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Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten

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DOI:

10.3791/54343

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8. August 2016

 ,  , 
1Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e. V., 2Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 3Department of Biomolecular Separation Engineering, Karlsruhe Institute of Technology (KIT)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Drei Wärmefällungsverfahren vorgestellt werden, die effektiv mehr als 90% der Wirtszellproteine ​​(HCP) von Tabak entfernen Extrakte vor jeder anderen Reinigungsschritt. Die Anlage HCPs aggregieren irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C.

Zusammenfassung

Pflanzen bieten nicht nur Nahrung, Futter und Rohstoffen für Menschen, sondern auch als wirtschaftliche Produktionssystem für biopharmazeutischer Proteine, wie Antikörper, Impfstoffe und Enzymen entwickelt. Diese müssen von der pflanzlichen Biomasse gereinigt werden, sondern Chromatographieschritte werden durch die hohen Konzentrationen von Wirtszellproteinen (HCPs) in Pflanzenextrakten behindert. Jedoch aggregieren meisten HCPs irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C erleichtert die anschließende Reinigung des Zielproteins. Hier werden drei Methoden vorgestellt, die Wärme Ausfällung von Tabak HCP entweder in intakten Blättern oder Extrakte zu erzielen. Das Blanchieren von intakten Blättern kann leicht in bestehende Prozesse integriert werden, aber negative Auswirkungen auf die nachfolgende Filtrationsschritte haben können. Das Gegenteil ist für die Wärme Ausfällung von Blattextrakten in einem Rührkessel wahr, der die Performance des Downstream-Aktivitäten, wenn auch mit großen Veränderungen in Prozessanlagen Design verbessern können, wie zum BeispielHomogenisator Geometrie. Schließlich wird ein Wärmetauscher-Setup auch im Hinblick auf die Wärmeübergangsbedingungen und leicht zu Skala gekennzeichnet, aber die Reinigung kann schwierig sein, und es kann einen negativen Einfluss auf die Filterkapazität sein. Das Design-of-Experimente Ansatz können die meisten relevanten Prozessparameter beeinflussen HCP Entfernung und Produktgewinnung zu identifizieren. Dies erleichtert die Anwendung der einzelnen Methoden in andere Expressionsplattformen und die Identifizierung der am besten geeignete Methode für eine gegebene Reinigungsstrategie.

Einleitung

Moderne Gesundheitssysteme zunehmend von biopharmazeutischen Proteinen 1. Herstellung dieser Proteine ​​in Pflanzen ist vorteilhaft , aufgrund der geringen pathogen Belastung und höhere Skalierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen Expressionssysteme 2-4. Allerdings ist die Downstream-Processing (DSP) von pflanzlichen Arzneimitteln kann eine Herausforderung sein, weil die störenden Extraktionsverfahren in einer hohen Partikelbelastung zur Folge haben, mit Trübungen von mehr als 5.000 nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) und Wirtszellprotein (HCP) Konzentrationen oft 95 überschreitet % [m / m] 5,6.

Aufwendige Klärungsverfahren sind erforderlich , um dispergierte Teilchen zu entfernen 7-9, aber Chromatographie Ausrüstung ist weniger teuer in bind-and-eluieren Modus während der anfänglichen Produktgewinnung zu betreiben , wenn ein früherer Schritt für die effiziente Entfernung von HCPs 10,11 ist. Dies kann entweder erreicht werden, indem das Zielproteinfällungs floccul VerwendungAmeisen 12 oder niedrigen pH 13,14 sowie durch die HCPs zu aggregieren verursacht. Die selektive Aggregation von Ribulose-1,5-bisphosphat - Carboxylase / Oxygenase (RuBisCO), das am reichlichsten vorhandene HCP in grünen Pflanzen wie Tabak (Nicotiana tabacum), kann durch Zugabe von Polyethylenglykol 15 gefördert werden, dies ist jedoch teuer und nicht mit großer -Skala Fertigung. Wärmebehandlung wurde mehr als 95% des Tabaks HCPs gezeigt zu denaturieren und auszufällen, während Protein Malaria - Impfstoffkandidaten wie Vax8 stabil bleiben in Lösung 16-18.

Drei verschiedene Ansätze wurden verwendet , um die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak HCPs zu erreichen: (i) blanchiert, das heißt das Eintauchen von intakten Blättern in heiße Flüssigkeit, (ii) ein temperaturgesteuertes Gefäß gerührt, und (iii) einen Wärmetauscher ( Abbildung 1) 16. Für intakte Blätter, Blanchieren der eine schnelle und effiziente Fällung von HCP erreicht und war auch leichtFertigungsprozesse zu skalieren und kompatibel mit bestehenden großen , die einen ersten Schritt umfassen 19 die pflanzliche Biomasse zu waschen. Im Gegensatz dazu, temperaturgeregelten Behälter sind bereits in einigen Prozessen zur Verfügung und kann für die thermische Behandlung von Pflanzen 20 extrahiert verwendet werden, aber ihre Skalierbarkeit und Energieübertragungsrate begrenzt , weil die Oberfläche-zu-Volumen - Verhältnis der Tanks schrittweise verringert wird und wird im Prozessmaßstab ungeeignet. Ein Wärmetauscher ist ein technisch gut definierte alternative Rührkessel zu erwärmenden erfordert aber eine reichliche Zufuhr von Heiz- und Kühlmedien, beispielsweise Dampf und kaltem Wasser sowie eine streng kontrollierten Volumenstrom, der zu dem Wärmetauscher Geometrie angepasst ist , und Medieneigenschaften, z. B. die spezifische Wärmekapazität. Dieser Artikel zeigt, wie alle drei Methoden können für die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak Vertreter des Gesundheitswesens und Pflanzen Vertreter des Gesundheitswesens im Allgemeinen verwendet werden. Die Errichtung und der Betrieb von each Methode in einer Laborumgebung kann verwendet werden, um ihre Eignung Prozesse für größere zu bewerten. Die große Herausforderung ist für jede Operation, die die Geräte und Bedingungen in angemessenem Umfang verkleinerten Modellen und Betriebsbedingungen zu identifizieren, während im Prozessmaßstab Herstellung verwendeten ähneln. Die hier präsentierten Daten beziehen sich auf Versuche mit transgenen Tabakpflanzen durchgeführt DsRed die Malaria - Impfstoffkandidaten Vax8 und fluoreszierende Protein exprimieren , 16, aber das Verfahren auch auf N. erfolgreich angewandt wurde benthamiana Pflanzen transient exprimieren andere biopharmazeutische Proteine ​​21.

Ein Design-of-Experiments (DoE) Ansatz 22 kann die Prozessentwicklung zu erleichtern, und Flockungsmittel 23 in diesem Zusammenhang auch von Vorteil sein kann , wie zuvor 8 beschrieben. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Bleichen, dem beheizten Behältern und Wärmetauscher ist, dass Abblassen auf intakte Blätter früh in den Prozess während der ot angewendet wirdihr sind Pflanzenextrakte (Abbildung 1) aufgebracht.

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Abb . 1: Fließschema Prozess zeigt die Umsetzung der drei verschiedene Methoden zur Tabak HCP Wärme Precipitation Das Pflanzenmaterial wird gewaschen und homogenisiert vor Klärung und Reinigung. Die Ausrüstung für die Blanchierschritt (rot) leicht an die vorhandenen Maschinen hinzugefügt werden. Im Gegensatz dazu ist ein Rührkessel (orange) mit und insbesondere einen Wärmetauscher (blau) erfordert eine oder mehrere zusätzliche Geräte und Schläuche. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

1. Pflegen Sie die Tabakpflanzen

  1. Schreibt jede Mineralwolle-Block mit 1 bis 2 l entionisiertem Wasser und anschließend mit 1 l von 0,1% [w / v] Düngemittellösung. Legen Sie einen Tabaksamen in jedem Block aus Mineralwolle und sanft bündig mit 0,25 l Düngerlösung ohne den Samen 16 Waschen entfernt.
  2. Pflegen Sie die Tabakpflanzen für 7 Wochen in einem Gewächshaus mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit, eine 16 Stunden Photoperiode (180 & mgr; mol sec - 1 m - 2; λ = 400 - 700 nm) und einem 25/22 ° C Hell / Dunkel - Temperaturregelung.
  3. Ernten Sie alle Blätter mit Ausnahme der vier cotyledon Blätter, die an der Basis der Pflanze Stiel angeordnet sind.

2. Optional: Wärmeniederschlag durch Blanchieren

Hinweis: die Schritte in den Schritten vornehmen 2,1-2,12 um Tabak HCP auszufällen von blanchiert. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 2, wenn die Vertreter des Gesundheitswesens wird gefällt werdenin einem beheizten Behälter (Abschnitt 4) oder einen Wärmetauscher (Abschnitt 5) verwenden.

  1. Nehmen Sie sich 50 g Pflanzenmaterial und Durchführung von Extraktion ohne blanchiert (Abschnitt 3). Nehmen Sie eine Probe dieses Extrakts als eine interne Kontrolle bei der anschließenden Analyse (Kapitel 7).
  2. Einrichten eines 8-L Arbeitsvolumen Wasserbad, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in einem wärmeisolierten Polystyrolschaum Eimer oder dergleichen. Montieren Sie den regelbarer Thermostat auf dem Wasserbad für nachfolgende Temperatursteuerung (Schritt 2.7).
  3. Übertragen Sie die gesamte Baugruppe auf eine magnetische Rührplatte und legen Sie eine Rührfisch im Wasserbad. Stellen Sie sicher, dass das Magnetfeld stark genug ist, den Rührstab zu drehen.
  4. Umgeben den Rührstab mit mindestens vier Stützplatten, auf denen ein Polypropylen-Korb (Schritt 2.6) wird später während des Abblassen Verfahrens platziert werden. Stellen Sie sicher , dass die Stützplatten aus einem nichtmagnetischen Material hergestellt sind (beispielsweise Edelstahllegierung , die Nickel) , und dass siehöher sind als der Rührstab (Abbildung 2).
  5. In 8 l VE-Wasser in das Wasserbad.
    HINWEIS:. Unter Verwendung eines Puffers, zB 50 mM Natriumphosphat (pH 7,5), kann die Zielproteinausbeuten verbessern , wenn niedrige pH - Fällung ist ein Problem.
  6. Legen Sie eine 23 x 23 x 23 cm Polypropylen Korb auf den Trägerplatten und stellen Sie sicher, dass der Korb nicht mit dem Rührstab Rotation nicht stört und dass es vollständig in die Flüssigkeit eingetaucht. Falls erforderlich, zusätzliches Wasser / Puffer, bis der Korb voll untergetaucht ist, dann wieder in den Korb zu entfernen.
    ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 2,12 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch isolierte Handschuhe.
  7. Verwenden Sie den einstellbaren Thermostat das Wasserbad auf 70 ° C zu bringen (oder die Temperatur für die Versuche erforderlich). Wartezeit von mindestens 15 min nachdem die gewünschte Temperatur erreicht einen therma erreicht hat, die gesamte Baugruppe zu gewährleisten,l Gleichgewicht.
  8. Bereiten Sie 150 g-Proben aus den geernteten Tabakblätter. Platzieren eines Aliquots in den Korb unter Vermeidung irreversible Kompression und Beschädigung der Blätter, beispielsweise durch Reißen. Vermeiden Sie den Korb mit Pflanzenmaterial oder einer dichten Packung des letzteren überfüllen.
  9. Vorsichtig aber schnell den Korb in die heiße Flüssigkeit tauchen und es auf den Stützplatten legen. Legen Sie einen Block aus rostfreiem Stahl auf der Oberseite des Korbes Flotation zu verhindern.
  10. Inkubieren Sie die Blätter für 5 min in der blanchiert Flüssigkeit, oder wählen Sie eine Zeit, um das experimentelle Design passend. Überwachen Sie die Flüssigkeitstemperatur während der gesamten Inkubationszeit.
  11. Restflüssigkeitsablauf aus den Blättern für 30 Sekunden Entfernen Sie vorsichtig den Korb aus dem blanchiert Flüssigkeit und lassen. Dann nehmen Sie die Pflanze aus dem Korb verlässt, übertragen sie in den Mixer geben und sofort die Extraktion (Abschnitt 3) starten.
    HINWEIS: Die Pflanzen können für längere Zeiträume nach dem Blanchieren und vor dem Beginn der th gehalten werdene Extraktion, beispielsweise mehr als 30 min auf Eis oder mehrere Wochen bei -20 ° C eingefroren wurde erfolgreich getestet. Jedoch kann die Stabilität des Produktes sinken mit Lagerzeiten zu erhöhen und damit die sofortige Verarbeitung wird empfohlen.
  12. Wiederholen Sie die Schritte 2,8-2,11 mit frischem Blattmaterial, bis die gesamte geerntete Biomasse verarbeitet wird.

3. Proteinextraktion aus Tabakblättern

ACHTUNG: Die nächsten Schritte beinhalten einen Mixer mit rotierenden Messern. Nicht in den Mixer Eimer arbeiten, während es auf dem Mixer Motor montiert ist.

  1. Legen Sie 150 g (Feuchtmasse) geerntet (Schritt 1.3) oder blanchiert (Schritt 2.11) verlässt in den Mixer geben und mit 450 ml Extraktionspuffer (50 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, 10 mM Natriumdisulfit, pH 8,0).
    HINWEIS: Die Extraktionspufferzusammensetzung hängt von dem Protein extrahiert werden und kann so eine Einstellung erfordern, beispielsweise die Verwendung eines anderen pH oder Pufferkomponente, wie Trist.
  2. Homogenisieren die Blätter für 3 x 30 sec Impulse mit 30 Sekunden Pausen durchsetzt. Stellen Sie sicher, dass die Blätter werden homogenisiert und nicht verstopfen den Mixer Eimer. Stoppen Sie den Mixer geben und heben Sie die Blätter nicht verstopft werden kann, wenn nötig, und dann weiter die Homogenisierung.
  3. Nehmen Sie eine 1 ml Probe jeder Extrakt, der für die nachfolgende Analyse (Abschnitt 7) erzeugt wird. Wenn das Pflanzenmaterial blanchiert wird, im Abschnitt weiter 6. Sonst mit Hitzefällung in einem Gefäß (Abschnitt 4) oder Wärmetauscher (Abschnitt 5) weiterhin in Abhängigkeit von der gewählten experimentellen Ansatz.

4. Optional: Wärmeniederschlag in einem Rührgefäß

HINWEIS: Führen Sie die beschriebenen Schritte in den Abschnitten 4.2 bis 4.11 um Tabak HCP in einem Rührkessel zu fällen. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 4, wenn Vertreter des Gesundheitswesens haben durch blanchiert (Abschnitt 2) ausgefällt worden oder werden ausgefällt mit einem Wärmetauscher (Abschnitt 5).

  1. Richten Sie zwei 8-L Arbeitsvolumen WasserBäder, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in wärmegedämmten Polystyrolschaum oder ähnliches. Im ersten Bad, montieren Sie die regelbarer Thermostat für die anschließende Temperaturregelung (Schritt 4.6). In der zweiten, werden 5 l entionisiertem Wasser und 2 kg Eis zur anschließenden Kühlung (Schritt 4.9).
  2. Übertragen Sie das erste Wasserbad auf eine magnetische Rührplatte und legen Sie die 2-l-Edelstahlbehälter in das Wasserbad, so dass die Mitte des Behälters zu der Mitte der Rührplatte ausgerichtet ist.
  3. Legen Sie einen magnetischen Rührstab im Edelstahlbehälter. Stellen Sie sicher, dass das Magnetfeld stark genug ist, den Rührstab zu drehen.
  4. Füllen Sie das Wasserbad mit entionisiertem Wasser auf 5 cm unterhalb der Oberkante des Edelstahlgefäßes. Dann füllen Sie das Gefäß mit Extraktionspuffer. Legen Sie einen Polystyrolschaum Deckel auf dem Behälter.
    ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 4,9 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch inslierten Handschuhe.
  5. Legen Sie ein Thermometer in den Behälter aus rostfreiem Stahl durch ein suiting Loch in der Polystyrolschaum Deckel. Stellen Sie die Wasserbadtemperatur auf 78 ° C und Inkubation für 15 min die gesamte Anordnung ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur im Behälter 70 ° C, ca. 8 ° C unter dem Sollwert des Wasserbades.
  6. Wenn die Temperatur in dem Behälter aus rostfreiem Stahl von 70 ° C abweicht, Einstellung der Temperatur des Wasserbades entsprechend und lassen das System für weitere 15 min äquilibrieren. Wiederhole diesen Schritt, bis die Temperatur im Behälter 70 ° C oder wie für das Experiment erforderlich ist, und den leeren Behälter aus rostfreiem Stahl.
  7. Gießen Sie 300 ml Extrakt (Schritt 3.2) in den Edelstahlbehälter, während es noch im Wasserbad ist und einen Timer starten. Rühren Sie den Extrakt bei 150 Umdrehungen pro Minute und Inkubation für 5 min. Stellen Sie sicher, dass der Extrakt mindestens 2 min während dieser Inkubationszeit eine Temperatur von 70 ° C erreicht.
  8. Entfernen Sie die heißen Wasserbad aus dem Magnetrührer, nehmen Sie den Behälter aus rostfreiem Stahl heraus und legen Sie es in der eiskalten Eimer. Legen Sie die letztere auf den Magnetrührer und entfernen Sie den Polystyrolschaum Deckel.
  9. Stellen Sie sicher, dass die Anlage Homogenat gut bei 150 Umdrehungen pro Minute gerührt wird, legen Sie das Thermometer im Extrakt und brüten, bis sie eine Temperatur von 20 ° C oder die Temperatur durch den Versuchsaufbau angegeben erreicht.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 4,7-4,9 für alle Teilmengen. Nehmen Sie eine 1 ml Probe gefällt jeder Wärme zu entziehen, sobald es die endgültige Temperatur erreicht hat, dann mit Abschnitt 6 fort.

5. Optional: Wärmeniederschlag in einem Wärmetauscher

HINWEIS: Führen Sie die beschriebenen Schritte in den Abschnitten 5,2-5,12 um Tabak Vertreter des Gesundheitswesens mit einem Wärmetauscher zu fällen. Überspringen Sie den gesamten Abschnitt 5, wenn Vertreter des Gesundheitswesens haben durch blanchiert (Abschnitt 2) oder in einem beheizten Behälter (Abschnitt 4) gefällt worden.

  1. Richten Sie zwei 8-L ArbeitsvolumenWasserbäder, beispielsweise 50 x 40 x 40 cm, in wärmegedämmten Polystyrolschaum Eimer oder dergleichen. Im ersten Bad, montieren Sie die regelbarer Thermostat für die nachfolgende Temperaturregelung (Schritt 5.3). In der zweiten, werden 5 l entionisiertem Wasser und 2 kg Eis zur anschließenden Kühlung (Schritt 5.10).
    ACHTUNG: Alle nachfolgenden Schritte bis zu 5,9 betreffen den Umgang mit heißer Flüssigkeit. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung einschließlich thermisch isolierte Handschuhe.
  2. Füllen Sie das erste Wasserbad mit 8 l VE-Wasser. Stellen Sie die Temperatur auf 74,5 ° C, um den Thermostat. Inkubieren Sie die Baugruppe für 15 Minuten ein thermisches Gleichgewicht zu erreichen.
  3. Bereiten Sie einen isolierten Vorratsbehälter durch einen 0,5-L-Plastikbecher in einen 1-L-Plastikbecher platzieren und die Lücken mit Watte füllen. Alternativ können Sie einen gewidmet wärmeisolierte Behälter mit einem Arbeitsvolumen von 0,5-L.
  4. Verbinden den Wärmetauscher an die peristaltische Pumpe an einem Ende und mit einem Auslass Schlauch am other Ende L / S 24 Schläuche verwenden. Legen Sie beide Schlauchenden mit einem Thermometer in dem isolierten Vorratsbehälter entlang und füllen Sie es mit 300 ml Extraktionspuffer (Abbildung 2).
  5. Setzen Sie den Wärmetauscher in das heiße Wasserbad und starten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Geschwindigkeit von 300 ml min -1. Stellen Sie sicher, dass die resultierende Temperatur im Behälter 70 ° C beträgt, etwa 4,5 ° C unter dem Sollwert des Wasserbades, nach 3 min.
  6. Wenn die Temperatur in isoliertem Behälter von 70 ° C abweicht, Einstellung der Temperatur des Wasserbades entsprechend und lassen das System für weitere 15 min äquilibrieren. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Temperatur der Extraktionspuffer steigt von Raumtemperatur bis 70 ° C in weniger als 3 min, oder gleich dem für das Experiment erforderlich ist, und leeren Sie den Edelstahlbehälter.
  7. Entsorgen Sie den Extraktionspuffer aus dem isolierten Gefäß und bereiten 300-ml-Teilmengen des Pflanzenextraktes. Füllen Sie das isolierte Behälter mit einem aliquoten.
  8. Pumpen Sie den Pflanzenextrakt (Abschnitt 3.3) durch den Wärmetauscher bei 300 ml min -1 für 5 min. Sicherzustellen, dass die Ablufttemperatur 70 ° C nach 3 min ist, oder gleich der Temperatur in der Versuchsanordnung definiert.
  9. Nach 5 Minuten, legen Sie den Wärmetauscher in den eiskalten Wasserbad während der Extrakt noch gepumpt wird. in dieser Einstellung inkubieren, bis die Temperatur genau 20 ° C erreicht hat, oder die Temperatur in dem experimentellen Design definiert.
  10. Entfernen Sie den Zulaufschlauch zur Schlauchpumpe aus dem isolierten Behälter verbunden und weiterhin das Pumpen von in dem Wärmetauscher Nachwärme präzipitiert Pflanzenextrakt zu sammeln. Dann die Pumpe an.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 5,7-5,10 für alle Teilmengen. Nehmen Sie einen 1-ml-Probe jeder Wärme gefällte Extrakt, sobald es die endgültige Temperatur erreicht hat, dann auf den Extrakten passieren zu Beutel Filtration (Abschnitt 6).
    HINWEIS: Nach einem ersten Zyklus 5,7-5,10 Schritte durch wird es keine Extraktionspuffer sein,verwerfen in Schritt 5.7.

6. Beutel Filtration des Pflanzenextrakt

  1. Halterung ein Sackfilter in die entsprechende Stützkorb, der in das Filtergehäuse eingebaut ist und stellt eine mechanische Unterstützung für das flexible Filtermaterial. Legen Sie einen 1-l - Gefäß unter dem Korb und Anwendung der Extrakt Aliquots (Abschnitt 3.3, 4.10 oder 5.11 abhängig von der gewählten Wärmebehandlung) an der Tasche mit einer Geschwindigkeit von 150 ml min -1.
  2. die Trübung einer Verdünnung von 1:10 Filtrat in Extraktionspuffer mit dem Turbidimeter Nach der Filtration messen.
  3. Nehmen Sie eine 1 ml Probe und verarbeiten , um den Beutel Filtrat wie im experimentellen Design definiert, zB Tiefenfiltration und Chromatographie 7,10.

7. Probenanalyse

  1. Messen Sie die Menge des gesamten löslichen Proteins (TSP) unter Verwendung des Bradford - Methode 24,25.
    1. In dreifacher Ausfertigung, Pipette 2,5 ul jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer96-Well-Platte. Fügen Sie acht Rinderserumalbumin (BSA) Standards in dreifacher Ausfertigung Abdeckung Bereich von 0 - 2000 & mgr; g ml -1.
    2. In 200 ul Bradford-Reagenz in jede Vertiefung und gründlich mischen durch Pipettieren auf und ab, aber sanft genug, um zu vermeiden, Blasen zu bilden.
    3. bei 22 ° C für 10 min inkubieren und die Extinktion bei 595 nm in einem Spektrophotometer gemessen werden. Berechne die TSP-Konzentration in der auf einer Standardkurve durch die BSA Referenzpunkten Proben.
  2. Quantifizierung Vax8 durch Oberflächenplasmonresonanz - Spektroskopie 26.
    1. Setup der Oberflächenplasmonresonanz-Instrument mit 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), Laufpuffer (10 mM HEPES, 3 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1500 mM Natriumchlorid, 0,05% v / v Polysorbat 20, pH 7,4) und eine carboxymethylierte Dextranoberfläche Chip in das Gerät montieren. Verwenden Sie die Hauptfunktion, das System zu spülen und eine manuelle Lauf mit einer Flussrate von 30 beginnen& mgr; l min -1 über Durchflusszellen 1 und 2. Spritzen 30 mM Chlorwasserstoff zweimal für 60 sec mit einem 60 sec eingestreuten Injektion von 25 mM Natriumhydroxid.
    2. Bereiten 200 ul einer 500 ug ml - 1 mAb 5.2 Lösung in 10 mM Natriumacetat (pH 4,0). Auftau - 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) und N - Hydroxysuccinimid (NHS) Vials und zentrifugieren bei 16.000 × g für 1 min. Mischen Sie 70 ul EDC mit 70 ul NHS und Transfer zu einem 7-mm-Kunststoffröhrchen.
    3. Aktiviere die carboxymethylierte Dextranoberfläche Oberfläche Chip durch das EDC / NHS - Gemisch über Durchflusszellen 1 und 2 für 10 min mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 10 & mgr; l min -1 Injizieren.
    4. Stellen Sie den Strömungspfad zu fließen Zelle 2 nur. Paar mAb 5.2 durch 15 min bei einer Geschwindigkeit von 10 & mgr; l min -1 injiziert wird .
    5. Schaltet den Strömungsweg zu strömen Zellen 1 und 2 und injizieren Äthanolamin für 7 min mit einer Rate von 5 & mgr; l min -1 um ​​die Oberfläche zu deaktivieren. Then injizieren 30 mM Chlorwasserstoff zweimal für 60 sec mit einem 60 sec eingestreuten Injektion von 25 mM Natriumhydroxid.
    6. Injizieren Sie die Proben und MSP1 - 19 Standards mit einer Geschwindigkeit von 30 & mgr; l min -1 für 180 sec. Stellen Sie sicher , dass die Vax8 Konzentration 50 - 1000 ng ml -1. Bereiten vorgeVerdünnungen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung mit EDTA und Polysorbat 20 (HBSEP), falls erforderlich.
    7. Subtrahieren des Spitzensignals des Strömungszelle 1 von der Strömungszelle 2 und die Differenz verwenden , um die Konzentration in Proben Vax8 Berechnung basierend auf dem Signal des MSP 1-19 Injektion mit einer bekannten Proteinkonzentration von 500 ng ml -1.
    8. Regenerieren der Chipoberfläche nach jeder Probe oder MSP 1-19 Injektion durch Behandlung mit 30 mM Chlorwasserstoff für 60 sec bei einer Strömungsrate von 30 & mgr; l min -1.
  3. QUANTIFY fluoreszenzspektrometrisch DsRed
    1. In dreifacher Ausfertigung, Pipette 50 ul jeder Probe in die einzelnen Vertiefungen einer schwarzen Halb area 96-Well-Platte. Fügen Sie sechs DsRed Standards Bereich von 0 abdeckt - 225 & mgr; g ml -1.
    2. Messen Sie die Fluoreszenz in zweifacher Ausfertigung eine 530 ± 30 nm Anregungsfilter und 590 ± 35 nm Emissionsfilter in einem Spektralphotometer. Berechne die DsRed-Konzentration in den Proben basierend auf einer Standardkurve durch die DsRed Referenzpunkte.
  4. Bestimmung der Partikelgrößenverteilungen
    1. Waschen einer Küvette mit 1 ml Isopropanol und dann mit 2 ml deionisiertem Wasser Staubteilchen zu entfernen. Pipette 850 ul der Probe in die Küvette.
    2. Setzen Sie die Küvette in das Zeta-Potential und Partikelgrößenanalyse. Öffnen Sie die "Software" und starten Sie eine manuelle Messung mit "Protein", wie das Material und "PBS" als Dispergiermittel. Wählen Sie eine Temperatur von 25 ° C und einer Gleichgewichtszeit von 180 sec.
    3. Wählen Sie die "DTS0012" Zelle und messen bei 173 ° Backscatter. Überprüfen Sie die "auto" FunktIon für die Messdauer und wählen Sie drei Messungen ohne streuten Verzögerung.
    4. Untersuchung der Verteilung Peakprofil Partikelgröße, sobald die Messung durch Auswahl der drei Messungen der Probe in dem Experiment Ansicht abgeschlossen ist. Wählen Sie die "Volume PSD" aus.

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Ergebnisse

Wärme Fällung von Tabakwirtszellproteine ​​durch blanchiert
Die blanchiert Verfahren in Abschnitt 2 beschrieben, wurde erfolgreich verwendet HCP auszufällen von Tabak mit 70 ° C verlässt, um 96 ± 1% des TSP reduziert (n = 3) während der Genesung zu 51% des Vax8 Zielproteins auf, damit seine zunehmende Reinheit von 0,1% bis 1,2% vor der chromatographischen Trennung 16. Es war auch möglich, 83 ± 1% wiederherzustellen (n = 3) des fluoreszierenden Proteins DsRed, s...

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Diskussion

Die drei Verfahren zur Hitzefällung oben beschrieben , kann effektiv Tabak HCP vor jeder chromatographischen Reinigungsschritt 16,17 entfernen. Sie ergänzen andere Strategien , die anfängliche Produktreinheit zu erhöhen zielen darauf ab , zum Beispiel Guttation 29, rhizosecretion 30 oder Zentrifugalextraktion 31,32, die alle auf sekretierte Proteine ​​beschränkt sind. Jedoch können die Wärmebasierte Verfahren nur dann sinnvoll genutzt werden, wenn das Zielprotein aufg...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Wir danken Dr. Thomas Rademacher, Alexander Boes und Veronique Beiß für die Bereitstellung der transgenen Tabaksamen und Ibrahim Al Amedi für die Kultivierung der Tabakpflanzen. Die Autoren danken Dr. Richard M. Twyman für die redaktionelle Unterstützung sowie Güven Edgü für die Bereitstellung der MSP1-19-Referenz. Diese Arbeit wurde teilweise gefördert durch den European Research Council Advanced Grant ''Future-Pharma'', Fördernummer 269110, die Fraunhofer-Zukunftsstiftung und die Internen Programme der Fraunhofer-Gesellschaft unter der Fördernummer Ziehen Sie 125-600164 an.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
2100P Tragbares TrübungsmessgerätHach4650000Trübungsmessgerät
Amin-KopplungssatzGE HealthcareBR100050 SPR-Chip-Kupplungssatz
AutoklavierkorbNalgene6917-0230Korb zum Blanchieren von Blättern
Biacore T200GE Healthcare28-9750-01SPR-Gerät
Bio Cell Analyser BCA 003 R& D mit 3DORM Sequipn.a.Partikelgrößenanalysator
MixerWaring800EGMixer
BP-410Furh2632410001Beutelfilter
Zentrifuge Zentrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Zentrifuge
Zentrifugenröhrchen 15 mlLabomedic2017106Reaktionsröhrchen
Zentrifugenröhrchen 50 ml selbststehendLabomedic1110504Reaktionsröhrchen
CM5 ChipGE HealthcareBR100012 Chip für SPR-Messungen
Küvette 10 x 10 x 45Sarsted67.754Küvette für Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoESoftware
DinatriumphosphatCarl Roth GmbH  4984.3 Medienkomponente
Ferty 2 MegaKammlott5.220072Dünger
Forma -86C ULT GefrierschrankThermoFisher88400Gefrierschrank
Gewächshausn.a.n.a.Fürden Pflanzenanbau
Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cmGrodan102446Rockwool Block
Twentey-Loop Wärmetauscher (4,8 m Länge)n.a. (Sonderanfertigung)n.a.Wärme Wärmetauscher
HEPESCarl Roth GmbH9105.3Medienkomponente
K200P 60DPall5302303Tiefenfilterschicht
KS50P 60DPallB12486Tiefenfilterschicht
Lauda E300Lauda Dr Wobser GmbHZ90010Wasserbadthermostat
L/S 24MasterflexSN-06508-24Schlauch
mAb 5.2American Type Culture CollectionHB-9148Vax8 spezifischer Antikörper
Masterflex L/SMasterflexHV-77921-75Schlauchpumpe
MiraclothLabomedic475855-1RFiltertuch
MultiLine Multi 3410 IDSWTWWTW_2020pH-Messgerät / Leitfähigkeitsmessgerät
Osram kaltweiß 36 WOsram4930440Lichtquelle
PhytotronIlka Zelln.a.Fürden Pflanzenbau
NatriumdisulfitCarl Roth GmbH8554.1Medienkomponente
NatriumchloridCarl Roth GmbHP029.2Medienkomponente
Edelstahlbehälter; 0,7 kg 2,0 L; Höhe 180 mm; Durchmesser 120 mmn.a. (Sonderanfertigung)n.a.Behälter für Wärmefällung
Synergy HTBioTekSIAFRTFluoreszenz- und spektrometrischer Plattenleser
VelaPad 60PallVP60G03KNH4Filtergehäuse
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Referenzen

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