Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel

Summary

Es wird ein Verfahren beschrieben, bei dem Quantenpunkt-Nanopartikel (QD) für korrelative immunzytochemische Studien von in Epoxid eingebettetem menschlichem Pathologiegewebe verwendet werden können. Wir verwenden kommerzielle Antikörperfragment-konjugierte QDs, die durch Weitfeld-Fluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie sichtbar gemacht werden.

Abstract

Es wird ein Verfahren beschrieben, wobei Quantenpunkt (QD) Nanopartikel können für die korrelative immunzytochemische Studien der menschlichen Pathologie Gewebe unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Um zu demonstrieren, das Protokoll haben wir ultradünnem epoxy Abschnitte des menschlichen Somatostatinom Tumor immunmarkierten einen primären Antikörper gegen Somatostatin verwendet, gefolgt von einem biotinylierten sekundären Antikörper und Sichtbarmachung mit Streptavidin konjugiert ist 585 nm Cadmium-Selen (CdSe) Quantenpunkte (QD). Die Abschnitte werden auf einem TEM Objektgitter montiert dann durch Mikroskopie Weitfeld- Fluoreszenzlicht auf einen Glasträger zur Beobachtung angeordnet. Die Lichtmikroskopie zeigt 585 nm QD Kennzeichnung als leuchtend orange Fluoreszenz ein körniges Muster innerhalb der Tumorzelle Zytoplasma bilden. Bei niedrigen bis mittleren Bereich Vergrößerung durch Lichtmikroskopie die Markierungsmuster leicht erkannt werden kann, und die Höhe der nicht-spezifische oder Hintergrundmarkierung bewertet. Dies ist ein kritischerSchritt für die anschließende Interpretation der Immunomarkierung Musters durch TEM und Bewertung des morphologischen Kontext. Der gleiche Abschnitt wird dann trocken getupft und mit TEM betrachtet. QD Sonden gesehen in einzelnen sekretorischen Granula enthalten amorphes Material angebracht werden. Die Bilder werden aus der gleichen Region von Interesse (ROI) gesehen durch Lichtmikroskopie für die korrelative Analyse erworben. können Bilder von jeder Modalität entspricht, dann vermischt werden Fluoreszenzdaten auf TEM Ultrastruktur des entsprechenden Bereichs zu überlagern.

Introduction

Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsfähiges Verfahren für die Analyse von transienten dynamischen Ereignissen ^1, seltene Ereignisse ^{2, 3} und komplexe Systeme ^4. Es gibt viele verschiedene technische Permutationen verfügbar ⁵ je nach Fragestellung jedoch aufgefordert, eine häufige Anforderung ist , dass die gleiche Struktur in einer einzigen Probe ⁶ durch mehrere Mikroskopie Modalitäten abgebildet wird. Unsere besondere Herangehensweise an Clem wurde für das Studium der Archiv menschlichen Pathologie Gewebe und den Fall entwickelt hier verwendet wurde , gut charakterisiert und bish....

Protocol

1. Die Gewebe Dissection und Fixation

1. Tissue Dissection
   1. Präparieren Gewebestücke aus einem chirurgisch reseziert Tumorprobe oder Gewebebiopsie.
      Hinweis: Das Gewebe in dieser Studie verwendet wurde routinemäßig in Formalin fixiert, aber frisches Gewebe ist ebenfalls geeignet. Wir wählten eine Fläche von einem anatomischen Pathologe bestätigt und berichtet Somatostatinom Tumor nach histologischen Routinefärbung und Anti-Somatostatin Immunfärbung (nicht gezeigt) enthalten.
   2. Verwenden Sie Gewebestücke nicht größer als etwa 1,0 mm ^3.
2. Cacodylatpuffer Vorbereitung
   1. V....

Results

Die Somatostatinom Tumorprobe für diese Studie verwendet wurde, umfasste Tumorzellen duktalen Strukturen gemischt mit kollagenen Stoma-Gewebe zu bilden. Durch Fluoreszenzlichtmikroskopie, einzelne Tumorzellen, die reichlich Sekretgranula enthielten, zeigten eine positive Markierung für das Somatostatin-Hormon. Nuclei erschien als dunkle Löcher mit minimalen unspezifische Markierung nachweisbar (Abbildung 1). Bei niedrigen Vergrößerungen variabel intensive körnige Orangen.......

Discussion

Diese Studie hat das Potenzial, Nutzen von QD als universelle Sonden für CLEM Studien nachgewiesen. Die 585 nm QD verwendeten Nanopartikel zeigten helle und stabile Fluoreszenz, wenn sie durch Weitfeld- Lichtmikroskopie betrachtet und wurden durch TEM leicht beobachtet. Eine frühere Studie von einem der Autoren dieses hat auch QD gezeigt für superauflösende Lichtmikroskopie ⁷ geeignet zu sein. Ihre Photo war besonders nützlich für längere Betrachtungszeiten und lange Abbildungs ​​Belichtungen. QD kann auch mi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natriumcacodylat	Proscitech	C0205	Schädliche Chemikalie
Osmiumtetroxid	Proscitech	C010	Nur im Abzug verwenden
Uranylacetat	Univar-Ajax	569	Gefährliche Chemikalie
Ethanol 100%	Fronine	JJ008
Aceton 100%	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
Natriummetaperiodat	Analar BDH	10259
Anti-Somatostatin-Antikörper	Dako	A0566
Antikörper-Verdünnungsmittel	Dako	S3022
Qdot 585 Streptavidin-Konjugat	Invitrogen	Q10113MP
Biotinylierter Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper	Sigma	B7389-1ML
Glutaraldehyd 50%	EMS	16320
Normales Ziegenserum	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid
BSAc (10%)	Aurion	900.022
Parafilm	Pechiney PP	M
pH Indikatorstreifen (pH 2,0 - 9,0)	Merck	1.09584.0001
Mikroformen	Proscitech	RL063
Diamantmesser	Diatome	Ultra 45
Transmissionselektronenmikroskop	FEI	Morgagni 268D
Fluoreszenzlichtmikroskop	Carl Zeiss	Axioskop A1
Gitter 300 Mesh Nickel (dünner Balken)	Agar Scientific	G2740N
Ultramikrotom	RMC	Powertome
TEM Kamerasteuerungssoftware	Soft Imaging System	AnalySIS	Version 3.0
Bildverarbeitungssoftware	Adobe Systems Integriertes	Photoshop CS2