Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor Schlauchseescheide

Zusammenfassung

Wir präsentieren vorübergehende Transgene und Knock-Down in Schlauchseescheide, eine chordate Schwestergruppe der Wirbeltiere, mit Mikroinjektions und Elektroporation Techniken. Solche Methoden erleichtern die funktionelle Genomik in diesem einfachen wirbellos, die rudimentäre Eigenschaften der Wirbeltiere verfügt, einschließlich notochord und Kopf Sinnesepithelien und viele Orthologe der menschlichen Gene Krankheit.

Zusammenfassung

Einfache Modellorganismen sind hilfreich für in vivo Studien von Entwicklungs- und zellulären Differenzierungsprozessen. Derzeit stellen die evolutionäre Distanz konventioneller Wirbellosen-Modellsysteme zum Menschen und die Komplexität der Genome bei Wirbeltieren kritische Herausforderungen für die Modellierung menschlicher Normal- und pathologischer Zustände dar. Das Chordatier Ciona intestinalis ist ein wirbelloses Chordatier, das aus einem gemeinsamen Vorfahren mit den Wirbeltieren hervorgegangen ist und möglicherweise Merkmale an der Schnittstelle zwischen Wirbellosen und Wirbeltieren darstellt. Ein gemeinsamer Körperbauplan mit viel einfacherer zellulärer und genomischer Zusammensetzung sollte die Verknüpfungen des genregulatorischen Netzwerks (GRN) und funktionelle Genomik-Messwerte aufdecken, die Phänomene im Zustand der Wirbeltiere erklären. Das kompakte Genom von Ciona, einer festen embryonalen Linie mit wenigen Teilungen und großen Zellen, kombiniert mit vielseitigen Gemeinschaftswerkzeugen, fördert effiziente funktionelle Genanalysen in diesem Organismus. Im Folgenden stellen wir einige entscheidende Methoden für diesen vielversprechenden Modellorganismus vor, der zur engsten Schwestergruppe der Wirbeltiere gehört. Wir stellen Protokolle für die transiente Transgenese durch Elektroporation vor, zusammen mit Mikroinjektions-vermitteltem Gen-Knockdown, die zusammen die Möglichkeit bieten, die Genfunktion und genomische regulatorische Elemente zu untersuchen. Wir erweitern unsere Protokolle, um Informationen darüber bereitzustellen, wie Community-Datenbanken für das In-silico-Design von genregulatorischen oder genfunktionellen Experimenten genutzt werden. Eine Beispielstudie zeigt, wie neue Informationen über das Zusammenspiel und deren Quantifizierung ausgewählter neuronaler Faktoren gewonnen werden können, die zwischen Ciona und Mensch konserviert sind. Darüber hinaus zeigen wir Beispiele für differentielle subzelluläre Lokalisation in embryonalen Zellen nach DNA-Elektroporation in Ciona-Zygoten. Schließlich diskutieren wir das Potenzial dieser Protokolle, mit neuen Gen-Editing-Methoden für gewebespezifische Geninterferenzen angepasst zu werden. Die in vivo-Ansätze in Ciona überwinden die großen Defizite klassischer Modellorganismen bei der Suche nach konservierten Mechanismen im Chorda-Entwicklungsprogramm, die für die Stammzellforschung, die Wirkstoffforschung und die anschließende klinische Anwendung relevant sind.

Einleitung

Vor kurzem haben sich Genomsequenz und transkribierten Gen-Repertoires zugänglich in einer Reihe von Modellorganismen. Die Bestimmung Gen funktionelle Verbindungen, aber, und wie diese Verbindungen in der DNA fest verdrahtet sind, bleiben die Transkriptionsaktivität im gesamten embryonalen Zeit und Raum auszuführen, eine große Herausforderung, vor allem bei Wirbeltieren. Die Komplexität der regulatorischen Interaktionen und die Komplexität der Genome ^1,2, insbesondere bei Wirbeltieren, verlangsamen effiziente Funktionsanalysen, insbesondere auf der Ebene der DNA in vivo. Tatsächlich ist kein GRN derzeit von der Befruchtung bis zur endgültigen, terminal differenzierten Zustand des sich entwickelnden Organismus analysiert.

Die ascidian C. intestinalis stellt ein Modellorganismus , wo solche vollständige GRN - Analysen möglich. Es verfügt über einen unduplicated Genom typisch für wirbellose Tiere mit wenig Gen Redundanz. Vertebrates im Gegensatz haben zwei Runden Genom Vervielfältigungen unterzogen, die have erzeugt größere Genfamilien und funktionelle Diversifizierung, sondern auch Redundanz zwischen Paralogen. Die kompakten cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen (die Steuereinheiten von KNS) von C. intestinalis und eine unveränderliche embryonale Linie mit wenigen Zellen erinnern an C. elegans. Darüber hinaus seine einzigartige phylogenetische Position als wirbellosen Schwestergruppe Wirbeltiere innerhalb Chordaten ermöglicht Entwicklungs Beobachtung, auf zellulärer Auflösung des chordate Körperplan bildet ^3-6.

Die zentrale Frage, die den zukünftigen Erfolg der funktionellen Genomik in Modellorganismen gewährleistet , ist die Erzeugung einer großen Anzahl von Embryonen für die quantitative in vivo Störungen. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in Ciona Eier ^7, und die Möglichkeit, schnell viele transient transgenen Tieren durch in vivo Elektroporation in Hunderten von Ciona erhalten Zygoten ^8,9 wurde ein Durchbruch in der Ciona funktionelle Genomik. Hier stellen wir zuerst die mühsamer Mikroinjektionstechnik für das Targeting einzelne Gene, die die Methode der Wahl für Morpholino- (MO) -vermittelte Knock-Down, insbesondere maternaler Transkripte bleibt. MO Oligos Ziel typischerweise den Initiator ATG oder die Spleißstellen der RNA und stören Proteintranslation. Wir zeigen dann , wie Elektroporation in befruchtete Eier von Ciona für eine große Anzahl von Embryonen erlaubt in einer quantitativen Art und Weise analysiert werden, so dass Wege der effizienten Analyse von Verstärkern in vivo und von gewebespezifischen Verstärkungs- oder Verlust der Funktion Ansätze zu öffnen, mit der Möglichkeit zur gleichzeitigen Manipulationen und Analysen. Wir zeigen weiterhin , wie Ciona Community - Tools für in Expressionsvektoren in silico Vorhersage von regulatorischen Regionen und effiziente Klonierung der vollständigen offenen Leserahmen (ORFs) genutzt werden. Schließlich zeigen wir, von fluoreszenz subzellulären Lokalisierungen Differential getaggtoder Proteine ​​auf die Überexpression durch Elektroporation markiert.

Protokoll

1. Vorbereitungen für die Mikroinjektion und Elektroporation in Ciona Eier und Zygotes

1. Bereiten Sie 10 L künstlichem Meerwasser mit HEPES (ASWH) zur Züchtung von Embryonen. Man löst 420 mM NaCl, 9 mM KCl, 10 mM CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24,5 mM MgCl ₂ · 6H ₂ O, 25,5 mM MgSO ₄ · 7H ₂ O, und 2,15 mM NaHCO ₃ in doppelt destilliertem Wasser (ddH ₂ O) durch Rühren über Nacht. In 5 mM HEPES pH 8,0 und überprüfen / der pH-Wert auf 8,0. Lagern Sie die ASWH bei 4 ° C. Warm es auf 18 ° C auf und filtriert sie mit Filterpapier vor dem Gebrauch.
2. Bereiten 20x inaktivierten dechorionation Lösung: 20% Natriumthioglycolat, 1% Pronase in ASWH. Speichern von 500 & mgr; l Aliquots bei -20 ° C, und mit Wasser auf ein Endvolumen von 10 ml ASWH vor dem Gebrauch.
3. Bereiten Sie 15 bis 20 Kulturschalen für die Eier / Embryonen. Gießen geschmolzener 1% Agarose in ASWH in 3,5, 5, 9 oder 15 cm-Petrischalen, Beschichtung mit einer 1-2 mm dünne Schicht.Lassen Sie die Agarose erstarren und die Platten mit ASWH decken. Lager sie bei 4 ° C für 1-2 Wochen Maximum. Ersetzen Sie die ASWH vor dem Gebrauch.
4. Bereiten Sie spezielle Injektions Gerichte.
   1. Gießen Sie eine 5-7 mm dicke Schicht aus geschmolzenem 1% Agarose in eine 5 cm Petrischale und legen Sie eine Form auf dem Agarose (wie zum Beispiel ein Zip-Lock-Schließung auf einer Plastikabdeckung Rutsch geklebt) eine Vertiefung bei der Verfestigung der Agarose zu erzeugen das kann die Eier halten. Bereiten Sie 4 bis 5 Injektion Geschirr und Deckel mit ASWH. Lagerung bei 4 ° C und ersetzen mit frischen ASWH vor dem Gebrauch. Verwenden Sie nur frische Platten für die Injektion (maximal einen Tag alt).
5. Bereiten β-Galactosidase (LacZ) Färbepuffer: 1 mM MgCl ₂ · 6H ₂ O, 3 mM K ₄ [Fe (CN) _6] · 3H ₂ O, 3 mM K ₃ [Fe (CN) _6] in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 2 mM KH ₂ PO _4, 0,05% Tween). Shop in Dunkeln bei 4 ° C. Bereiten LacZ Substrat 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranosid (X-gal, 10 U / ml) in Aliquots von 40 mg / ml in Dimethylformamid (DMF) und Speicherbestände bei -20 ° C bis benutzen.
6. Soak Pasteur Pipetten in Leitungswasser über Nacht, um die Embryonen verhindern kleben.
7. Bereiten Sie Injektionsnadeln.
   1. Stellen Sie eine Mikropipette Puller bei Bedingungen bis wie Hitze 425, ziehen 75, Geschwindigkeit 75 und Zeit 200 (von einem Glühfaden Rampentest von 415).
   2. Ziehen Sie 4 bis 5 Faden enthaltenden Glaskapillaren 8 bis 10 normal langen, feinen Nadeln an der Spitze geschlossen zu erzeugen. Lagern Sie die Nadeln in einer staubfreien Nadelfeld angebracht Klebeband auf einem erhöhten Unterstützung zu verdoppeln, zu vermeiden, dass die Spitzen zu brechen und die für Nadel Füllung bequem ist.
      HINWEIS: die erhaltenen Nadeln Testen von ein paar Eier mit grünem Vitalfarbstoff Injektion (wie in Abschnitt 6) und stellen Sie die Nadel Bedingungen ziehen eine Spitzenform zu erhalten, die für die Feinabstimmung und REPETIT erlaubtive Injektion wie in Abschnitt 6.6 beschrieben.
8. Bereiten Sie Injektionslösung. Herstellung von 4 & mgr; l - Injektionslösung, beispielsweise zusammengesetzt aus 1 & mgr; l 2 mM MO, 2 ul 10 ug / ul grün Vitalfarbstoff und 1 & mgr; l ddH ₂ O. Hinzufügen einer Endkonzentration von 0,05-0,5 ug / ul capped mRNA oder 20 ng / & mgr; l der Plasmid-DNA nach der experimentellen Frage. Gut mischen. Halten Sie sich auf Eis, wenn die Lösung mRNA enthält.

2. Sammlung von Gameten

1. Dissect Ciona Erwachsenen in einem 18 ° C abgekühlt embryo Raum. Verwenden Sie eine kleine Schere und starten vom Ende, die die Siphons auf der Seite der Ausatmung entgegensetzt (kürzer) Siphon, unter dem die Eileiter und die Samenleiter laufen.
2. Setzen Sie die Eileiter und machen zart einen Einschnitt in den Eileiter die Spitze der Schere. Drop die ausströmende Eier direkt in einer 6-Well-Platte, die ASWH durch sanft die Eileiter mit den geschlossenen Schere Drücken der zB Abstreifengs. Übertragen Sie die restlichen Eier mit einer Pasteurpipette vorgespült mit ASWH.
3. Kaution, die Eier von verschiedenen Tieren in verschiedenen Vertiefungen. Beachten Sie die Qualität der Eier unter dem Binokular.
   HINWEIS: Gut entwickelt Eier sind rund und rosa bis hellgelb in der Farbe. Sie werden von einem ungeschäumten vitelline Mantel umgeben, der Chorion, die eine gut definierte perivitelline Raum um das Ei bildet. Das Chorion ist mit Testzellen an seiner Innenseite und sternförmigen Follikelzellen an seiner Außenseite verbunden. Eier von geringer Qualität fehlt oft das perivitellinen Raum oder die Follikel-Zellen. Sie scheinen weniger rund, körniger oder in der Farbe unterscheiden. Unreife Oozyten sind kleiner und haben eine silberne weiße Farbe.
4. Schneiden Sie die Samenleiter mit der Schere und sammeln konzentrierte Sperma in ein 1,5-ml-Röhrchen eine separate Pasteurpipette. Pool, um das Sperma von verschiedenen Tieren (mindestens zwei) in das gleiche Rohr. Store Sperma bei 4 ° C für mehrere Tage.

3.Düngung

1. Sammeln Spermien und Eier bei 18 ° C, wie in Schritt 2 beschrieben.
2. Aktivieren Sie die Spermien.
   1. Bereiten Sie 1 ml ASWH in einem 1,5-ml-Röhrchen und mischen sich mit 50 ul 1 M Tris pH 9,5. Dann fügen Sie 20 ul konzentrierter Spermien und sanft durch Umdrehen des Röhrchens mischen.
   2. Überprüfen Sie die Spermien Aktivierung in einem Samentropfen auf einem Deckel eines kleinen Petrischale gelegt oder einem Glasträger und beobachten unter dem Binokular. Die Spermatozoonen sollte wild schwimmen.
3. In 100-200 ul der aktivierten Spermienlösung in jede Vertiefung von Eiern (mit zwischen 100 und 1000 Eier), gut mischen durch Pipettieren auf und ab, so dass die Eier in dem Medium schweben. Warten Sie 10 Minuten, ohne dass die Embryonen zu bewegen.

4. dechorionation von Eiern und Embryonen

1. Verdünnen, um eine 500-ul-Aliquot von 20x dechorionation Lösung auf 10 ml in ASWH. Aktiviere die dechorionation Lösung durch tropfenweise 200 ul 2 hinzugefügt wird.5 M NaOH zu der 10 ml 1x dechorionation Lösung. Eine milchige Niederschlag bilden. Vorsichtig mischen durch den Schlauch zu invertieren.
2. Sammeln Sie die Eier oder Zygoten (nach dem 10 min in Schritt warten 3.3) in Glasröhrchen mit einer Pasteurpipette. Pool, die Eier von 2 auf 3 Tiere in einem Rohr (etwa 1.000-5.000 Eier / Röhrchen). Sediments mit einem Hand Zentrifuge bei hoher Geschwindigkeit (1200 xg) für etwa 20 sec Spinnen eines Embryos Pellet am Boden des Röhrchens zu bilden. Langsam die Zentrifuge stoppen und die ASWH mit einer Pasteur-Pipette entfernen.
3. 4 ml der aktivierten dechorionation Lösung der pelle Eier / Zygoten in jedes Röhrchen. Suspend die Eier / Zygoten durch Pipettieren sie sanft nach oben und unten mit einem Leitungswasser behandelten Pasteur-Pipette mit einem kleinen Gummibirne gekrönt. Die Lösung sollte gelblich drehen nach 1-3 min.
4. Folgen Sie der dechorionation durch eine kleine Teilmenge des dechorionating Ei / Zygote Suspension Entfernen der Pasteurpipette. Kaution einen Tropfen auf einer Folie und beobachten unter dem Sezieren sbewältigen. Halten Sie das Pipettieren Eier / Zygoten auf und ab und prüfen jede 20-30 Sekunden.
   HINWEIS: Erste Follikelzellen lösen, dann das Chorion färbt sich gelb und undurchsichtig, und schließlich löst es aus den Zygoten. Rosa dechorionated Eier / Zygoten auf den Boden des Glasrohrs sinken. Die dechorionation sollte nicht länger als max. 5 Minuten.
5. Füllen Sie das Rohr mit ASWH einmal 50% der Eier / Zygoten dechorionated werden.
   ANMERKUNG: sehr schonend Zentrifuge (8 xg) für etwa 10-15 sec zu einer sehr geringen Geschwindigkeit gerade genug zu sedimentieren die dechorionated Eier / Embryonen entspricht. stoppen langsam die Zentrifuge, um nicht das Pellet von Eiern / Zygoten an der Unterseite des Rohres stören.
6. Entfernen Sie fast die gesamte Flüssigkeit aus dem Glasrohr mit dem schwebenden Material mit unvollständig dechorionated Eier / Zygoten und ersetzen mit ASWH. pipettieren langsam nach oben und unten zu waschen und sanft wieder Zentrifuge wie in Schritt 4.2. Alternativ warten Zygoten durch die Schwerkraft zu beruhigen. Waschen Sie einmal mehr, bis kein Chorion Schutt ist links.
7. Transfer Eier / Zygoten zu frisch Kulturschalen gespült mit einer Pasteurpipette. Halten Sie die Zygoten (keine Eier) mit niedriger Dichte (etwa 200 Embryonen pro 10 cm Schale) ihr Zusammenkleben zu vermeiden. Kultur die Embryonen auf die gewünschte Stufe bei Temperaturen zwischen 13 und 20 ° C. Alternativ Elektroporation die Zygoten (Schritt 5) oder die unbefruchteten Eiern (Schritt 6) injizieren.

5. Die Elektroporation

1. Befruchten die Eier und dechorionate die Zygoten bei 18 ° C, wie in den Abschnitten 3 und 4. Geben Sie zwischen 50 und 400 Eier pro Elektroporation Probe.
2. Vorbereitung 50 & mgr; l Plasmid - DNA in einem 1,5 ml - Röhrchen (max. 100 & mgr; g Plasmid - DNA in 50 & mgr; l ddH ₂ O) und mit 200 ul 0,95 M Mannitol. Gut mischen durch Vortexen.
3. Versand und Schwerkraft sedimentieren die dechorionated Zygoten in silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen. Entfernen Sie die ASWH bis auf die 100 & mgr; l Markierung auf dem Schlauch.
4. Gehen Sie nacheinander für jede Zygote Rohr wie folgt: addDNA / Mannit-Lösung mit einer Pasteurpipette. Vorsichtig mit den Zygoten mischen und sofort die DNA / Mannit / Zygote Suspension und in ein 4 mm Elektroporationsküvette aufnehmen.
5. Setzen Sie die Küvette sofort in die Elektroporation Halter und geben einen einzigen Impuls von 16 ms bei 50 V.
6. Entfernen Sie die Zygoten aus der Küvette die gleiche Pasteurpipette und breitete sie sich auf eine Kulturschale mit frischen und gefiltert ASWH. Pipette, um die Zygote, bevor sie beginnen etwa 1 Stunde nach der Befruchtung (HPF) bei 18 ° C zu spalten.
7. Spülen der Pipette zwischen den Proben in ein Becherglas mit ASWH.
8. Kultur Die Zygoten bei 15-20 ° C bei ausreichend niedrigen Dichte von etwa 200 Embryonen pro 10 cm Schale ihre Zusammenkleben zu vermeiden.

6. Mikroinjektions

1. Bereiten Sie dechorionated Eier für die Injektion.
   1. Dechorionate die separat Eier, 2-4 Tieren, wie 4. Halten Sie die unbefruchteten und dechorionated e in AbschnittGGS in separaten kleinen Agarose-beschichteten Kulturschalen. Waschen Sie die Eier mehrmals in den Gerichten die Trümmer zu entfernen.
   2. Test befruchten kleine Chargen der dechorionated Eier (ca. 50) von jedem einzelnen. Verwenden Sie eine separate 5-cm-Schale für jede Charge und gelten 2 ul aktiviert Spermien (Schritt 3.2). Gut mischen durch die Gerichte wirbeln und sich auszubreiten, die Eier in der Schale durch die Gerichte sich seitwärts bewegt. Halten Sie die Spermien und Eier für etwa 10 min zusammen ohne sich zu bewegen.
   3. Beseitigen Sie maximal Spermien wie folgt: Übertragung der befruchteten Eier in ein frisches Kulturschale oder spülen zweimal mit frischem ASWH. Lassen Sie die Spaltung von Embryonen unbeeindruckt, bis die 32-Zell-Stadium (bei 18 ° C für ca. 3 Stunden nach der Befruchtung). Wählen Sie Eier aus dem besten entwickelnden Charge (beste Prozentsatz der Befruchtung und die meisten regelmäßigen Spaltmuster) für die Mikroinjektion.
2. Stellen Sie die Injektionsnadeln nach oben.
   1. Verfüllen 4 Injektionsnadeln in eine vertikale Position für die Schwerkraft zu ermöglichen, flow entlang des Filaments. Kaution 0,5 ul Injektionslösung (Schritt 1.8) grün Vitalfarbstoff am hinteren Ende der Nadeln enthält, die Nadel nach unten angeordnet sind, kippen. Warten für die Flüssigkeit, die die Nadelspitze am Boden zu füllen.
   2. Positionieren Sie die Nadeln horizontal und verfüllen sie mit Mineralöl mit einem feinen und langen Metall oder Kunststoff Pipettenspitze. Overlay langsam die Injektionslösung mit Mineralöl Austreiben alle Luftblasen, während die Nadel zu füllen.
3. Richten Sie den Mikromanipulator in einem 18 ° C abgekühlt Raum.
   1. Verbinden der Kunststoffschlauch des Nadelhalters in eine 10 ml Glasspritze mit Mineralöl gefüllt. Verfüllen den Schlauch und den Nadelhalter mit Öl und vertreiben alle Luftblasen.
   2. Führen Sie die Nadel in den Nadelhalter und positionieren Sie den Halter auf dem Mikromanipulator.
   3. Stellen Sie die Nadelhalter eine Bewegung entlang einer geraden Linie in einem Winkel von 45 ° relativ zu der Oberfläche.
4. Richten Sie die dechorionated Eier entlang der Agarose Einbuchtung des Injektions dish so dass die Eier nacheinander unter dem Dissektionsmikroskop injiziert werden kann.
5. Brechen Sie die Nadelspitze, wenn nötig, durch die Nadel langsam gegen die Agarose Schieben oder gegen ein Stück Deckglas auf dem Agarose gelegt. Ein wenig Druck, um die Spritze Knopf, um sicherzustellen, dass die Nadelspitze offen ist (grüne Nadel Inhalt wird zu vertreiben).
6. Injizieren Sie die unbefruchteten Eiern eins nach dem anderen, indem man zuerst die Nadel in das Ei Einführung und Absaugen leicht die Eihülle durch Injektion gefolgt zu brechen. Injizieren green Injektionslösung in der Mitte des Eis auf maximal 1/3 des Zelldurchmessers. (Dies entspricht ungefähr 30 pl für ein Ei Durchmesser von 140 & mgr; m).
7. Übertragen Sie die injizierten unbefruchteten Eiern zu einem frischen Kulturschale und brüten sie bei 15-18 ° C bis zur Befruchtung.
8. Düngung die injizierten Eier mit frisch aktiviertem Sperma wie in den Test Befruchtungen (Schritt 6.1.2). eliminatea Maximum der Spermien durch die Zygote zu einem frischen Kulturschale übertragen. Verbreiten Sie die Embryonen und sie stören sie nicht während der Furchungsstadien (bis zur 32-Zell-Stadium).
9. Kultur die Embryonen auf die gewünschte Stufe bei einer Temperatur zwischen 13 und 20 ° C.
10. Sammeln Sie die Embryonen, die durch sie in die Mitte der Platte wirbeln und sie in silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen übertragen. Fix und Fleck, oder montieren (Schritte 7 und 8).
11. Vergleichen Sie die erhaltenen Phänotypen mit den Steuer injizierten Embryonen.
    HINWEIS: Injizieren eines zweiten, nicht überlappenden MO, die die gleiche Transkript zielt identische Phänotypen zu erhalten. Rettet den spezifischen MO-Phänotyp (n) mit einer modifizierten mRNA codiert, Ihr Protein von Interesse, sondern dass durch die MOs nicht erkannt wird. Injizieren eines Steuer MO, die keinen Phänotyp verleiht.

7. LacZ-Färbung

1. Sammeln Sie die Embryonen in einer gewünschten Stufe in silikonisierten 1,5-ml-Röhrchen und fixieren sie in 0,2% Glutaraldehyd in 1 ml ASWH 15bis 30 min max.
2. Wash 2x 10 min mit 1 ml 1x PBT.
3. Spülen einmal in 500 & mgr; l Färbepuffer LacZ. Ersetzen Sie mit X-Gal-Substrat ergänzt 1 ml Färbepuffers (verwenden Sie 10 ul / ml 40 mg / ml X-Gal Lager). Übertragen Sie die Embryonen in einer 12-Well-Platte für eine bessere Beobachtung der Färbung.
4. Inkubieren in der Dunkelheit. Variieren Inkubation von 0,5 h bis über Nacht bei 4 ° C, bei RT oder bei 37 ° C abhängig von der Stärke des Fahrers LacZ exprimierenden.
5. Waschen Sie die Embryonen bis zu 4-mal in 1 ml 1X Färbepuffer PBT zu entfernen.
6. Post-fix für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 2% Paraformaldehyd (PFA) in 1 ml 1x PBT oder 0,2% Glutaraldehyd in 1 ml 1x PBT für Interpretation und Visualisierung der gefärbten Embryonen.

8. Montage von fluoreszenz Labelled Wmbryos

1. Fixieren Sie die Embryonen einer gewünschten Entwicklungsstadium für 20 min in 2% PFA in 1 ml ASWH.
2. Waschen Sie die Embryonen in 1 ml 1x PBT 2x. Vermeiden Sie Licht Exposure durch die Embryonen im Dunkeln zu halten.
3. Übertragen Sie bis zu 50 Embryonen auf eine Folie. Entfernen maximal PBT zuerst mit einer Pipette und sorgfältig mit einem Papiertuch.
4. In 20 bis 25 & mgr; l Eindeckmediums.
5. Fügen Sie ein Deckglas, indem sie in einem Winkel positioniert (von einer Seite zuerst) und langsam absenken mit einem spitzen Gegenstand (Nadel, Zangen, Pipettenspitze) zu vermeiden Blasen bis die Probe bedeckt ist. Befestigen Sie das Deckglas an seinen Rändern Punkte aus einem transparenten Nagellack verwenden.
6. Verschließen Sie die gesamte Deck mit einem Nagellack nach dem Trocknen. Lagerung im Dunkeln bei -20 ° C.

Ergebnisse

Mikroinjektions für regulatorische Gen Studien Netzwerk

Die Embryonen der ascidian sind Schlauchseescheide gut geeignet für die Gen - Funktions-oder Gen - regulatorischen Studien an Zelllinie Ebene und mit zellulärer Auflösung. mRNAs, MOs oder Etiketten können nach der Befruchtung mikroinjiziert in das unbefruchtete Ei oder in einzelne Blastomeren werden. MO vermittelte Gen, das das Mikroinjektionstechnik mit Knockdown in Schritt 6 beschrieben MOs spezifisch die mRNA ausgewählter Gene gezielt und deren Übersetzung in ein Protein verhindern. MO vermittelten loss-of-function (LOF) von Entwicklungsgenen , die Expression von einer breiten Palette von Downstream - Gene verändert, insgesamt einen Einblick in die embryonale GRN ¹⁰ enthüllt. Solche Analysen in Ciona vorgesehen , um den ersten ganzen Embryo Regulierungs Entwurf in einem Metazoen - ^11, Fig . 1 zeigt ein Beispiel, wie microinjection wurde die stromaufwärtige Regulation der Expression des konservierten Ci -Myelin Transcription Factor (Ci -MYT) im Gastrula - Stadium des Embryos Ciona studieren verwendet. Überwacht durch in - situ - Hybridisierung (ISH), endogene Expression (Abbildung 1a, schematisiert in 1a ') in den 6-reihige Neuralplatte Vorläufern beobachtet, der vor allem das Gehirn (Reihen III / IV, in rot) und das Rückenmark ( Reihe I, in grün). Zusätzlich wurde stromaufwärts Ci -MYT Regulation durch MO Injektion analysiert mehrere Faktoren Targeting , die in oder benachbart zu neuronalen Vorläufern vor Ci -MYT Expression Einsetzen (1b-g) ausgedrückt sind. MO Knockdown der frühen embryonalen Faktoren, wie der Forkhead box Aa (Foxá-a) Transkriptionsfaktor und Fibroblasten - Wachstumsfaktor 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (Figur 1b oder 1c, respectively) eliminiert Gesamt Ci -MYT Ausdruck. Andere Transkriptionsfaktorenwirken sich nur teilweise Ci -MYT Expression führt MO-vermittelter Herabregulierung in einer Untergruppe von Gehirn Vorläufern (blau Pfeilspitzen in Figur 1d, f und g). Umgekehrt wird ektop Ci -MYT Ausdruck auf Herabregulation von Nodal (Abbildung 1e, roter Pfeil Köpfe) aktiviert, was darauf hindeutet , dass Nodal normalerweise Ausdruck Ci -MYT in diesen seitlichen Vorläufern Nervenstrang drückt.

Die Elektroporation für eine effiziente Gen funktionell und Enhancer-Studien

Elektroporation von Plasmid - DNA in Ciona Zygoten ist eine effiziente Methode zur transienten Transgenese und anschließende Beobachtung der phänotypischen Veränderungen in vivo. Anders als bei der Mikroinjektion von mRNA ermöglicht Elektroporation für gewebespezifische Überexpression, bei dem Gen-codierenden Regionen (ORFs, offene Leserahmen) unter Kontrolle ausgedrückt werdenvon gewebespezifischen Treiber. Diese normalerweise bilden cis Aufsichtsrechtliche Regionen von bekannten Genen (wie der brachyury Enhancer für die Expression in notochord Vorläufern ^8). Im Gegensatz dazu Elektroporation ist für die effiziente Analyse von neuartigen regulatorischen Regionen instrumental wo Reportergene (LacZ oder grün fluoreszierendes Protein, GFP) ihre Aktivität in vivo zeigen. Der Workflow für die Identifizierung und anschließende Elektroporation vermittelte Analyse eines solchen neuartigen Regulationsregion (für Ci -MYT) ist in Abbildung 2 dargestellt.

Ein umfangreiches Repertoire von Ciona Community - Daten, leicht zugänglich in ascidian spezifische Genom - Browser ^12,13, wie die Ascidian Netzwerk für In - situ - Expression und embryologischen Daten (ANIS) ^23, ist für die in - silico - Identifizierung von regulatorischen Regionen (2A) inspiziert. Anschließender Polymerasekettenreaktion (PCR) basiert Klonierung dieser Regionen in Expressionsvektoren können für die Elektroporation vermittelte Tests in vivo. (2B). Das Genom - Browser - Bildschirm-shot in 2A zeigt den Upstream - Bereich des KH - Transkript Modell für Ci -MYT ( die ersten drei Exons, in Orange und zwei Introns sind sichtbar). Verschiedene Genom - Browser Spuren mit Anmerkungen versehen funktionelle Genomdaten für diese Region vorhergesagt, wie Chromatinimmunpräzipitation (Chip-) Daten ¹⁴ (hier gezeigt für ZicL, Ci -Zink Finger des Kleinhirns L), Sequenzkonservierung zwischen zwei verwandten Ciona Spezies ^15,24 oder Nukleosomen ^16,17 Belegung (von oben nach unten in Abbildung 2A). Im Allgemeinen werden exonische Protein kodierenden Regionen stark konserviert (Ausrichtung Spur in 2A). Weitere hohe Erhaltungsspitzen erscheinen in nicht-kodierenden Regionen stromaufwärts und im ersten Intron. Zwei davon sind vorhergesagt Nukleosomen frei eine zu seinL aut einer Sequenz basierten Algorithmus ^16,17 (roten Rahmen in 2A) darauf hindeutet , Zugänglichkeit zu Transkriptionsfaktoren. Tatsächlich Chip-on-Chip - Signale ¹⁴ für Ci -ZicL Transkriptionsfaktor - Bindung (grüne Balken in 2A) sind in diesen zwei konservierten Regionen angereichert. Des Weiteren eine Schnittstelle ²⁵ , die für potentielle Transkriptionsfaktor - Bindungsstellen sucht unter Verwendung von identifizierten wir Websites ZIC markiert innerhalb der Genomsequenzen lokalisiert durch Ci -ZicL ChIP Cluster (orange Pfeile und Sequenzen mit unterstrichenen ZIC-Kern, 2A). Die Bindung von Ci -ZicL Transkriptionsfaktor in konservierten und vorhersagbar freien regulatorischen Regionen von Ci -MYT Nukleosom ist konsistent mit der Herunterregulation von Ci -MYT Expression beobachtet in MO-Injektions vermittelten Knockdown Experimente Targeting ZicL (Figur 1d).

Nach abzuschreckenKlonierung in LacZ Reporterplasmide ¹⁹ Bergbau Potenzial cis Aufsichtsrechtliche Regionen in silico für Ci -MYT Ausdruck, werden diese PCR aus Ciona genomischer DNA und durch Rekombination eingefügt. Die Konstrukte werden dann in befruchtete Eier Ciona (2B) und analysiert , um ihre Aktivität durch LacZ - Färbung (Abbildung 3) elektroporiert.

3 zeigt , dass durch eine solche in silico - Ansatz war es möglich , zwei getrennte cis Aufsichtsrechtliche Sequenzen zu identifizieren , die Ci -MYT mRNA Expressionsdomänen rekapitulieren (vergleiche Figur 1a). Im Allgemeinen transient transgenen Embryonen mit Plasmid-DNA zeigen Mosaik-Expression in diesen Zellen durch Elektroporation nur, dass die DNA eingebaut haben. Mosaik LacZ - Expression wird daher durch pmyt-R3 angetrieben und kann in allen Vorstufen zu finden , die auch Ci auszudrücken (3a, b, lila und roten Pfeilspitzen, beziehungsweise). Im Gegensatz dazu ist aktiv pmyt-R5 nur im hinteren (Reihe I) Neuralplatte Vorstufen und ab dem späteren Neurulastadium (Abbildung 3c, roter Pfeil Köpfe). Die beiden Bereiche kodieren also zwei getrennte räumliche und zeitliche Aspekte der Ci-myt Genregulation. Interessanterweise auch beide regulatorische Regionen zusätzliche Vorläufer Fleck nicht in der ISH zu sehen, vor allem im vorderen und seitlichen Neuralplatte und im Muskel (Abbildung 3a, b, rosa, weiß, gelb und Pfeilspitzen, beziehungsweise). Solche größeren Ausdruckselemente zu repressiven kann zeigen , die nicht in den isolierten regulatorischen Fragmente enthalten sind , mit Akkumulieren (wie für Nodal die seitlichen neuronalen Schicksal, siehe Abbildung 1e drückt) oder zu niedrige Expressionsniveaus nachgewiesenLacZ enzymatische Signal.

Neben Enhancer Studien, die Elektroporation in Ciona erleichtert auch die funktionellen Analysen von Ciona kodierenden Gene durch ihre Überexpression. Eine große Sammlung von Ciona voller Länge ORFs ist der Community zur Verfügung und wurde außerdem für die menschliche Orthologe kommentierte, einschließlich krankheitsassoziierten Gene ^18. Einzelne Gene oder Gruppen von Genen aus dieser Rekombination-Klonen kompatibel vollständige ORF - cDNA - Bibliothek (2B) sind leicht in Ziel Vektoren , die entsprechenden Treiber übertragen in Embryonen exprimiert werden. Die resultierenden Expressionsklone können weiterhin co-elektroporiert mit cis - Aufsichtsrechtliche Reporterkonstrukte ihre mögliche Rolle in Enhancer Aktivierung zu testen. 2B die Isolierung von vollständigen ORF - Klone für die Transkription zeigt Faktoren Ci -ZicL und Ci- GATAa und ihre recombination in adaptierte Zielvektoren , die translationale Tags ¹⁹ (zB grün fluoreszierende Venus- oder viralen Hämagglutinin (HA) -tag) und einen gewebespezifischen Treiber wie der Freund von Gata regulatorischen Region (pfog Treiber) enthalten für die frühe pan-ektodermalen Ausdruck ¹⁵ in der vorliegenden Studie verwendet. Die Wirkung von Ci -ZicL Überexpression in ektodermalen und neuroektodermalen Geweben wurde durch Co-Elektroporation von pmyt-R3> LacZ und pmyt-R5> LacZ - Reporter (3b ', b' 'und c', c '' bezeichnet) analysiert. Unsere Elektroporation Analysen deuten darauf hin , dass Ci -ZicL kann Ci -MYT Ausdruck durch pmyt-R3 und pmyt-R5 Enhancer - Regionen wie beide Reporterkonstrukte zeigten ektopische Expression von LacZ in ektodermalen Regionen (grüner Pfeil Köpfe in 3b ', b' 'und c & aktivieren# 39;, c '',). Wie in 3D gezeigt, ermöglicht die Elektroporation von Plasmid - DNA in Hunderten von Ciona Eier für statistisch relevante Quantifizierung der Expression Veränderungen dargestellt, für ektopische pmyt-R3> LacZ - Expression auf konzentrationsabhängig, pan-ektodermalen Ci -ZicL Ausdruck.

Elektroporation für in vivo subzelluläre Lokalisation

Abbildung 4 zeigt die subzelluläre Lokalisierung von markierten Transkriptionsfaktoren , wenn sie auf der Elektroporation in ektodermalen Blastomeren mit angepassten Expressionskonstrukte (schematisiert in 2B) ausgedrückt. Durch C-terminal Tagging Transkriptionsfaktoren (wie Ci -GATAa) mit einer Venus - Tag (4b) oder ein HA-Tag (Figur 4c) und überexprimieren sie in ektodermalen Geweben (pfogWir konnten) beobachten , daß in vivo " , Ci -GATAa wird meist auf Kerne lokalisiert, wie es für einen Transkriptionsfaktor zu erwarten, wohingegen Venus Ausdruck allgegenwärtig, einschließlich Zytoplasma. Ähnliche Experimente können die Dynamik der subzellulären Lokalisation im Laufe der Zeit zu studieren, durchgeführt werden, von einzelnen oder Kombinationen von Transkriptionsfaktoren, die möglicherweise ihre Co-Lokalisation mit verschiedenen Tags verraten.

Abb . 1: Die Beurteilung Ci -MYT Regulierung durch Mikroinjektion in Ciona Eier Ci -MYT mRNA - Expression in WT und Morpholin (MO) injizierten Embryonen. (A) WT Expressionsmuster von Ci -MYT in der Neuralplatte. (A ') Schematische Darstellung von gefärbten Vorstufen in der Neuralplatte (NP). Row I / II: posterior neuronalen Schicksal; Reihe III / IV: anterioren neuralen Schicksal; Reihe V / VI: palp Schicksal. ( .. * g> b - g) Ci -MYT Ausdruck auf die Mikroinjektion von verschiedenen Mos angegebenen Gene umzuwerfen , die von Imai et al angepasst in den frühen Ciona GRN (Bilder teilnehmen, 2006) ¹¹ Ci -MYT, Ci -myelin Transkriptionsfaktor; WT Wildtyp; blau Pfeilspitzen: Verlust von Ci -MYT Signal; red Pfeilspitzen: ektopische Ci -MYT Signal. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m auf alle Bilder bezieht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Workflow für in silico Suche von Enhancer - Regionen und Rekombination für transiente Transgenese durch Elektroporation in Ciona Embryonen klonen (A) Eine Momentaufnahme aus dem ANISSAMEN ²³ Asci.Dian Genom - Browser identifiziert stromaufwärts regulatorischen Sequenzen von Ci - myt. Rote Rahmen markieren zwei potentielle cis Aufsichtsrechtliche Regionen, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) und pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) , die für die Analyse durch Elektroporation ausgewählt wurden. Die Namen der Tracks: ZicL Sonden: Chip-on-Chip - Daten ^14; KH2012 Transcripts: Schlauchseescheide Transkript Modelle; Alignment Score Cs / Ci LastZ: Sequenzkonservierung zwischen Ciona savignyi (Cs) / Schlauchseescheide (Ci) ^15,24; . Segal 2006 vorhergesagt Nukleosomen Belegung Version 1: Küken ausgebildete Rechenalgorithmus von Segal et al, 2006 , ¹⁶ angewendet Ci wie in Khoueiry et al, 2010 ¹⁷ Grüne Balken:.. Ci -ZicL ChIP Spitzen ^14; Orange Pfeile: vorhergesagt ZIC Websites; GCTG: Kern ZIC-Bindungsstelle. (B) Schema für die Überexpression Konstrukte aus einem Cion Erzeugenein in voller Länge ORF - cDNA - Bibliothek, rekombiniert in Zielvektoren gewebespezifische Treiber (pfog) und Protein - Tags anschließend Co-elektroporiert mit Reporterkonstrukte (wie pmyt-R3> LacZ oder pmyt-R5> LacZ) für In - vivo - Auslese Ci enthält. - MYT, Ci -myelin Transkriptionsfaktor; Ci -ZicL, Ci -Zink Finger des L - Transkriptionsfaktor Cerebellum;. pfog, regulatorischen Region Ci -Friend von GATA Bitte klicken Sie hier um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: elektroporiertem Ciona Embryonen Ci -ZicL induzierbaren räumlich-zeitliche cis -Regelung von Ci -MYT LacZ gefärbt Embryonen in der Mitte des gastrul zeigt.a (mg) / late-Gastrula (LG) oder frühen neurula (DE) Bühne gezeigt , die entweder mit pmyt-R3> LacZ oder pmyt-R5> LacZ und ein Kontrollkonstrukt (pfog> mCherry) oder pfog Co-elektroporiert wurden> ZicL. Der pfog Treiber ¹⁹ vermittelt ektopische (pan-Tier) ZicL Ausdruck in Ektoderm und Neuroektoderms und bewirkt , dass ektopische LacZ - Färbung in diesen Zellen. (A) pmyt-R3 LacZ Aktivität in mg / lG Stadium Embryonen (kleine Pfeilspitzen, linke Tafel) oder in entsprechend farbigen schematischen Gebieten (blaue Kreise, rechts); pflanzlich Ansicht (vg). Row I / II: posterior neuronalen Schicksal; Reihe III / IV: anterioren neuralen Schicksal; Reihe V / VI: palp Schicksal. (B) pmyt-R3 - Aktivität bei eN Stadien in Geweben wie in a. (B ') Ectopic pmyt-R3 Aktivität bei Ci -ZicL Co-Elektroporation wird durch grüne Pfeile angezeigt. (B '') Gleiche Embryonen wie in b ', orientierte Tier Pol nach oben (an). ( pmyt-R5 LacZ Aktivität bei eN Stufen (c ') Ectopic pmyt-R5 Aktivität bei Ci -ZicL Co-Elektroporation wird durch grüne Pfeile angezeigt. (C '') Same Embryonen wie in c 'aber orientierte Tier Pol nach oben (an). (D) Die Quantifizierung der repräsentativen Experimente für Ci -ZicL pmyt-R3 bei niedrigen Konzentrationen über aktivierende. Eine biologische Wiederholung dargestellt Ci -MYT, Ci -myelin Transkriptionsfaktor;. Ci -ZicL, Ci -Zink Finger des Kleinhirns L Transkriptionsfaktor; Ci -Fog, Ci -Friend von GATA; WT Wildtyp; mG, mid-Gastrula; Lg, spät Gastrula; eN, früh neurula; ein, Tier Ansicht; vg, pflanzliche Ansicht; nls LacZ, Kernlokalisationssignal für LacZ. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4:. Differenz subzelluläre Lokalisation von Proteinen auf Elektroporation Lokalisierung von Venus-Tags oder Hemagglutinin- (HA) -markierte überexprimiert Proteine in ektodermalen Zellen unter Verwendung des pfog Treiber ^19. (A - c) DIC Bilder. (A ', b') entsprechende Fluoreszenzbilder. (C ') entsprechende Fluoreszenzbild auf Immun histologischen Markierung mit TRITC. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m bezieht sich auf alle Bilder. DIC, Interferenzkontrast Differential. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Es gibt zwei Haupttechniken transgenes Ciona Embryonen zu erzeugen: Mikroinjektion von RNA oder DNA und Elektroporation von DNA. Diese Techniken für die Gen - Störung in Ciona Embryonen wurden zum ersten Mal in den 1990er Jahren ^7,8 und von da an sukzessive verbessert und jetzt verwendet in Ciona (und andere ascidian Gattungen) ²⁰ weltweit im Einsatz.

Kritische Schritte in dem Protokoll

Erfolgreiche Transgenese in Ciona Gameten , die leicht von erwachsenen Tieren gesammelt werden , hängt von einer Anzahl von kritischen Faktoren. Die Qualität der Gameten, hängt von der Laichzeit (in der Regel von Mai bis Dezember im Nordatlantik, mit Wassertemperatur und Sauerstoffversorgung zu ändern), auf dem Meer Wasserqualität in den Aquarien (bei korrekter Salinität, Erwachsene für 2-4 Wochen gesund zu bleiben) und schließlich auf korrekte Handhabung von Gameten bei der Extraktion von den Erwachsenen, wie weiter unten für die verschiedenen Schritte in der detailliertenProtokoll.

Während Vorbereitungsschritte, Pasteur Inkubation Pipetten mit Leitungswasser wird verhindert, dass Embryonen kleben und Meerwasser Präinkubation von Agarose-beschichteten Petrischalen werden giftige Substanzen aus der Agarose freigesetzt entfernen. Bakterienwachstum zu verhindern und gespült vor Gebrauch frisch Allgemeinen Geschirr kann bis zu 2 Wochen vor der Verwendung bei 4 ° C hergestellt werden. Eines Tages alt, scheinen kleine Gerichte am besten für Injektionszwecke.

Effizienz und Länge von dechorionation ist ein entscheidender Schritt im Protokoll als eine längere Behandlung von Eiern / Embryonen Entwicklung schaden. Eine sorgfältige Vorbereitung (kein Wackeln) und korrekte Lagerung (bei 4 ° C für bis zu einer Woche), um die Qualität der dechorionation Lösung zu erhalten. Proteasen in der Lösung Effizienz verlieren, wenn entweder zu heftig bei der Vorbereitung oder im Laufe der Zeit gemischt, vor allem, wenn für längere Stunden / Tage bei Raumtemperatur gehalten. Wir haben diesen kritischen Schritt optimiert durch die Verwendung frischer dechorionation Lösung bequemhergestellt aus gefrorenen Aliquots von 20x Stammlösung.

Der richtige Umgang mit fragilen dechorionated Eier / Embryonen ist wesentlich und Scher oder stechend von Embryonen beim Pipettieren schädlich sein wird. Beim Pipettieren, Embryonen werden so viel wie möglich in Suspension (durch sanftes "bläst" flüssige sie durch glatte, aber schnelle Pipettieren gefolgt aufzuwirbeln) gehalten, während die Glaspipette in vertikalen Halte statt horizontaler Position. Solche Versorgung gilt Eier / Embryonen in die und aus der Röhrchen, Küvetten oder Platten vor und nach der Fixierung an alle Pipettierschritte zum Waschen, Resuspendieren und zu übertragen. Nach Fixierung sollte besondere Sorgfalt auch auf separaten Pipettiervorichtungen genommen werden live im Vergleich zu festen Embryonen jede Toxizität von Überresten von Fixierungen zu vermeiden.

Mikroinjektions ist recht schwierig , in Ciona Eier / Embryonen aufgrund ihrer geringen Größe und der Elastizität der Vitellinmembran und kritisch , hängt von einer optimierten Spitze Größedie Injektionsnadel, eine perfekte Winkel der Injektion (Nadelbewegung in einer Linie, entlang dem Ei Radius) und eine fein abgestimmte, manuelle Brechen der Vitellinmembran (durch Absaugen vor dem Streben nach der Injektion). Letzteres ist nur möglich, wenn Luftblasen vollständig aus dem Injektionsschlauch eliminiert werden, die zur Glättung der Saug- / Spritzdruck Mineralöl enthält. Darüber hinaus wird verstopfen die kleinsten Stücke von Staub oder Ei Trümmer der Nadel und durch saubere Arbeitsbedingungen und Spülschritte für Eier vor der Übertragung auf der Injektion Gericht leicht zu vermeiden. Nacheinspritzung, die Übertragung von Eiern auf frische Gerichte werden toxische Wirkungen von toten Embryonen verhindern nicht das Injektionsverfahren überlebt haben.

Fehlerbehebung

Potenzielle Probleme in dem Verfahren können durch die folgenden Lösungen behandelt werden. Niedrige Befruchtungsraten von unzureichender Spermien Aktivierung, niedrige Ei Sauberkeit oder große Mengen Befruchtung entstehen können. Verwenden Sie freshly vereinigt und weniger verdünnten Spermien. Überprüfen Sie die Spermienbewegung bei Aktivierung. Waschen Sie die Eier mit ASWH vor der Befruchtung, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Reduzieren Sie die Wassermenge und reduzieren die Menge der Eier pro Befruchtung Gericht / gut. Der Verlust Embryonen während der Herstellungsschritte kann durch Zugabe eines Tropfen dechorionation Lösung effizienter Zentrifuge nach unten die undechorionated Eier / Embryonen vermieden werden. Dechorionation Zeit sollte als teilweise dechorionated Eier optimiert werden nicht sedimentieren und verlängert dechorionation ist giftig, so dass die Embryonen zu explodieren.

Asynchrone Entwicklung kann aus Rest Spermien entstehen bei der Präparation freigegeben. Halten Sie die Eigelege von unterschiedlichen Tieren getrennt zu unkontrollierten Kreuzbefruchtung zu vermeiden. Abnorme Entwicklung kann verschiedene Ursachen haben. Am Anfang und am Ende der Saison, nachdem der Embryo von verschiedenen Individuen getrennt zu halten, sind die besten Chargen gewählt werden. Vermeiden Sie die Embryonen Stören für die10 min, die Befruchtung folgen mit ihren Ooplasma Segregation nicht zu stören. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen nicht gestartet Teilung während übertragen werden wie Pipettieren die Schwester Blastomeren und führt zu einer teilweisen Embryonen trennt. Verwenden Sie weniger Spermien für dechorionated Eier Polyspermie zu vermeiden. Verwenden Sie frisch zubereitet aber gespült Agarose-Gerichte. Stellen Sie sicher, dass die Pipettiervorrichtung Fixiermittel frei ist. Behalten Sie die Kontrolle Embryonen, die nicht dechorionated wurden und nicht durch Elektroporation bei zu erkennen, die Entwicklungsschritt gestört wurde. Ergänzen Sie die Embryonen mit Antibiotika, wenn eine Kontamination und Zersetzung auftritt.

Wenn das Injektionsgerät "verstopft" hat, kann die Injektionsnadel Öffnung durch Austreiben einige seiner gefärbten Inhalt überprüft werden. Verstopfungsmaterial durch sorgfältig sein kann Ziehen mit der Nadelspitze durch die Agarose abgewischt. Luftblasen in den Injektionsschlauch und / oder die Nadel entfernt werden sollte. Ändern Sie die Nadel für eine bessere Kontrolle des Injektionsvolumens als neeDLE Spitze entlang Injektion brechen oder verstopfen können. Spülen Sie die Eier und legen Sie sie in einem sauberen Injektions Gericht, wenn Schmutz in der Schale angesammelt hat. Zentrifugieren Sie die Injektionslösung vor dem Befüllen frischen Nadeln, um irgendwelche kleinen Teilchen oder Kristalle zu sedimentieren. Ebenfalls hilfreich praktiziert Injektion nur mit Vitalfarbstoff. Überprüfen Sie die Injektionstechnik aus injiziert und nicht injizierten Eier befruchten. Schließlich kann mit einem erfahrenen Kollegen Beratung hilfreich sein Injektionstechnik zu verbessern.

Zu steuern , um Nebeneffekte eine zweite nichtüberlappende MO und Rettungs mit einer modifizierten mRNA, die von den MOs nicht erkannt wird , kann getreu unspezifische phänotypischen Effekte in Ciona auszuschließen.

Mikroinjektions: Bedeutung und Grenzen

Mikroinjektions in Ciona wurde der erste Entwurf für eine ganze Embryo Genregulationsnetz (GRN) in einer chordate ¹¹ zu erzeugen , verwendet werden . Doch trotz einer solchen REMArkable Leistung, die Mikroinjektion in Ciona Embryonen hat seine Grenzen, aufgrund der relativ geringen Größe (0,14 mm Durchmesser) von Ciona Eier. Im Vergleich zu denen von anderen Chordaten Spezies , bei denen fremde DNA / mRNA durch Mikroinjektion eingeführt wird, sind Ciona Eier vergleichsweise schwierig zu handhaben und die Geschwindigkeit der injizierten Ciona Embryonen pro Experiment bleibt gering (im Durchschnitt 30 bis 50 Embryonen pro Versuch), quantitative Analysen zu behindern. Dennoch ist für störender mütterliche Faktoren in Ciona, Mikroinjektion von MOs ist die Methode der Wahl auch deren Einbindung in zygotischen Beginn der Entwicklung von der 16 bis 32 Zellstufen ¹⁵ zu studieren. Darüber hinaus ist es möglich, wenn auch viel schwieriger bis zum 16-32-Zellen-Stadium einzelnen Blastomeren zu microinject. Schließlich bleibt Mikroinjektions die effizienteste Technik zur Herstellung von transgenen Embryonen zu erzeugen (durch mRNA oder DNA - Injektion) in ascidian andere Arten als Ciona, für die vollständig optimized Elektroporationsprotokolle gibt es nicht.

Elektroporation: Bedeutung und Grenzen

Um die niedrigen Zahlen und anderen Einschränkungen der Mikroinjektion zu überwinden, hat die meisten der Ciona Gemeinschaft Elektroporation von Plasmid - DNA verwendet , da es entwickelt und wurde als ein optimiertes und standardisiertes Protokoll von Zeller et al. 2004 ^9. In der Tat Tausende von transgenen Ciona Embryonen mit bis zu 500 Embryonen können in einer Küvette in einer Stunde erzeugt werden unter Verwendung eines einzelnen 50 V Impuls von 16 msec gleichzeitig elektroporiert. Der Ansatz der Erzeugung massive Anzahl von transgenen Embryonen ist unter chordate Modellorganismen wie vor einzigartig. Dies hatte Ciona führte schnell als ein leistungsfähiges Modellsystem erkannt werden für Analysen potentieller cis Aufsichtsrechtliche Regionen und zelluläre / subzelluläre Lokalisierung in vivo durchgeführt wird , wie hier beispielhaft.

Obwohl electroporatiauf in Ciona Zygoten grundsätzlich steht vor der Chordaten GRN Forschungsfeld, die Technik dennoch gewisse Grenzen revolutioniert hat. Zunächst werden Plasmide transient in Ciona Embryonen eingeführt und werden höchstwahrscheinlich als extrachromosomale Arrays geerbt, spekulativ die Stabilität von Plasmid - DNA durch Elektroporation zu machen. Des Weiteren ist es sehr schwer, vielleicht sogar unmöglich, die Kopien von Plasmiden durch Elektroporation zu steuern, die pro Zygote aufgenommen wird, wodurch in phänotypischen Schwankungen führt. Ein weiteres Problem, das es schwierig macht, die Elektroporation Ergebnisse zu interpretieren ist ein Phänomen, das wir mosaicism nennen. Elektroporiert Plasmid-DNA kann an verschiedenen Positionen der Bühne embryo eint Zelle aufgenommen werden; die bestimmt, welche und wie viele Viertel der Zygote wird Plasmid erhalten von den Abkömmling Blastomeren vererbt werden. Solche Variationen machen deutlich die Interpretation der quantitativen Effekte erschwert. Allerdings sind die meisten Probleme, die kommen mit electroporation Variabilität werden durch eine entsprechende Menge an biologischen Proben, mit dem Zählen und Statistiken von LacZ (oder GFP) positive Zellen gelöst, die in einer einzigen Charge leicht erhältlich ist.

Vielseitigkeit und das Potential der Elektroporation für die Gentechnik

Die Elektroporation ermöglicht schließlich für den Mitteldurchsatz - Screening von potentiellen cis Aufsichtsrechtliche Regionen und quantitative Analysen von Genfunktionen einmal kloniert in Reporter oder Expressionsplasmide. Aufgrund der kompakten Genom Ciona, ist die Identifizierung und Klonierung von potentiellen regulatorischen Regionen recht unkompliziert ^3. Eine Strategie für die Verwendung der Fülle von Community - Daten ist in 2A gezeigt. Klonierung von Reporter und Gen - kodierenden Plasmide wird weiter durch die Erzeugung von Ciona erleichtert angepasst, GATEWAY kompatiblen Vektor Suiten ¹⁹ und ein kompatibles voller Länge ORF Bibliothek ^18. Beide Tools stehen zur Verfügung für die Gemeinschaft undermöglichen eine effiziente, Restriktionsenzym freie Rekombination von regulatorischen Treiber und codierende Regionen, wie in 2B dargestellt.

In den letzten Jahren wurde die Elektroporation erfolgreich angepasst Gewebe gezielte Genmanipulation mit Plasmiden zu erreichen , die Gen - Editing - Tools wie die CRISPR / Cas9 Komponenten unter der Kontrolle von gewebespezifischen Treiber ^21,22 auszudrücken. Solche Ansätze werden unser Verständnis der Dynamik von KNS und die potenziell konservierten Signalmechanismen, einschließlich der Transkriptionsfaktor-Codes beteiligt in der Gewebebildung und der schrittweisen Ausstieg aus Pluripotenz schnell vorantreiben. Weiterhin gewebsspezifische Verlust- oder gain-of-function Ansätze (durch CRISPR / Cas9 oder durch Überexpression) unter Verwendung von Elektroporation wird instrumental Ciona Orthologe der humanen krankheitsassoziierten Genen zu untersuchen. Tatsächlich Kataloge für Ciona Orthologe menschlicher Krankheitsgene und ihre Klone voller Länge ORF Codierung sind leicht available für die Analyse in Ciona ^{1 8.} Aufgrund der genomweiten Doppelungen bei Wirbeltieren, besitzen die meisten menschlichen Gene funktionell redundante Paraloge , die Analysen von Genfunktionen ¹ erschweren. Ciona ein einfacheres System mit dem typischen chordate Gewebe Anordnung in Larven sein sollten grundlegende Rollen so wichtiger, oft funktionell konservierte Gene aufzudecken.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Labor mit konstanter Temperatur (~18 ° C)			Für die Arbeit von Embryonen
Ciona intestinalis Erwachsene	UPMC - Station Biologique, Roscoff, Frankreich		Zum Sammeln von Gameten
NaCl	Roth	3957.1	Für ASWH
KCl	Roth	6781.1	Für ASWH
CaCl2x2H2O Roth		A119.1	Für ASWH
MgCl2x6H2	O Roth	2189.1	Für ASWH
MgS04x7H2	O Roth	P027.2	Für ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	Für ASWH
Hepes	Roth	HN78.3	für ASWH
Natriumthioglykolat	Sigma	MZ-6	für Dechorionierungspronase
	Sigma	T0632-100G	für die Dechorionierung
von D-Mannitol	Sigma Aldrich	M9546-250G	Für die Elektroporation
Plasmid-DNA (Vorbereitung >1&Mikro; g/µ l)	Macherey-Nagel	740410.100	Für Elektroporation oder Mikroinjektion
Agarose	beliebiger Lieferant		Zum Beschichten von Embryokulturschalen
Petrischalen aus Kunststoff	VWR	612-2079	Beschichtet mit 1% Agarose in ASWH, abgedeckt mit ASWH
Kleine Schere	beliebiger Lieferant		Zum Präparieren von Gameten
NaOH	Roth	6771.1	Zur Aktivierung der Dechorionierungslösung
Tris	Roth	5429.3	1 M pH 9,5, zur Aktivierung
der Spermien Pasteurpipetten	VWR	612-1701	Behandelt durch Eintauchen in Leitungswasser für mindestens 12 Std
Handzentrifuge	Hettich Zentrifugen	1011	Verwendung von Glaszentrifugenröhrchen
1,5 ml Eppendorf Röhrchen	Sigma	T3406-250EA
2 ml Eppendorf Röhrchen	Sigma	T3531-200EA
Quadratischer Elektroporator	Bio Rad Gene Pulser Xcell
Elektroporationsküvetten 4 mm	Eurogentec	CE-0004-50
Deckgläser	Sto Premium	PR248212600
Objektträger	VWR	ECN 613-1551
Glutaraldehyd	Sigma	G6257-10ML	Zur Fixierung in LacZ Färbemittel
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-500G	Zur Fixierung von fluoreszierenden Proben
Vectashield	Vector	H-1000	Zur Fixierung von fluoreszierenden Proben
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl ß-D-Galactopyranosid)	Roth	2315.2	LacZ Substrat; vorrätig in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamid)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	Für LacZ-Färbepuffer
K3Fe(CN)6	Merck	4973	Für LacZ-Färbepuffer
Na22HPO4	Roth	4984.2	Für PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	Für PBT-Tween
	Sigma	SLBJ5103V	für PBT
Mineralöl	Sigma	M8410	Embryokultur getestet
Green Vital Dye	Fast Green Sigma	F7251	für Mikroinjektion; 10&Mikro; g/µ l
Mikropipettenabzieher (flammend/braun)	Sutter Instruments	Modell P-97	Zum Ziehen von Injektionsnadeln
Kapillaren aus Borosilikatglas GC100TF-10	Harvard Apparatus Ltd. UK	30-0038	1,0 mm Außendurchmesser x 0,78 mm Innendurchmesser, mit Filament, für Mikroinjektion
Mikromanipulator	Narishige	MWS-2	Dreiachsiges Ölhydrauliksystem; für 3D-Feinbewegung während der Injektion
Injektionshalter	Narishige	1M-H1	Zum Halten von Injektionsnadeln, gesamtes System mit Mineralöl gefüllt
Ganzglasspritze	Walter Graf & Co GmbH & Co. KG	Nr. 95199.10427A4	10 ml FortunaOptima; gefüllt mit Mineralöl, zur Feinabstimmung des Mikroinjektionsdrucks
Morpholinos	GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA		Injektion bei 0,25-0,5 mM
Capped mRNA	Ambion mMessage mMashine Kit		Injektion bei 0,05-0,5µ g/µ l
Plasmid-DNA-Injektion			bei 20 ng/&mikro; l
Rekombinationsklonierungskit	Gateway BP Clonase Enzymmix Invitrogen	11789-013
Rekombinationsklonierungskit	Gateway LR Clonase Enzymmix Invitrogen	11791-019
Anti-HA Tag Antikörper	abcam	ab9110	für Immunfluoreszenz, verwenden Sie 1:400 in 3% BSA/PBT
TRITC Ziegen Anti-Kaninchen-Antikörper	Jackson	111-025-144	Für Immunfluoreszenz verwenden Sie 1:300 in 3 % BSA/PBT