsame Reinigung von EPSE mit der zytoplasmatischen Domäne von EPSL (EPSE-cytoEpsL) und Zugabe der sauren Phospholipid Cardiolipin 12 stimuliert werden. Es ist auch möglich, die Rolle bestimmter EPSE Rückstände in ATP-Hydrolyse zu bestimmen, unter Verwendung dieses Assay Aktivität von Wildtyp (WT) zu varianten Formen des Proteins verglichen. Hier wird die Wirkung der Substitution von zwei Lysinreste in der EPSE...

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Diskussion

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Dies ist ein allgemeines Protokoll für die in vitro ATPase Aktivität von gereinigten Proteinen für die biochemische Charakterisierung zu messen. Dieses Verfahren ist leicht optimiert; beispielsweise die Menge an Protein, Puffer und Salzzusammensetzungen Einstellen der Temperatur und der Variation der Testlänge und Intervalle (einschließlich der Gesamtzahl der Intervalle Erhöhung) können Aktivitäts Quantifizierung verbessern. Im Handel erhältliche Malachitgrün-basierenden Reagenzien sind sehr empfindlich und kön...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren möchten sich bei der Finanzierung durch einen Zuschuss der National Institutes of Health RO1AI049294 (an M. S.) bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HEPES-PufferFisherBP310-500
NatriumchloridFisherBP358-212
MagnesiumchloridFisherBP214-500
Adenosintriphosphat (ATP)FisherBP41325
96-Well-Platten (klar, flacher Boden)VWR82050-760
BIOMOL GreenEnzo Life SciencesBML-AK111Reagenz zum Nachweis von bevorzugtem Phosphat. Achtung: reizend.
Mikroplatten-ReaderBioTek Synergy oder vergleichbar
Prism 5GraphPad Software

Referenzen

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In vitro AssayPhosphatnachweisMalachitgr nATP HydrolyseProteinreinigungkinetischer AssayEndpunkt Assaykolorimetrischer AssayAbsorptionsmessung

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