Methodenartikel

Ein Verfahren zur gezielten Zellisolierung über Glas Oberflächenfunktionalisierung

DOI:

10.3791/54315

⸱

20. September 2016

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1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die anpassbare Oberflächenfunktionalisierung des Desthiobiotin-, Streptavidin- und APTES-Systems, um bestimmte Zelltypen von Interesse zu isolieren. Darüber hinaus behandelt dieses Manuskript die Anwendungen, die Optimierung und die Verifizierung dieses Prozesses.

Zusammenfassung

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Einer der limitierenden Faktoren für die Einführung und Weiterentwicklung der personalisierten Medizin ist die Unfähigkeit, diagnostische Werkzeuge zu entwickeln, um individuelle Nuancen in der Ausprägung von Patient zu Patient zu untersuchen. Derzeitige Methoden, die versuchen, Zellen zu trennen, um diese Nische zu füllen, führen zu einer Störung der physiologischen Expression, wodurch die Trenntechnik als diagnostisches Werkzeug unbrauchbar wird. In diesem Protokoll beschreiben wir die Funktionalisierung und Optimierung einer Oberfläche für den zellulären Fang und die Freisetzung. Diese funktionalisierte Oberfläche integriert biotinylierte Antikörper mit einer Glasoberfläche, die mit einem Aminosilan (APTES), Desthiobiotin und Streptavidin funktionalisiert ist. Die Zellfreisetzung wird durch die Einführung von Biotin erleichtert, das die Wiedersammlung und Reinigung der von der Oberfläche eingefangenen Zellen ermöglicht. Diese Freisetzung erfolgt durch das Targeting des sekundären Anteils Desthiobiotin, was zu einem viel sanfteren Freisetzungsparadigma führt. Diese Reduzierung von aggressiven Reagenzien und Scherkräften reduziert Veränderungen in der zellulären Expression. Die funktionalisierte Oberfläche fängt bis zu 80 % der Zellen in einer Einzelzellmischung ein und hat eine 50 %ige Erfassung in einer Doppelzellmischung gezeigt. Anwendungen dieser Technologie auf Xenotransplantate und Krebstrennungsstudien werden untersucht. Quantifizierungstechniken für die Oberflächenverifizierung wie Plate Reader und ImageJ-Analysen werden ebenfalls beschrieben.

Einleitung

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Strom bench-top Zelltrennungsansätze (zB Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung 1, Laser Capture Mikrodissektion 2, immuno-magnetische bead Trennung 1) kann mehrere Stunden dauern Vorbereitung und Sortierung. Diese großen Zeitskalen können physiologische Reaktion und Expressionsspiegel beeinflussen, in Analysen führt , die nicht repräsentativ für die physiologische Reaktion 3 sind. Die Systeme werden benötigt, die schnell und effizient spezifische Zelltypen Zelloberflächenrezeptor-Ebenen, um Zellisolierung und Bereicherung für biomedizinische Anwendungen ohne Unterbrechung zu verbessern isolieren kann. Daher ist der Grund für unser Ansatz einen sanften Ansatz zur Zellisolierung zu entwickeln.

Das "Lab on a Chip" -Konzept bietet das Versprechen um Größenordnungen schneller (Stunden zu Minuten) Zellisolierung und am häufigsten werden Zellen auf einer Oberfläche und die Freigabe Zellen oder intrazelluläre conte Erfassungnts durch physikalische 4,5 oder chemische Verfahren 6. Obwohl diese Ansätze einige Vorteile, wie die Identifizierung Protein 7,8 Expression bieten, Identifizieren RNA - Expression 9-11, oder sogar Zellen für die in vitro Kultur 12,13, sind viele dieser Techniken Bereitstellung kann aufgrund Diagnostik wie Zellrezeptor Profilierungs übersetzt zu ihren nicht-physiologischen Umgebungen. Die enzymatische Hebemittel wie Kollagenasen können auch diese Rezeptor Mengen 14,15, was bedeutet , Zell - Rezeptor Quantifizierung Techniken beeinflussen , dass diese Hebemittel verwenden, nicht genaue physiologische Daten erzeugen. Zelluläre Lyse verhindert Differenzierung zwischen den nativen Oberflächenrezeptoren, und solche , die 16 zuvor verinnerlicht wurden. Dieses Protokoll beschreibt einen schnellen und schonenden Ansatz zur Zellisolierung.

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Protokoll

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1. Reinigung der Glasoberfläche und Vorbereitung Reagenzien

  1. Legen Sie eine Glasoberfläche in einem Sauerstoffplasma Maschine für 5 Minuten bei 50% Leistung zu reinigen.
  2. Bereiten 2,5 ml 2% rekonstituiert (3-Aminopropyl) triethoxysilan (APTES) Lösung, durch Zugabe von 50 & mgr; l APTES und 2,45 ml Ethanol in einem konischen Röhrchen.

2. APTES und DSB Funktionalisierung

  1. Hinzufügen APTES Lösung auf die Oberflächen. Je 150 & mgr; l pro Vertiefung für 8-Well-Platten. Je 100 & mgr; l pro Vertiefung für 24-Well-Platten. Pipette 1,1 ml für 60 x 15 mm Glasschalen. Decken Sie die Oberflächen Verdunstung und ungleichmäßige Verteilung der APTES Lösung zu verhindern. Platzieren Sie die Oberflächen auf einem Plattformschüttler 50 Minuten lang bei Raumtemperatur, die eine gleichmäßige Verteilung der APTES Schicht erzeugt.
    HINWEIS: APTES ein Aminosilan, das die erste Schicht der Oberfläche bildet. Wenn eine andere Oberfläche unter Verwendung heuristisch das Volumen der Lösung bestimmen, erforderlich, um die Oberfläche zu bedecken.
  2. Wählen Sie die Temperatur für den Ofen, während die Oberflächen auf dem Schüttler sind: Erwärme auf 55 ° C für 2 Stunden für die 8-Well-Platten und Platten mit 24 Vertiefungen. Wärme Glas nur Geschirr bis 90 ° C für 1 Stunde.
  3. Spülen Sie die Oberflächen mit Ethanol.
    1. Verwalten die Menge an Ethanol erforderlich Referenzierung basierend auf der Oberfläche verwendet. In 150 ul Ethanol in jede Vertiefung für 8-Well-Platten. In 125 ul Ethanol zu jeder Vertiefung für 24-Well-Platten. In 1,1 ml Ethanol für Glasschalen.
    2. Spülen der Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Spülen Sie zweimal unter Verwendung von Ethanol.
      HINWEIS: Wenn eine der Glasboden-Well-Platten in ihnen jede Kunststoff haben, sie nicht über 65 ° C erhitzen, da der Kunststoff zu schmelzen und verformen beginnt.
  4. Trocknen Sie mit 100% Stickstoffgas aus einem Tank abgegeben. Legen Sie die Oberflächen in der oven.
  5. Bereiten 2,5 ml D-Desthiobiotin (DSB) Lösung durch Vereinigen von 1,5 mg / ml DSB in 37,5 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) und 5 mg / ml 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) in 2462,5 & mgr; l der 0,1 M 4-Morpholinethansulfonsäure-Hydrat (MES) (pH 6) Puffer. Kombinieren Sie dann beide Lösungen.
  6. 1 ul 2-Mercaptoethanol β, nach 15 min in die Lösung, um die Reaktion zwischen DSB und EDC zu quenchen. Entfernen Sie heißen APTES funktionalisierte Glasoberflächen aus dem Ofen. Warten Sie 5-10 min für die Glasflächen zu kühlen.
  7. In MES die Oberfläche Puffer zu spülen, mit Mengen auf der Oberfläche basiert. In 150 ul MES in jede Vertiefung für 8-Well-Platten puffern. In 125 ul MES in jede Vertiefung für 24-Well-Platten puffern. In 1,1 ml MES-Puffer für Glasschalen.
  8. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten Sie die Pipette auf etwa ein Winkel von 70 °, so wird die Spitze nicht direkt daraufin die Oberfläche. Spülen Sie zweimal mit MES-Puffer.
  9. Tragen Sie die DSB-Lösung auf die Oberflächen zu ermöglichen, sie zu brüten. In 150 ul DSB-Lösung pro Vertiefung für 8-Well-Platten. 100 l DSB-Lösung pro Well für 24-Well-Platten. In 1,1 ml für Glasschalen DSB Lösung.
  10. Legen Sie die DSB bedeckt Glasflächen auf einem feuchten Papiertuch in einer Petrischale. Zudecken und in einem 4 ° C Kühlschrank für 18-24 Stunden inkubiert.

3. Streptavidin-Funktionalisierung

  1. Spülen jeder Glasoberfläche dreimal mit 1 ml 1,0x Phosphate Buffered Saline (PBS). Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Man verdünnt das Streptavidin (Streptavidin) Stammlösung auf 0,4 mg / ml (empfohlen).
    HINWEIS: PBS isotonisch ist, so dass es als ein Medium zur Verdünnung und Spülen verwendet werden kann. PBS wird als Lösungsmittel für die SA verwendetv, und daher wird keine Auswirkung auf die Fähigkeit des SAv an die Oberfläche zu binden.
  2. Gelten 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung gleichmäßig auf den Oberflächen, so dass eine dünne Schicht bildet sich an der Unterseite des Glases, die Menge der Lösung wählen basierend auf Oberfläche. Für 8-Well-Platten mit 150 & mgr; l 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung pro Vertiefung. Für 24-Well-Platten mit 100 & mgr; l 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung pro Vertiefung. Für Glasschalen, fügen Sie 1,1 ml 0,4 mg / ml Streptavidin-Lösung.
  3. Decken und die Platten zu einer 14 cm Petrischale bewegen, Feuchtigkeit zu speichern. Inkubieren Sie die Petrischale im Kühlschrank für 18-24 Std.
    HINWEIS: Es ist wichtig, konsistente Mengen von APTES, DSB und SAv auf jeder Oberfläche zu verwenden.
  4. Spülen jeder Glasoberfläche dreimal mit 150 ul PBS SAv zu entfernen. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet.
  5. Befeuchten Sie ein Papiertuch with de-ionisiertes Wasser und legen Sie das Papiertuch in 14 cm Petrischale flach, die Platten umgebenden Feuchtigkeit in den Vertiefungen zu halten. Decken Sie die Petrischale mit den Brunnen. Inkubieren Sie die Petrischale in einem 4 ° C Biosafety Level 1 (BSL-1) Kühlschrank, bis sie benötigt.

4. Zelleinfang und Freigabe

  1. Beginnen mit T175-Kolben (n) von Zellen für das Experiment bestimmt. Absaugen Medien von Kolben (s). Waschen Sie die restlichen Medien mit 5 ml Raumtemperatur PBS. Aspirat PBS aus dem Kolben (s).
  2. 10 ml nichtenzymatische Hebemittel, wie Zelldissoziationslösung, auf die T-175-Kolben von Zellen. Setzen Sie den Kolben in den Inkubator für 6 min zum Anheben der Zellen aus dem Kolben zu ermöglichen.
  3. Nach 6 min, 10 ml kalter Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; Siehe Liste der Materialien), um das Hebemittel zu inaktivieren. Nehmen Sie 20 ul Zellen Anzahl von Zellen in Lösung zu zählen ein Hemacytometer verwenden.
    HINWEIS: Je nach functionalisierten Oberflächen im capture Experiment verwendet, variiert die Anzahl der Zellen benötigt. Für funktionalisierte 8-Well-Platten, verwenden 300.000 Zellen pro Vertiefung. Für funktionalisierte Glasschalen, verwenden Sie 1,1 Millionen Zellen. Für funktionalisierte 24-Well-Platten, werden 125.000 Zellen empfohlen. Mehr Informationen über Zellzählung wird im Supplement gefunden.
  4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1- 4.3 für einen anderen Kolben von Zellen, wenn weniger Zellen vorhanden sind, als für das Experiment benötigt. Kombinieren Zellsuspensionen und Nachzählung Zellen zur Gesamtzahl der Zellen in Lösung erhalten.
  5. Spin-Down-Zellsuspension in einer Zentrifuge bei 500 × g für 5 min bei 4 ° C, um ein Pellet von konzentrierten Zellen zu erhalten. Finden Sie die entsprechende Menge an HBSS zur Zellsuspension hinzufügen , um eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen pro ml zu erhalten, aspirieren dann den Überstand von den Zellen abzentrifugiert, und fügen Sie das berechnete Volumen. Dieses Volumen kann unter Verwendung der Gleichungen im Supplement berechnet werden.
  6. Pipette nach oben und unten (triturate) zu suspendieren the Zellen in Lösung und zelluläre Verklumpung in Lösung reduzieren, die Antikörperbindung reduzieren kann. Teilen Sie die zelluläre Lösung in getrennte Kontroll- und experimentellen Lösungen. Sehen Sie einen Brief Datei für Komponenten und Berechnungen.
  7. Fügen Sie die biotinylierte Antikörper an die jeweiligen Zelllösungen, wie in der Supplemental Datei beschrieben. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C auf einem End-Over-End-Mixer.
    HINWEIS: Bei MCF7GFP Zellen wurden 0,5 mg / ml hIgG oder 0,5 mg / ml HLA-ABC-Antikörper werden empfohlen. Bei RAW-Makrophagen, 1 mg / ml mCD11b werden auf die Hälfte des Volumens für die Bilanzierung der Verdünnung Unterschiede empfohlen. Für menschlichen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs), 0,5 mg / ml hCD31 wird empfohlen.
  8. Waschen Sie die funktionalisierte Glasoberfläche mit HBSS. Für dieses Experiment ist ein 8-Well-Platte beraten.
    1. In 150 ul HBSS in jede Vertiefung für 8-Well-Platten. Spülen Sie zweimal HBSS verwenden. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen.Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Halten Sie kalt bei 4 ° C.
  9. In Zelllösungen in die Vertiefungen und 45 Minuten warten, bis die Zellen auf Eis auf dem Schüttler inkubiert. Sprechen Sie die Lösung von Biotin in steriler HBSS von berechneten Volumina unter Verwendung der in der Ergänzung beschrieben.
  10. Entfernen Sie die Zell-Lösung aus den Glasbrunnen durch HBSS mit.
    1. Gently Pipette in jede Vertiefung 150 ul HBSS. Dann die HBSS Pipette aus. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet.
    2. Wiederholen Sie zwei weitere Male. Nach dem Waschen hinzufügen HBSS in die Vertiefungen, die Zellen feucht zu halten.
  11. In 150 ul 20 mM Biotin-Lösung auf die jeweilige Veröffentlichung gut, und warten Sie 20 Minuten für die Reaktion zu ermöglichen.
  12. Erinnere nicht spezifisch gebundene Zelles durch Waschen mit HBSS, wie oben angegeben, und dann fluoreszierend markierten Zellen bei Verwendung, gehen Bild zur Fluoreszenz der Zellen. Auch Bild lebenden Zellen in einem Kolben (als Kontrolle, wobei die Zellen in der Vertiefung zu vergleichen). Wenn das grün fluoreszierende Protein (GFP) transfizierte Zellen verwenden, wird die Anregung 470 nm, und die Emission wird 515 nm sein.

5. Antikörperoptimierung: Antikörper-Titration

  1. Beginnen Sie, indem die Zellen aus dem T75 oder T175-Kolben heben, wie in Schritt 4.1- 4.3 erläutert.
    HINWEIS: Diese Volumina sind für 24-Well-Platten kalibriert, kann aber keine Glas funktionalisierten Oberflächen durch heuristische Tests zu entsprechen geändert werden. Eine repräsentative Antikörpertitration ist in Abbildung 1 dargestellt.
  2. Zählen von Zellen unter Verwendung des Hämazytometers und dann drehen, um die Zell-Lösung in einem konischen Röhrchen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Rekonstitution Zellen zu 1 Million Zellen pro ml, unter Verwendung der in der Ergänzung beschriebenen Berechnungen.
  3. Teilen Sie die 1 million Zellen pro ml Lösung in sechs verschiedenen Lösungen von 500 & mgr; l in verschiedene Zentrifugenröhrchen für den Antikörper (Ab) Lösungen.
    1. Verdünne die Antikörper-Stammlösung zu 10 & mgr; g / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Erzeugen die Steuerungen unter Verwendung von 100 & mgr; l Stain-Puffer (PBS + 1% Natriumazid + 1% BSA) und 500 & mgr; l Zellen für die Kontrolle ohne Ab darin. Für die Blindkontrolle (No Ab und keine Zellen), eine Lösung von 300 & mgr; l PBS verwenden.
      HINWEIS: ACHTUNG: Natriumazid ist extrem giftig, explosiv, und extreme Vorsicht ist geboten, wenn es zu benutzen. Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblatt (SDB) und die entsprechende Sicherheitsausrüstung verwenden.
  4. Kombinieren und inkubieren Sie die Ab-Lösungen mit den Zell Lösungen im End-Over-End-Mixer bei 4 ° C für 30 min. Spülen Sie die funktionalisierten 24-Well-Platten mit HBSS dreimal. Spülen der Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten Sie die piPette ungefähr in einem 70 ° Winkel, so dass die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet wird.
  5. Aliquot 125 ul jeder Probenlösung in die entsprechenden APTES, DSB und SAv gut funktionalisiert. Inkubieren bei 4 ° C oder auf Eis für 45 min auf der Glasoberfläche. Spülen der Oberfläche mit HBSS dreimal unspezifisch gebundenen Zellen zu entfernen. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Sie NICHT die untere Reihe spülen, wie die Kontrollen sind.
  6. In 150 ul HBSS zu jeder gut gewaschen, legte die 24-Well-Platten auf Eis, und dann einen Plattenleser verwenden Fluoreszenz von GFP Zellen zu messen (Anregung 485 nm / Emission 528 nm).

6. Zell Optimierung: Titrierzelle

  1. Heben Sie die Zellen wie in den Schritten 4.1 -4.3 erwähnt.
  2. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämacytometers. Spin down Zelle sosung in konischen Röhrchen bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Rekonstituieren Zellen zu 1 Million Zellen pro ml.
    HINWEIS: Weitere Informationen über die Verwendung des Hämazytometers kann im Supplement finden.
  3. Pipette 1,6 ml der Zelllösung für die 1,6 Millionen Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 800 ul Zellen aus der Zelllösung für die 800.000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 80 ul aus der Zelle Lager für die 80.000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr. Pipette 8 ul aus der Zelle Lager für 8000 Zellen Lager und in einem konischen Rohr.
    HINWEIS: Die Konzentrationen werden pro 8-Well-Platte Messungen gegeben, replizieren nach Bedarf. Ein Beispiel der Plattenausgabe wird in Abbildung 2 dargestellt.
  4. Nehmen Sie die vier Stammlösungen und Spin in einer Zentrifuge bei 500 xg für 5 min bei 4 ° C. Re-suspend alle Stammlösungen in 400 ul HBSS.
  5. In 1,6 ul 100 ng / ml Antikörper an die 1,6 Millionen Zelle Lager, 0,8 μl auf die 800.000 Zelle Lager, und 0,5 ul auf alle anderen Aktien. Inkubieren des Antikörpers für 30 min in die End-over-End-Mixer für 30 min bei 4 ° C. Waschen Sie die funktionalisierte Glasoberfläche mit HBSS dreimal.
    HINWEIS: Die funktionalisierte 8-Well-Platte ist für die Mikroskopie Quantifizierung empfohlen, während das funktionalisierte 24-Well-Platte für Platte Leser Quantifizierung empfohlen. Antikörperkonzentration für 8000 Zellstoff wurde nicht der begrenzende Faktor der Erfassungsfläche zu ermöglichen, reduziert nicht der Mangel an Antikörper in Lösung zu sein, sondern die Erfassung von Eigenschaften der Oberfläche.
  6. Anwenden 150 ul der Probenlösungen in jede Kammer. Tragen Sie die 1,6 Millionen Zelle Lager auf der ersten Spalte der Brunnen auf der linken Seite. Tragen Sie die 800.000 Zelle Lager auf der zweiten Spalte von links. Tragen Sie die 80000 Zelle Lager auf der dritten Spalte von links. Schließlich gelten die 8000 Zelle Aktie der letzten Spalte. für 45 min inkubieren, auf dem Schüttler bei 4 ° C.
    HINWEIS: Die 1,6 MillionenZelle Lager dient als höchste Konzentration getestet werden, und ist die doppelte Menge an Zellen, die normalerweise in der Zelltrennung Experimente verwendet (600.000 Zellen pro Vertiefung) Die 800.000 Zelle Lager dient als Kontrolle für das Experiment, wie es die typische Zellkonzentration ist dass in Zelltrennungsversuche (3.000.000 Zellen pro Vertiefung) verwendet. Die 80.000 Zelle Lager dient als zehnfache Verdünnung für niedrigere Konzentrationen für die zelluläre Erfassung (30.000 Zellen pro Vertiefung) zu testen. Die 8000 Zelle Lager dient als hundert fache Verdünnung als Test verwenden, um die untere Grenze der Zelltrennung (3.000 Zellen pro Vertiefung) zu überprüfen.
  7. Spülen Sie mit HBSS dreimal. Spülen Oberfläche durch Entladen und die Flüssigkeit von einem festen Punkt, wie beispielsweise die Ecke des Bohrloches zu ziehen. Halten der Pipette bei ungefähr 70 ° Winkel, so wird die Spitze nicht direkt in die Oberfläche gerichtet. Sammeln Sie alle Wäschen.
  8. Bild die Zellen auf einem Fluoreszenzmikroskop, bei Verwendung von 8-Well-Platten, machen Sie Fotos von jedem surGesicht und auf jede Oberfläche bei 4 ° C auf dem Schüttler eine Stunde Biotin 150 & mgr; l an. Biotin Release Brunnen mit HBSS 3 mal Nach einer Stunde gründlich wie zuvor. Sammeln Sie alle Waschungen aus Brunnen zum Zählen mit dem Hämozytometer und Bild die Freigabe Brunnen.
  9. Bewerben 150 ul 20 mM überschüssige Biotinlösung an Biotin Freisetzung Vertiefungen für 1 Stunde veranschlagen, wenn 24-Well-Platten verwenden, und dann spülen den Vertiefungen 3 mal mit HBSS. Quantifizieren 24-Well-Platten mit einem Plattenleser. Verwenden Sie eine Hemacytometer Zellen aus allen gesammelten gut Waschungen zu zählen.

7. Bildanalyse

Hinweis: Die FIJI-Software-Paket (http://fiji.sc/Fiji) wird für die Bildanalyse empfohlen. Zunächst wurden die Bilder in Graustufenbild umgewandelt, und dann wird die Helligkeit / Kontrast verändert wurde, um die Zellen zu bringen.

  1. Laden Sie das Bild nach oben, und konvertieren, indem Sie auf das Bild und dann auf das Scrollen nach unten zu "Typ" in Graustufen und dann auf4; 8-Bit ".
  2. Erhöhen Sie den Kontrast des Bildes durch das Bild Registerkarte klicken und dann scrollen auf "Anpassen". Klicken Sie auf "Helligkeit und Kontrast", und dann die Bildlaufleisten verwenden, um die Zellen abheben. Wenn Fluoreszenzbilder verwenden, invertieren die Bilder um die Zellen zu machen mehr definiert.
  3. Laden Sie ein Plugin auf ImageJ ITCN genannt (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html), um die Bilder zu analysieren.
  4. Öffnen Sie ITCN. Wenn ein Dialogfeld angezeigt, das den Benutzer mit verschiedenen Parametern aufgefordert, die Größe der Zelle zu schätzen, die minimalen Breite der Zelle zunächst von Interesse. Klicken Sie auf die "Detect Dunkle Peaks" Option, wenn das Bild fluoresziert und die Zellen werden abgedunkelt.
  5. Stellen Sie den Grenzwert bei 2 zunächst, und dann drücken Sie die "Count" -Taste. Eine neu gezählt Version des Bildes erscheint mit roten Punkten abgrenzen, wo Zellen gezählt wurden.
  6. Stellen Sie die Schwelle und Breitenparameter genauer Handy-Daten von defini zu erhaltenng die Größe einer "Zelle". Hinweis: Die Anzahl der gezählten Zellen in einem Dialogfeld auf der rechten Seite sein wird. Ändern von Parametern unterschiedliche Anzahl von Zellen gezählt geben.
  7. Weiterhin durch die Schwelle und Breitenparameter zu iterieren, bis eine gute Abschätzung für die Anzahl von Zellen erreicht ist.

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Ergebnisse

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Mit diesem Protokoll wir Zelleinfang zeigen (3A) und Zellfreisetzung (3C) von MCF7GFP Zellen sowie Live - Zellkontrollen (Abbildung 4). Wir quantifizierten die Zelle capture als 60% und 80% freigesetzt wurden (Abbildung 3C). Wenn wir diesen Ansatz zu einer Mischung aus RAW 264.7 Makrophagen und MCF7GFP Zellen verlängert, 50% der RAW - Makrophagen wurden gefangen genommen (Abb. 3D) und 80% der RAW - Makro...

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Diskussion

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Verbesserungen in der Zellisolationstechniken fördert wissenschaftliche Untersuchungen in der Struktur-Funktions - Beziehungen in den Neurowissenschaften 18, Zell - Programmierung in der regenerativen Biologie stammen, und angiogenen Signalgebung in der Gefäßbiologie 19. Tatsächlich primäre Zellkultur 20 (zB HUVECs) in vaskulären biology wird in erster Linie durch die Verwendung von Zellisolierungstechniken durchgeführt. Zellisolierung wurde auch für die quantitative Flow (QFlow...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Wir möchten uns bei der American Cancer Society, Illinois Division (282802) und der National Science Foundation CBET (1512598) für die finanzielle Unterstützung bedanken. Wir möchten uns auch bei Dr. Dianwen Zhang vom Beckman Institute der University of Illinois für die Mikroskopie-Ausbildung bedanken. Abschließend möchten wir uns bei Jared Weddell, Stacie Chen und Spencer Mamer für die aufschlussreichen Diskussionen bedanken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
(3-Aminopropyl)-triethoxysilan (APTES)Acros Organics919-30-2Wird zur Herstellung von 2%iger APTES-Lösung
verwendet Plasmareiniger PicoDienerModell 1Reinigt Oberflächen und ermöglicht die Bindung von PDMS an Glas
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Wird als Freisetzungsmechanismus in der zellulären Erfassungsoberfläche verwendet.
Dimethylsulfoxid (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPLöst das DSB in Lösung
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Aktiviert Carbonsäuren und ermöglicht die Bindung von Proteinen an die Glasoberfläche.
unbeschichteter 8-Well-KulturobjektträgerBD FalconCase of 24: 354118
Case of 96: 354108		Wird in zellulären Experimenten mit dem Zeiss-Fluoreszenzmikroskop verwendet, wie z. B. Initial Capture and Release Quantification Experiments
24-Well-Platten mit GlasbodenMatTekP24G-0-13-FWird in zellulären Experimenten mit dem Plattenreader verwendet, z. B. Antikörper- und Zelltitrationsexperimente
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Wird verwendet, um die Reaktion zwischen EDC und DSB
abzuschrecken 4-Morpholinethansulfonsäurehydrat
(MES-Hydrat 99%)		Fisher ScientificAC172590250Wird zur Herstellung von 0,1 M MES-Puffer für die Verwendung in der EDC-Reaktion
verwendet PräzisionsofenThermo Scientific11-475-153Wird zum Aushärten der PDMS- und APTES-Schicht verwendet.
Titramax 1000 SchüttlerHeidolph13-889-420Wird verwendet, um eine gleichmäßige Verteilung von APTES auf Oberflächen zu gewährleisten.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotin-bindendes Protein. Kann Reizungen verursachen.
5 cm GlasschaleFisher Scientific08748AWird in HUVEC-Studien sowie in zukünftigen Profiling-Studien verwendet.
14 cm Petrischale mit DeckelSigma-AldrichZ717231Dient zur Aufnahme und zum Transport von Proben, die funktionalisiert
MCF7-GFP-ZellenCell BiolabsAKR211Gelagert in flüssigem Stickstoff
RAW264.7 Maus-MakrophagenATCCTIB-71Uns geschenkt vom Smith Lab an der University of Illinois. Gelagert in flüssigem Stickstoff.
TrypLELife Technologies12605036Lagerung in 100 ml bei Raumtemperatur
Dulbecco' s modifiziertes Eagle-MediumCell Media Facility an der School of Chemical Sciences an der UIUC50003PCLieferant: Corning
Nonessential Amino AcidsCell Media Facility an der School of Chemical Sciences an der UIUC25-025-CIBereits von der Einrichtung zu DMEM hinzugefügt. Lieferant: Corning.
ZellschaberFisher Scientific12-565-58Klein 23 cm 50er Pack
ZelldissoziationslösungCorningMT-25-056CIWird verwendet, um Zellen nicht-enzymatisch zu heben, für den Einsatz in Zellexperimenten
HämazytometerHausser02-671-54Wird verwendet, um Zellen für die Quantifizierung von Zelllösungen und die Effektivität der Erfassung und Freisetzung zu zählen.
BiotinAmresco58-85-5Wird verwendet, um Zellen von der Oberfläche freizusetzen.
HBSSErstellt aus RezeptN/AWird verwendet, um Zellen in Suspension am Leben zu erhalten sowie Oberflächen mit unspezifischer Bindung zu waschen. Adaptiert von Cold Spring Harbor Protocols: In 500  ml, verwenden Sie 4  g NaCl, 0,2  g KCl, 0,0402  g Na2PO4• 7H2O, 0.03  g KH2PO4 und 0,5  g Glukose. Fügen Sie DI-Wasser hinzu, um zu gelangen  500 ml, filtrieren und anschließend kühl stellen.
HLA-ABC AntikörperBioLegend 311402Antikörper zur Erfassung von MCF7gfp-Zellen
hIgG AntikörperBioLegendHP6017Antikörper zur Erfassung von MCF7gfp-Zellen
MCF7 GFP-ZellenCell BiolabsAKR-211Luminal Breast Cancer Linie, die mit grün fluoreszierendem Protein transfiziert wurde.
Verschiedene KegelThermo-Scientific15 ml: 12-565-26850/15 ml Kunststoff-Kegel zur Aufbewahrung von Lösungen und Aliquoten.
Mini-Röhrchen-Rotatoren (End-over-End-Mischer)Fisher Scientific05-450-127Wird zum Inkubieren von Antikörpern und zum Mischen anderer zellulärer Lösungen verwendet, um
Axiovert 200M (Fluoreszenzmikroskop)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M inverses Fluoreszenzmikroskop.
Zeba EntsalzungssäulenThermo-ScientificPI-87770Wird zur Aufreinigung von neu biotinylierten Antikörpern nach der Verwendung des Biotinylierungskits verwendet. Anweisungen unter: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificWird verwendet, um Antikörper zu biotinylieren, damit sie sich in die Erfassungsoberfläche integrieren können
PlateReader BioTekSynergy HTX Multimode ReaderWird verwendet, um die Fluoreszenzintensität in den Titrationsexperimenten quantitativ zu messen.
werden sollen.

Referenzen

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