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Die Herstellung von Inverted Kolloid-Kristallen Poly (Ethylenglycol) Scaffold: Eine dreidimensionale Zellkultur-Plattform für Leber-Tissue Engineering

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DOI:

10.3791/54331

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27. August 2016

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1School of Materials Science and Engineering, Nanyang Technological University, 2School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Manuskript präsentiert ein detailliertes Protokoll für die Herstellung einer entstehenden dreidimensionalen Hepatozytenkulturplattform, das invertierte kolloidale Kristallgerüst und die begleitenden Techniken zur Beurteilung des Verhaltens von Hepatozyten. Die größenkontrollierbaren Poren, die Interkonnektivität und die Fähigkeit, extrazelluläre Matrixproteine an das Poly(ethylenglykol) (PEG)-Gerüst zu konjugieren, verbessern die Leistung der Huh-7.5-Zelle.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit Hepatozyten Funktion in vitro zu halten, zum Zweck der Xenobiotika 'Zytotoxizität testen, Virusinfektion zu studieren und an der Leber zielgerichtete Medikamente zu entwickeln, erfordert eine Plattform in dem Zellen richtige biochemische und mechanische Signale empfangen. Recent Lebergewebe-Engineering-Systeme haben dreidimensionale (3D) Scaffolds synthetischen oder natürlichen zusammengesetzt aus Hydrogelen, verwendet werden, aufgrund ihrer hohen Wasserretention und ihre Fähigkeit, die mechanische Reize von den Zellen benötigt, bereitzustellen. Es wurde in der umgekehrten kolloidalen Kristall (ICC) Gerüst, eine neuere Entwicklung, die eine hohe räumliche Organisation, homotypische und heterotypic Zell-Interaktion erlaubt, sowie zellextrazellulären Matrix (ECM) Wechselwirkung wachsendes Interesse. Hier beschreiben wir ein Protokoll des ICC-Gerüst unter Verwendung von Poly (Ethylenglycol) diacrylat (PEGDA) und die Partikel Auslaugung Verfahren herzustellen. Kurz gesagt, wird ein Gitter aus Mikrokügelchen-Partikel hergestellt, wonach eine vorge polymer Lösung hinzugefügt wird , richtig polymerisiert, und die Partikel werden dann entfernt oder ausgewaschen, mit einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Tetrahydrofuran). Die Auflösung der Gitter ergibt ein hochporöses Gerüst mit kontrolliertem Porengrößen und interconnectivities die Medien erlauben Zellen leichter zu erreichen. Diese einzigartige Struktur erlaubt hohe Oberfläche für die Zellen der PEGDA ICC Gerüst auch mit Proteinen sowie einfache Kommunikation zwischen den Poren, und die Fähigkeit zur Beschichtung anhaften zeigt eine deutliche Wirkung auf die Zellleistung. Wir analysieren die Morphologie des Gerüsts sowie die hepatocarcinoma Zelle (Huh-7.5) Verhalten in Bezug auf die Lebensfähigkeit und Funktion, um die Wirkung von ICC-Struktur und ECM-Beschichtungen zu erkunden. Insgesamt bietet dieses Papier ein detailliertes Protokoll einer sich abzeichnenden Gerüst, das breite Anwendungen im Tissue Engineering hat, hier vor allem technische Lebergewebe.

Einleitung

Die Leber ist ein stark vaskularisierten Organ mit einer Vielzahl von Funktionen, einschließlich der Entgiftung des Blutes, Metabolismus von Xenobiotika und der Produktion von Serumproteinen. Lebergewebe hat eine komplexe dreidimensionale (3D) Mikrostruktur, bestehend aus mehreren Zelltypen, Gallenkanälchen, Sinusoiden und Zonen unterschiedlicher Biomatrix Zusammensetzung und verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen. In Anbetracht dieser aufwendigen Struktur, ist es schwierig gewesen 1 eine richtige Lebermodell in vitro zu erzeugen. Allerdings gibt es eine steigende Nachfrage nach funktionellen in vitro - Modelle humanen Hepatozyten als Plattformen für die Prüfung Medikamententoxizität 2 - Hosting und Erkrankungen der Leber 3 zu studieren.

Stromlebergewebe - Engineering - Plattformen haben die Komplexität der Leber vereinfacht eine durch Isolieren oder auf ein paar Fokussieren der Parameter des Leber, nämlich Co-Kultur von Zellen 4, biochemische Zusammensetzung der zonal Mikroumgebungen 5, Strömungsdynamik 6,7 und die Konfiguration der Biomatrix 8. Konfiguration der Biomatrix kann in Parametern wie Gerüstmaterial gebrochen werden, die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine, matrix Steifigkeit sowie das Design und die Struktur des Gerüsts. Es hat sich zu einem Anstieg der Tissue - Engineering - Studien synthetische Hydrogele unter Verwendung, insbesondere Poly (ethylenglycol) (PEG) Hydrogele 9, da die Fähigkeit zur Abstimmung der mechanischen Eigenschaften des Hydrogels, Bioaktivität und Abbaugeschwindigkeit. In Bezug auf Leberbezogene Forschung wurde das biokompatible Hydrogel für Virusinfektion Studie der Lebererkrankung 3 angewendet. Als Hepatozyten - Plattform - Design haben zahlreiche Studien Hepatozyten Sandwichkulturen 10,11 und Zellverkapselung innerhalb eines 12,13 Hydrogels verwendet , um die 3D - Umgebung und Zell-ECM und Zell-Zell - Wechselwirkung , die in vivo - Mikroumgebung nachzuahmen wesentlich sind bereitzustellen. However sind diese Plattformen nicht ein hohes Maß an Kontrolle und räumliche Organisation besitzen, was zu einer ungleichmäßigen Eigenschaften durch das Gerüst 14.

Das invertierte Kristall kolloidalen (ICC) 14 Gerüst ist eine hochorganisierte 3D - Gerüst für die Zellkultur , die zuerst in den frühen 2000er Jahren eingeführt wurde. unter Verwendung eines Kolloid-Kristall, ein geordnetes Gitter von kolloidalen Teilchen mit variablem Durchmesser der einzigartigen Struktur des Gerüsts kann dem einfachen Herstellungsprozess zurückgeführt werden. Kurz gesagt werden die Verfahren zusammenzufassen, Partikel ordentlich angeordnet und unter Verwendung von Wärme geglüht ein Gitter zu bilden. Die Auslaugung dieses Gitters, durch ein organisches Lösungsmittel, in einem polymerisierten Hydrogels Ergebnisse in hexagonal gepackte kugelförmige Hohlräume 15 mit hoher Oberfläche. Diese hochgeordnete Gerüst sowohl mit synthetischen und natürlichen Materialien , die zuvor hergestellt wurde, einschließlich , aber nicht beschränkt auf Poly (acrylamid) , 16-21, Poly (milch-co-glykolsäure) 15,22-30, Poly (ethylenglykol) 31,32, Poly (2-hydroxyethylmethacrylat) 21,33-35, 36-39 und Chitosan. ICC Gerüste aus nicht-Fouling - Materialien neigen dazu , zelluläre Sphäroiden innerhalb der Hohlräume 14,23,40 zu fördern. Mehrere Zelltypen wurden 43,44 Zellen gezeigt, erfolgreich proliferieren, differenzieren und Funktion innerhalb dieser Konfiguration einschließlich Chondrozyten 41, Stromazellen des Knochenmarks 42 und einzudämmen. Bezug Hepatozyten wurden Untersuchungen mit ICC Scaffolds aus Na 2 SiO 3 und Poly (acrylamid), aber nicht PEG durchgeführt. Mit einfachen Biokonjugation Strategien (dh Aminkopplung durch EDC / NHS), ECM - Proteine ​​konjugierten PEG-Basis Gerüste hergestellt werden können, die mehr Zellbindungsstellen nachweisen kann , eine in - vivo - ähnliche Umgebung zu sein und die Leberfunktion zu verbessern.

In diesem Manuskript und der damit verbundenen Video, wir ausführlich die Herstellung des ICC Gerüstunter Verwendung von Poly (ethylenglykol) diacrylat (PEGDA) Hydrogels und eines Polystyrolmikrokügelchens Gitter, optimiert für Hepatokarzinom (Huh-7,5) Kultur. Wir veranschaulichen die Unterschiede zwischen den im allgemeinen nicht klebende bare PEGDA ICC Gerüste und der kollagenbeschichteten PEGDA ICC Gerüsts in Bezug auf die Gerüsttopologie und Zellleistung. Die Lebensfähigkeit der Zellen und Funktion werden qualitativ und quantitativ gemessen Huh-7.5 Zellverhalten zu beurteilen.

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Protokoll

1. ICC Scaffold Fabrication (Abbildung 1)

  1. Bereiten Sie die Polystyrol (PS) Gitter (Durchmesser = 6 mm; 8-13 Schichten von Kugeln).
    1. Um die Form vorbereiten, schneiden Sie die Spitzen von 0,2 ml kochfesten Mikrozentrifugenröhrchen auf 40 & mgr; l-Ebene ab. Halten Sie die Spitze der Cut-Rohre bis 24 x 60 mm 2 Mikroskop Deckglas rutscht mit wasserfesten Kleber.
    2. Setzen Sie die PS-Kugeln (Durchmesser = 140 & mgr; m) in einer wässrigen Suspension enthalten ist, in einem 20 ml Fläschchen, Pipette vorsichtig die Wassersuspension aus, und fügen Sie 18 ml 70% Ethanollösung in das Fläschchen. Setzen Sie die Kugel Lösung in ein Ultraschallbad aggregierten Sphären zu lösen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt mehrmals, um Wasser und wasserlöslichen Komponenten vollständig zu entfernen.
    3. Je 100 ul Ethanol in die Formen.
    4. Schneiden Sie die Spitze eines 200 & mgr; l Mikropipettenspitze von 4 mm. Je 25 ul der Kugeln in die zweimal Form, um die 200 ul Mikropipette ein zu erreichen,Gesamtvolumen von 50 & mgr; l in jeder Form.
    5. Legen Sie die Formen auf einem Schüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute über Nacht.
    6. Überprüfen Sie die Anordnung der Kugeln in jeder Form unter einem optischen Mikroskop. Wenn die Kugeln nicht hexagonal geordnet sind, werden 50 & mgr; l 70% Ethanol und schütteln manuell in der Längs- und Querachsenrichtung der Anordnung zu korrigieren.
    7. Lassen Sie das Ethanol verdampfen bei Raumtemperatur (RT) für zwei Nächte. Legen Sie die Form und Bead-Komplex in einem 130 ° C Ofen für 6 Stunden die PS-Perlen auszuheilen.
  2. Vorbereiten kahl und ECM-beschichteten PEGDA Gerüste.
    1. Synthesize PEGDA Makromere mit etablierten Protokollen 45,46 für Acrylieren lineare PEG Makromeren (M w = 4,6 kDa).
    2. Vorbereitung 50% (w / v) PEGDA Lösung in entionisiertem (DI) Wasser und lassen das Makromer richtig bei 4.713 xg durch Zentrifugieren aufzulösen, bis sie vollständig gelöst ist.
      1. Für ECM konjugiert ICC Gerüste, lösen eine zusätzliche10% (w / v) Acryloyl-PEG-NHS (M w = 3.4 kDa) in der 50% igen Lösung PEGDA.
    3. Vorbereiten eines 20% (w / v) Stammlösung von 2-Hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon (PI) in 70% Ethanol.
    4. Werden 50 ul 20% (w / v) PI-Stammlösung pro 1 ml 50% (w / v) von PEGDA. Stellen Sie die benötigte Menge an PI-Stammlösung auf der Basis des Molekulargewichts von PEGDA.
    5. Vortex die Mischung in Zentrifuge für 1 min Rohr eine homogene Lösung zu erreichen.
    6. Schälen Sie die Formen aus dem Glasobjektträger (aus Schritt 1.1.7), entfernen Sie den Kleber aus den Formen, drücken Sie die Gitter aus sorgfältig mit einem Spatel und jeder von ihnen in ein 1,5-ml-Röhrchen platzieren. Pipette 300 ul der Lösung und PEGDA Zentrifuge bei 845 × g für 5 min richtige PEGDA Lösung Infiltration in das Gitter zu ermöglichen.
    7. Entfernen Sie das Gitter aus der Tube mit einer Pinzette und sorgfältig trocken Überschuss PEGDA Lösung auf Handschuhe auslöschen. Legen Sie das Gitter auf einem Paraffinfilm bedeckten Glas mit der flachen cirförmigen Oberfläche nach oben zeigt.
    8. Setzen Sie die PEGDA Lösung infiltriert Gerüst bis 365 nm ultraviolettem (UV) Licht (10,84 mW / cm 2) für 5 min eine UV - Spotlampe.
    9. Platzieren Sie PEGDA-polymerisierte Kristallgitter in neuen Fläschchen (etwa 10 Gitter pro Fläschchen) und 20 ml Tetrahydrofuran (THF). Schütteln Sie die Fläschchen auf einem Schüttler bei 300 Umdrehungen pro Minute. Ändern THF mindestens 3-mal mit einem Intervall von 1-2 Std.
      Anmerkung: THF nicht vollständig entfernen, wenn das THF, um Wechsel in Blasen aus der Eingabe der Gerüste zu verhindern, was wiederum unvollständige Entfernung von PS verursachen kann. Lassen Sie genügend Lösung, die die Gitter und fügen Sie neue THF zu decken.
      Achtung: THF ist giftig. Tragen Sie Handschuhe, einen Laborkittel und Schutzbrille tragen. Vermeiden Sie das Einatmen von unter dem Abzug arbeiten.
    10. Überprüfen Sie, ob PS-Kugeln gelöst werden durch Wasser in die verwendete THF-Lösung setzen und die Farbe der Lösung zu beobachten. Wiederholen Sie Schritt 1.2.9, wenn die PS-Kugeln sind nicht richtig gelöst.
      Hinweis: Die Farbe der Lösung ändert sich zuweiß, ob es irgendwelche verbleibenden PS-Kugeln sind.
  3. Reinigen Sie die Gerüste in der Biosicherheitswerkbank (BSC).
    1. Um die Gerüste sterilisieren, bereiten ein 50 ml Zentrifugenröhrchen mit 2 ml 70% Ethanol pro Gerüst und legen Sie die Gerüste in der Röhre mit einem Spatel. Lassen Sie die Gerüste in Ethanol für 1 Stunde einweichen. Von diesem Schritt nach vorn führen alle Verfahren in der BSC.
    2. Füllen Sie vorsichtig das Ethanol aus und ersetzen mit Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) (2 ml pro Gerüst) und Zentrifuge bei 524 × g für 3 min Blasen zu entfernen. Halten Sie es in den Kühlschrank stellen und ändern Sie die PBS ein paar Mal mit einem Intervall von 1-2 Stunden.
      1. Für Kollagen Typ Gerüste-I beschichtet, bereiten weitere 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Kollagen Typ-1-Stammlösung (1 ml pro Gerüst), übertragen Sie die sterilisierten Gerüste zu diesem Rohr mit einem Spatel und Zentrifuge bei 524 × g für 3 min mit. Schütteln Sie die Gerüste bei 400 Umdrehungen pro Minute auf einem Orbitalschüttler für 30 min und halten das Rohr in einem Kühlsystemoder über Nacht.
      2. Waschen Sie die Gerüste mit PBS zweimal vor der Verwendung durch die Gerüste in frischem PBS eingetaucht und dann das PBS abgesaugt.
        Anmerkung: Andere ECM - Proteine ​​können auch anstelle von Kollagen Typ I verwendet werden , weil die NHS - Chemie eine Amingruppe erfordert die Bindung (Figur 2) zu bilden.

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Abbildung 1. Übersicht über die ICC - Fertigung. PEG-basierte ICC Gerüste hergestellt werden , unter Verwendung von Mikrofabrikationstechniken mit und ohne ECM-Funktionalisierung. ECM-beschichtete ICC Gerüste erfordern PEG-NHS sowie PEGDA (wie in Figur detailliert 2). Die PS Gitter hat einen Durchmesser von 6 mm und eine Höhe von 8-13 bead Schichten. PS, Polystyrol; PEGDA, Poly (ethylenglykol) diacrylat; UV, UV; THF, Tetrahydrofuran; ECM, extrazellulären Matrix. Diese Zahl wurde mit freundlicher Genehmigung von Wi modifiziert und verwendet47 ley. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. ICC Strukturcharakterisierung

  1. Um ICC Struktur mit oder ohne konjugierte Proteine, verwenden Rasterelektronenmikroskopie (SEM) 47 zu analysieren.
    1. Befestigen Sie die Gerüste mit 4% Paraformaldehyd (PFA), dehydrieren sie seriell in 25, 50, 75, 95 und 100% Ethanollösungen, und lagern Sie sie bei -80 ° C, bis das Ethanol vollständig verdampft.
    2. Trockenproben in einem Gefriertrockner für 48 Stunden.
    3. Bringen Sie die Probe auf Probenhalter mit Kohlenstoffband und in einer Sputter-Beschichtungsvorrichtung.
    4. Nach dem automatischen Vakuumieren, streicht es mit einem Pt-Film von 10 nm Dicke von 20 mA für 60 Sekunden Sputtern.
    5. Bildgerüste ICC unter Verwendung SEM bei einer Spannung von 5 kV (3A, 4A).
  2. Um die Poren messen undVerbindungsdurchmesser von Hohlräumen, zu analysieren REM - Mikroaufnahmen unter Verwendung von Bildanalysesoftware 48 (zB ImageJ; 3B, C).
  3. Um das konjugierte Kollagen zum Schafott visualisieren , ohne Zellen, Tag fluoreszenz die Kollagen - Antikörper (1: 100) mit gegen die Kollagen Typ I und Bild mit der konfokalen Laser - Scanning - Mikroskopie 47 (CLSM; 4B).

3. Huh-7.5 Zellkultur und Seeding

  1. Kultur Huh-7,5 - Zellen bei einer Aussaatdichte von 2-2.5 x 10 6 Zellen / ml in 100 mm Zellkulturschalen mit 10 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 100 U / ml Penicillin-Streptomycin (Wachstumsmedium) bei 37 ° C und 5% CO 2 ändern die Medien alle drei Tage in der BSC , bis sie 75-80% Konfluenz erreicht haben.
  2. Bereiten Sie die Gerüste für Zellaussaat in der BSC.
    1. Legen Sie das scaffJährigen in einer 24-Well-Platte mit der flachen Seite nach oben.
    2. Zum Waschen das Gerüst, Pipette 2 ml PBS in jede Vertiefung ein Gerüst enthält. Saugen Sie das PBS und Pipette 2 ml frischem PBS in jede Vertiefung.
    3. Saugen Sie das PBS und Pipette 2 ml Wachstumsmedium (siehe Schritt 3.1) und lassen für 30 Minuten. Aspirieren die Medien und ermöglichen das Gerüst für 1 Stunde trocknen lassen.
  3. Abzulösen konfluenten Huh-7,5-Zellen (aus Stufe 3.1) von der Kulturplatte in der BSC die Trypsin-Verdau-Methode.
    1. Absaugen Medien von der Platte, 4 ml PBS anhaftenden Zellen zu waschen und dann PBS absaugen.
    2. Pipette 0,75-1 ml 0,25% Trypsin und in einen Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2 für 3 min.
    3. Entfernen Platte aus Inkubator und Pipette 5 ml Medium um das Trypsin Reaktion zu stoppen. Pipette Medien, abgelösten Zellen und Trypsin Gemisch in einen 15-ml-Tube.
    4. Zentrifuge bei 524 × g für 3 min, entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 5 ml Medium.
  4. Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und das Volumen der Zellsuspension berechnen , die Zellen bei Zielnummer, N 0, pro 25 & mgr; l enthält (bei ​​Standardversuch, N 0 ist 1 x 10 6 Zellen).
    Volumen der Zellsuspension = (Soll-Anzahl der Zellen) / (Konzentration der Zellsuspension)
  5. Langsam Pipettieren von 25 & mgr; l der Zellsuspension (N 0 - Zellen enthält) direkt auf jedes Gerüst (aus Schritt 3.1.4). Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator.
  6. Nach 12 Stunden, übertragen Sie die Gerüste sorgfältig mit dem Einsatz von einem Spatel in eine neue 24-Well-Platte und Pipette 2 ml Medium in jede Vertiefung. Legen Sie die 24-Well-Platte in den Inkubator.
  7. Ändern Sie die Medien alle 3 Tage oder je nachdem, wann Medien für die Protein-Sekretion Analyse gesammelt wird (siehe Schritt 5.1).

4. Zell Viability

  1. Um qualitativ die Lebensfähigkeit der Zellen zu analysieren, verwenden fluoreszierende Live / Dead Färbekits die Zellen zu färben und Bild mit CLSM.
    1. Nach Kit Anweisung, bereiten eine Lösung mit 4 uM Calcein AM und 8 uM Ethidium Homodimer-1 in den Medien (siehe Schritt 3.1.3).
      Hinweis: Optimieren Sie auf der Zellzahl abhängig. Verwenden Sie die doppelte Menge an Reagenz, wenn Zellen sich vermehren und doppelt in Anzahl (ca. 2 Mio.).
    2. In der BSC, absaugen Medien in jeder Vertiefung mit einem Gerüst (Schritt 3.7) und die Pipette 500 ul der hergestellten Lösung. Inkubieren Proben in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde.
    3. Decken Sie die Platten in Folie, die Proben vor Licht zu schützen, wenn die Platte zu entfernen aus dem Inkubator. Bild Proben unter Verwendung von CLSM49.
  2. Zur quantitativen Beurteilung der Lebensfähigkeit der Zellen, Messung der enzymatischen Aktivität (in lebenden Zellen) unter Verwendung von colorimetrischen Assays 50 (dh 2- (2-methoxy-4-nitrophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-Tetrazolium (monosodium-Salz-Reagens)).
    1. Erstellen Sie eine Standardkurve für die ICC - Plattform (dh eine grafische Darstellung der Absorption (OD) versus gegebenen Zellzahl).
      Hinweis: Die Zellaussaat nicht zu 100% effizient im Vergleich zu anderen Plattformen ist, da die Zellen durch die Hohlräume von Gerüsten passieren können.
      1. Bestimmung der Zellaussaat Zahlen, N 0 , die verwendet wird , um die Standardkurve zu machen.
        Hinweis: Wählen Sie einen Bereich, der Zellzahlen enthält, die in dem Experiment geschätzt werden. Wenn die anfängliche Zellzahl ist beispielsweise 5 x 10 5 Zellen , und es gibt eine geschätzte ~ 3 fache Erhöhung am letzten Tag des Experiments wählen 2,5 x 10 5, 5 x 10 5, 1 x 10 6 und 2 x 10 6 Zellen als N 0.
      2. Führen Zellaussaat in den ICC - Gerüste (ein N 0 pro Gerüst mit Säen Volumen von 25 & mgr; l) als 3,1-3,6 in Schritten beschrieben.
      3. Nach 6 Stunden, übertragen Sie die Gerüste an einen anderen 24-Well-Platte gut. Wählen Sie eine Zeit, die die Zellhaftung, aber nicht die Zellproliferation ermöglicht.
      4. Führen Zellzählung auf dem übertragenen ICC Gerüst.
        1. Verdünnen 10x monosodium-Salz-Reagenz (MSR) Lösung mit Medien in der BSC und Pipette 500 ul 1x MSR-Lösung in jede Vertiefung mit einem Gerüst auf 1x. Inkubieren Sie die 24-Well-Platte bei 37 ° C für 1 Stunde.
        2. Von jedem gut, dann 100 & mgr; l in einer 96-Well-Platte gut. Als Blind, Pipette 100 ml frisches 1x monosodium-Salz Reagenzlösung in verschiedenen Vertiefungen auf der 96-Well-Platte. Entfernen Sie manuell alle Blasen, die eine trockene Pipettenspitze präsentieren mit und decken die 96-Well-Platte in der Folie vor Licht zu schützen.
        3. Messen Sie die OD bei λ = 450 nm Lesung mit einem Spektralphotometer. Die leere OD von anderen Werten subtrahiert 51 die genaue OD zu finden.
      5. Zähle die Anzahl der Zellen (N L) verbleibenden in dem Bohrloch nach der Übertragung des Gerüsts (Schritt 4.2.1.3) unter Verwendung eines Hämozytometers.
        Hinweis: Verwenden Sie 300 ul Trypsin um die Zellen zu trypsinize.
      6. Berechnen Sie die tatsächliche Zellzahl, N A.
        Ist =initial - links in gut
        N A = N 0 N L
      7. Machen Standardkurve von OD in Schritt 4.2.1.4.3-Ist - Zellzahl erhalten Plotten (N A) und verwenden diese die Zellzahl in den Experimenten zu schätzen.
        Hinweis: Stellen Sie eine neue Standardkurve , wenn irgendwelche ICC - Parameter (dh Porogen Größe, Abmessungen des Gerüsts, ECM - Protein, etc.) geändert werden.

5. Zellfunktion

  1. Analysieren Proteinsekretion durch die Huh-7,5 - Zellen (dh, Albumin, Harnstoff) aus den gesammelten Medien (aus Stufe 3.7) durch enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 52.
    Anmerkung: Man verdünnt das Medium in Abhängigkeit von der Anzahl der Zellen beimpft, und die Menge der Medien gesammelt. Für 5 x 10 5 Zellen in ICC ausgesät, verwenden Sie ein ~ 1: 25 - Verhältnis, bevor es an den Antikörper-vorbeschichteten Vertiefungen einzuführen.
  2. Um qualitativ Zellfunktion zu analysieren, Immunfärbung spezifischen intrazellulären Proteinen(Dh Albumin), Enzyme (dh CYP450), Fleckenstrukturkomponenten (dh zellulären Aktin) sowie die Kerne und Bild mit CLSM 49.
    1. Absaugen Medien (aus Schritt 3.7) und Pipette 2 ml PBS, die Zell beladene ICC Gerüste zu waschen.
    2. Pipette 1 ml von 4% PFA und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur zur Fixierung.
    3. Waschen 3x mit 2 ml PBS.
    4. Permeabilisieren Membranen durch die Gerüste in 1 ml 0,1% Inkubieren 4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl-polyethylenglykol (Tensid) für 30 min.
    5. Waschen 3x mit 2 ml PBS keine undichten Proteine ​​zu entfernen.
    6. Pipette 500 ul 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 1 h bei RT inkubieren zu blockieren unspezifische Bindung.
    7. Bereiten Sie verdünnten primären Antikörper (dh Albumin, CYP450) Lösung.
      1. Pipette 500 ul 1% BSA-Lösung in einen 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 4,5 ml 0,1% ige Tensidlösung insgesamt 5 ml von 0,1% BSA-Lösung herzustellen.
      2. Pipette 98 ul der 0,1% BSA-Lösung in einem 200 & mgr; l-Mikrozentrifugenröhrchen und 2 & mgr; l des primären Antikörpers ein 01.50 herzustellen (primäre Antikörper: 0,1% BSA) primäre Antikörperlösung.
    8. Pipette 40 ul des primären Antikörperlösung auf dem Gerüst und der Abdeckung des Substrats mit Paraffinfilm. Wickeln Sie das 24-Well-Platte mit Aluminiumfolie und speichern Sie die Schale bei 4 ° C über Nacht.
    9. Waschen 3x mit 2 ml PBS und schütteln Sie die Platte sanft zwischen dem Waschen.
    10. Bereiten Sie verdünnten biotinylierten sekundären Antikörper (dh Anti-Maus - Antikörper) Stammlösung.
      1. 100 (sekundärer Antikörper: 0,1% BSA) Sekundärantikörperlösung Pipette 198 ul 0,1% BSA-Lösung und 2 ul zweite Antikörper, der eine 1 zu erzeugen.
      2. Bereiten Sie eine 0,1% ige Stammlösung von Rhodamin oder Fluorescein markiert Phalloidin (die zellulären Aktinfilamente zu färben) in der 0,1% BSA-Lösung.
      3. Je 25 ul jeder Lösung in einem Rohr und mischen well.
    11. Je 50 ul der sekundären Antikörper-Stammlösung auf dem Schafott. Decken Sie das Gerüst mit Paraffinfilm, wickeln Sie die Schale mit Aluminiumfolie und lagern bei RT für 2 Stunden.
    12. Waschen 3x mit 2 ml PBS.
    13. Je 200 ul 0,2% 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; ein Kern-Färbung) Lösung auf dem Gerüst und halten bei RT für 2-3 min. Die Platte mit Aluminiumfolie.
    14. Wasch 2x mit 2 ml PBS.
    15. Mit Hilfe einer Pipette, einen Tropfen von Eindeckmittel auf dem Substrat.
    16. Setzen Sie vorsichtig das Gerüst auf einem Glasträger und Bild mit CLSM 47.
  3. Beurteilen Sie die Genexpression durch real-time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Verwenden Sie Standard - Kits für Reverse - Transkriptase - PCR (RT-PCR) 53 und qPCR 54 gemäß den Anweisungen des Herstellers. Extrahieren der RNA aus den Zellen wie unten beschrieben.
    1. Stellen Sie das Gerüst (aus Schritt 3.7) in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Pipette 1 ml einer RNA-Extraktionslösung in das Rohr und für 5 min bei RT in einem Beschallungsgerät halten.
    3. Je 200 & mgr; l Chloroform in jedes Mikrozentrifugenröhrchen und schütteln Sie das Röhrchen kräftig in der Hand für 15-20 Sekunden. Halten Sie die Röhrchen bei RT für ~ 3 min, bis die Phasen trennen.
    4. Zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 × g, 4 ° C für 15 min und entfernen Sie die Rohre sorgfältig, so dass Phasen nicht mischen.
    5. 500-600 & mgr; l der oberen wässrigen Phase von der ersten Röhre in eine zweite Mikrozentrifugenröhrchen vorsichtig pipettiert.
    6. Fügen Sie ein äquivalentes Volumen (500-600 ul) von Isopropanol zu dieser zweiten Röhre.
    7. Drehen Sie das Röhrchen 3-5 mal und lassen Sie das Rohr bei RT stehen für 10 min.
    8. Zentrifugieren Sie die Probe bei 13.000 × g, 4 ° C für 15 min.
      1. Wenn ein Pellet am Boden des Röhrchens, Zentrifuge erneut 5 min nicht sichtbar.
        Hinweis: Wenn noch kein sichtbares Pellet ist, die Menge der RNA unzureichend sein kann.
    9. ichnvert Rohre mit der Kappe geöffnet Überstand und Pipette in DEPC Wasser in das Rohr, verdünnt in 1 ml 70% Ethanol zu verwerfen.
    10. Etwas das Röhrchen verwirbeln, so dass die Pellets von der Wand des Rohres ablöst und dann den Schlauch Luft trocknen lassen.
    11. In 50 ul DPEC Wasser in das Pellet zu resuspendieren.
    12. Halten Sie Pipettieren, bis das Pellet löst sich auf.
    13. Halten für 10 min bei 55 ° C, um die doppelsträngige RNA in einzelsträngige RNA zu denaturieren.
    14. Trommel leicht die Finger auf dem Rohrboden und dann die Röhrchen kurz zentrifugieren (7500 × g, 4 min, 4 ° C).
    15. Halten Sie die Rohre in Eis , bis die Durchführung der reversen Transkriptase 55 und real-time PCR , wie in 56 beschrieben.

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Ergebnisse

Die repräsentative Ergebnisse für die strukturelle Charakterisierung des ICC Gerüst und den Vergleich der einzelnen ICC Wirksamkeit des Gerüsts Zustand Hepatozyten in die Kultivierung sind unten dargestellt und erläutert. Die ICC Gerüstbedingungen in diesen Ergebnissen sind Kollagenbeschichtungen von 0 & mgr; g / ml (Bare), 20 & mgr; g / ml (Collagen 20), 200 & mgr; g / ml (Collagen 200) und 400 ug / ml (Collagen 400) und dem anfänglichen huh-7.5 Zellaussaat Zahl ist 1x10

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Diskussion

Tissue Engineering Gerüste entwickeln sich schnell notwendig , alle physikalischen und biochemischen Signale zu schaffen , sich zu regenerieren, zu warten oder zu reparieren Gewebe für die Anwendung von Organersatz, Krankheiten zu studieren, die Entwicklung von Medikamenten, und viele andere 57. In der Leber Tissue Engineering, verlieren primäre humane Hepatozyten schnell ihre metabolischen Funktionen einmal aus dem Körper isoliert, einen großen Bedarf an Engineering-Gerüste Schaffung und Entwicklung von Plat...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten Unterstützung von einer National Research Foundation Fellowship (NRF -NRFF2011-01) und Competitive Research Programme (NRF-CRP10-2012-07) anzuerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,2 ml PCR-RöhrchenAxygen ScientificPCR-02D-CKochbeständiger
Gorilla GlueGorilla Glue, Inc.Hängt vom Anbieter ab. Diese wurde in einem örtlichen Geschäft gekauft.
ObjektträgerVWR631-1575Maße: 24 x 60 mm2
Polystyrol-KugelnFisher ScientificTSS#4314ADurchmesser = 140 µ m; 3x104 Partikel pro Milliliter und 1,4 % Größenverteilung
EthanolMerck1,00983,1011absolut für die Analyse EMSURE; Verdünnung auf 70 % mit Milli-Q Wasser
UltraschallbadElmaS10H
GeräteofenNaberthermN7/HAusrüstung
200 & Mikro; l PipettenspitzeAxygen ScientificT-210-Y-R-S
SchaukelschüttlerVWR444-0142
Polyethylenglykol (PEG)Merck1.09727.0100Mw= 4 kDa; Durch die Acrylation von PEG-Monomeren und die Reinigung des resultierenden Niederschlags entsteht ein PEGDA-Makromer mit Mw = 4,6  kDa
ZentrifugeBeckman Coulter392932Ausrüstung
Acrylat-Poly(ethylenglykol) - SuccinimidylvaleratLaysan BioACRL-PEG-SVA-3400-1gMw = 3,4 kDa
2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenonSigma Aldrich410896
VortexVWR58816-123Ausrüstung
MikrozentrifugeEppendorf5404 000.413
ParaffinfilmParafilm M #PM996Gehalten bei 9" mit einer Intensität von 10,84  mW/cm2
Bluewave 200 UV-StrahlerBlaze Technology 120008, 122300
Tetrahydrofuran (THF)Merck107025
OrbitalschüttlerHeidolph543-123120-00-5
Kollagen Typ ISigma AldrichC3867-1VLAb Ratte 1x, ohne CaCl2 & MgCl2; pH = 7,2
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco20012-02716 % w/v aq. 10 x 10  ml
ParaformaldehydVWR43368.9MAusrüstung
Freezone 4.5 GefriertrocknerLabconco7750020Ausrüstung
Sputter CoaterJeol Ltd.JFC-1600Ausrüstung
RasterelektronenmikroskopJeol Ltd.JSM 5310
Anti-Maus-Primärantikörper gegen Kollagen Typ IAbcamab6308
Anti-Maus-Sekundärantikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21121
Platte, Gewebekultur 24 Well, flacher Boden (Nunklon) Bio-Rev PTE Ltd3820-024
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
2,5 g/l Glukose w/ L-Gln		Lonza12-604F
Fötales Rinderserum (FBS)GibcoA15-151
Penicillin-Streptomycin (P/S)Life Tchnologies15140-122 E
100 mm Corning unbehandelte KulturschalenSigma AldrichCLS430591
0,25 % Trypsin-EDTAGibco25200-056Geräte; 37  ° C, 5% Luftfeuchtigkeit
Forma Steri-Cycle CO2 InkubatorenThermofisher Scientific371
Hausser Bright-Line Phase HämazytometerThermofisher Scientific02-671-6
Lebend/Tot Lebensfähigkeit/Zytotoxizität Kit für SäugetierzellenLife TechnologiesL3224 
CCK-8 AssayDojindo LaboratoriesCK04-11Mononatriumsalz-Reagenz (MSR)
Infinite 200 PRO Mikroplatten-Reader Tecan
Albumin Human ELISA kitAbcamab108788
Triton X-100Bio-Rad#1610407
Rinderserumalbumin (BSA)Sigma-AldrichA2153-50G
Anti-Maus-Primärantikörper (gegen CYP3A4, Albumin)Santa Cruz Biotechnologysc-53850; sc-271605
DAPILife TechnologiesD3571
Alexa Fluor 555 markiert PhalloidinLife TechnologiesA34055
TrizolLife Technologies15596-026
ChloroformVWR22706.326
IsopropanolFisher Scientific67-63-0
DPEC WasserThermofisher ScientificAM9916
Nanodrop 2000c SpektralphotometerThermofisher ScientificND-2000
iScript Reverse Transkription Supermix Bio-Rad Laboratories1708840
SYBR select Master Mix für CFXLife Technology4472937
Primer (zur Auswahl)
CFX96 Real-Time System, C-1000 Touch Thermal CyclerBio Rad LaboratoriesSOFT-CFX-31-PATCH 

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Polyethylenglykol Ger stPartikelauswaschmethodeHepatozytenfunktionGer stherstellungBeschichtung mit extrazellul rer MatrixRasterelektronenmikroskopieHuh 7 5 ZellenTetrahydrofuran Auswaschung

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