Method Article

Mikrofluidik-Pufferaustausch für einen störungsfreien Micro / Nanoparticle Zelltechnik

DOI:

10.3791/54327

⸱

July 10th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University, 3NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine, Nanyang Technological University

In This Article

Summary

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Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.

Abstract

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Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (> 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während> 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 6 Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel - Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.

Introduction

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Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging - Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin - Engineering. 1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine g....

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Protocol

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1. Nanopartikel (NPs) Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen und Monozyten

  1. Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) vor der Markierung mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu ≥80% Konfluenz ergänzt. Ähnlich Kultur THP-1 - Zellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 - Medium mit 10% FBS auf eine Dichte von ~ 10 6 Zellen / ml ergänzt.
  2. Last Silica-Nanopartikel (~ 500 & mgr; m) mit Calceinfarbstoff-Lösung (200 & mgr; M) über Nacht Rühren mit. Fabrizieren PLGA-Calcein AM (CAM) mit einem Protokoll zuvor beschrieben. 22
    1. Man löst 250 ug CAM....

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Results

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Nach der Markierung NPs die Zellen mit Bio - Bildgebungsmittel beladene über Nacht, die markierten Zellen (die freie Teilchen) werden geerntet und gereinigt durch DFF Spirale Mikroeinrichtung zum freien NPs in einem einstufigen Verfahren (1A) zu entfernen. Der 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanal wird durch Engineering-Software entwickelt und mikro Su-8 verwenden. Die strukturierte Silizium - Wafer wird dann als Vorlage für die PDMS Replik Formen mit weichen Lithographi.......

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Discussion

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Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig und teuer s.......

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

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Freundliches Geschenk von THP-1-Zellen von Dr. Mark Chong und Unterstützung bei der Mikrofabrikation von Dr. Yuejun Kang und Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) wurden sehr geschätzt. Dieses Projekt wurde vom NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University) finanziert. H.W.H. wurde durch das Postdoktorandenstipendium der Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) unterstützt.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Zelllinien & Medien
Mesenchymale Stammzellen (MSCs)LonzaPT-2501
Dulbecco" s modifizierter Eagle" s Medium (DMEM)Lonza12-614F
Fötales Rinderserum (FBS)Gibco10270-106
THP-1 Monozytenzellen (THP-1)ATCCTIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MedienLonza12-702F
Reagenzien & Materialien0,01
% Poly-L-Lysin (PLL)Sigma-AldrichP8920
3 ml SpritzeBD302113Spritze 3 ml Luer-Lock
60 ml SpritzeBD309653Spritze 60 ml Luer-Lock
Rinderserumalbumin (BSA)BiowestP6154-100GR
Calcein, AM (CAM)Life TechnologiesC1430
CalceinSigma-AldrichC0875
IsopropanolFisher Chemical#P/7507/17HPLC Grade 2,5 L
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Lonza17-516Q/12
Einfache ObjektträgerFisher ScientificFIS#12-550D75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxan (PDMS)Dow CorningSYLGARD® 184
Klebeband3M2120070204418 mm x 25 m
Silica NPs (∼ 200 μ m)Sigma-Aldrich748161Porengröße 4 nm
SpritzenspitzeJEC Technology701830223 G 0,013 x 0,25
Trypsin-EDTA (0,25%)Life Technologies25200-056
Tygon SchlauchSpectra-Teknik06419-010,02 x 0,06" 100
Poly (D,L-Lactid-co-glycolid) (PLGA; 50:50)Sigma-AldrichP2191
EquipmentBiopsie-Stanze
Harris Uni-Core69036-151,50 mm
ExsikatorScienceware111/4 IN OD
High-speed KameraPhantom V9.1
Inverses Phasenkontrastmikroskop NikonEclipse Ti
Plasma ReinigerHarrick PlasmaPDC-002
SpritzenpumpeChemyxCX Fusion 200

References

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  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33(2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., ....

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Microfluidic Buffer ExchangeDean Flow FractionationNanoparticle Cell EngineeringSpiral MicrodeviceCell PurificationFlow CytometryInertial FocusingHigh Throughput ProcessingUnbound Nanoparticle RemovalSize Based Separation

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