Olfaktorischen Behaviors Assayed von Computer-Tracking Drosophila In einem Vier-Quadranten-Olfaktometer

Summary

Wir beschreiben hier eine Verhaltensaufbau- und Datenanalysemethode zur Untersuchung der Geruchsreaktionen von bis zu 100 Essigfliegen (Drosophila melanogaster). Dieses System kann mit einzelnen oder mehreren olfaktorischen Reizen verwendet werden und kann für die optogenetische Aktivierung oder Stilllegung neuronaler Untergruppen angepasst werden.

Abstract

Eine zentrale Herausforderung in der Neurobiologie ist zu verstehen , wie neuronale Schaltkreise funktionieren Verhaltensweisen geeignetes Tier zu führen. Drosophila melanogaster ein ausgezeichnetes Modellsystem für solche Untersuchungen aufgrund seiner komplexen Verhaltensweisen, leistungsstarke genetische Techniken ist, und kompakt Nervensystem. Verhaltenstests Laboratory haben lange mit Drosophila verwendet Eigenschaften der natürlichen Umgebung zu simulieren und untersuchen die neuronalen Mechanismen , die entsprechenden Verhaltensweisen zugrunde liegen (zB Phototaxis, Chemotaxis, sensorische Lernen und Gedächtnis) ^1-3. Mit der jüngsten Verfügbarkeit von großen Sammlungen von transgenen Drosophila Linien , die spezifische neuronale Untergruppen bezeichnen, haben Verhaltenstests auf eine herausragende Rolle genommen Neuronen mit Verhaltensweisen zu verknüpfen ^11.04. Vielseitig und reproduzierbare Paradigmen zusammen mit den zugrunde liegenden Berechnungsroutinen für die Datenanalyse, sind unverzichtbar für schnelle Tests von Kandidaten Fliegenlinien mit verschiedenen genotypes. Besonders nützlich sind Konfigurationen, die getestet in der Anzahl der Tiere, flexibel sind, die Dauer der Experimente und der Art der dargebotenen Stimuli. Der Test der Wahl sollte auch reproduzierbare Daten generieren, die leicht zu erwerben und zu analysieren ist. Hier stellen wir eine detaillierte Beschreibung eines Systems und eines Protokolls zur Bestimmung von Verhaltensreaktionen von Drosophila - Fliegen in einem großen Vierfeld - Arena. Das Setup wird hier Antworten von Fliegen auf einen einzelnen Geruchsreizes zu untersuchen; jedoch kann die gleiche Einstellung mehrerer olfaktorischen, optischen oder optogenetische Stimuli oder eine Kombination von diesen zu testen, modifiziert werden. Die Olfaktometer Einrichtung zeichnet die Aktivität von Fliegenpopulationen auf Gerüche reagieren, und Rechen analytischen Methoden werden angewendet, um Fliegenverhalten zu quantifizieren. Die gesammelten Daten werden analysiert, um ein schnelles Auslesen eines experimentellen Lauf zu erhalten, die für eine effiziente Datenerfassung und die Optimierung der experimentellen Bedingungen wesentlich ist.

Introduction

Die Fähigkeit zur äußeren Umgebung anzupassen und zu reagieren, ist von entscheidender Bedeutung für das Überleben aller Tiere. Ein Tier braucht, Gefahren zu vermeiden, Nahrung suchen und finden mates, und aus früheren Erfahrungen zu lernen. Sensorische Systeme funktionieren eine Vielzahl von Reizen, wie visuelle, chemische und mechanosensorischen, und senden diese Signale an das zentrale Nervensystem zu empfangen, zu interpretieren und decodiert. Das Gehirn leitet dann entsprechende motorische Verhaltensweisen auf der Grundlage der wahrgenommenen Umgebung, wie zum Beispiel Futter für Lebensmittel oder von einem Raubtier zu entkommen. Zu verstehen, wie sensorische Systeme, die die Außenwelt erkennen, und wie das Gehirn und Entscheidungen lenkt decodiert, ist eine große Herausforderung in der Neurobiologie.

Drosophila melanogaster ist ein leistungsfähiges Modellsystem für die, wie neuronale Schaltkreise Führungsverhalten zu untersuchen. Neben halten einfach und kostengünstig ist, zeigen Drosophila viele verschiedene und komplexe Verhaltensweisen schablonenhaft , und doch tun dies mit einem compact Nervensystem von etwa 100.000 Neuronen. Powerful genetische Techniken existieren , um die Drosophila - Genoms für die Manipulation und Tausende von transgenen Linien erzeugt wurden , die selektiv und reproduzierbar die gleichen Untergruppen von Neuronen ^10-13 kennzeichnen. Diese transgenen Linien kann verwendet werden, um selektiv die Aktivität der markierten Neuronen manipulieren (aktivieren oder inhibieren), und diese Manipulationen können eingesetzt werden, wie neuronale Funktionen Führungsverhalten zu untersuchen.

Mehrere Verhaltenstests wurden Verhaltensweisen für die Untersuchung verschiedener Drosophila entwickelt. Drosophila, wie viele Tiere, nutzen ihren Geruchssinn für viele Verhaltens Entscheidungen zu führen, wie Nahrung zu finden, finden Kollegen und Gefahren zu vermeiden. Der Geruchssinn ist daher eine gute sensorische System für die Untersuchung, wie äußere Reize werden erkannt und interpretiert von einem Tier das Nervensystem zu entsprechenden Entscheidungen führen. Als solches sind eine Anzahl von Assays für investiga entwickeltting Larven- und Erwachsenen olfaktorische Verhalten. Traditionell wurden durch eine zwei Wahl T-Labyrinth Paradigma getestet, olfaktorische Verhalten in Drosophila, die zur Bestimmung von angeborenen verwendet werden können und gelernt Geruchsverhalten ^3. In diesem Test werden etwa 50 Fliegen eine Wahl zwischen zwei Rohren gegeben: ein Rohr enthält den fraglichen Geruch und die andere enthält eine Steuerriechstoff (in der Regel der Geruch Lösungsmittel). Die Fliegen sind eine bestimmte Zeit gegeben, um eine Wahl zu treffen, und dann die Anzahl der Fliegen, die in den verschiedenen Kammern sind gezählt. Obwohl die T-Labyrinth ein einfacher Test für viele Experimente ist, gibt es einige Einschränkungen. Beispielsweise werden olfaktorische Verhalten an nur einem Zeitpunkt gemessen wird, und verschiedene Möglichkeiten vor diesem Zeitpunkt gemacht werden verworfen. In ähnlicher Weise werden die einzelnen Verhalten der Fliegen in der Bevölkerung vernachlässigt. Darüber hinaus erfordert die T-maze manuelles Zählen von Fliegen, die zu Fehlern führen könnte. Schließlich, da es nur zwei gemessenen Auswahl dieserreduziert die statistische Aussagekraft oft zu erkennen subtile Verhaltensänderungen erforderlich. Eine Alternative zu einer Zwei-choice T-Labyrinth ist ein Vier-Quadranten (Vier-Felder) Olfaktometer ^14-18. In diesem Test erforschen Tiere eine Arena, in der jeder der vier Ecken der Arena mit einer potentiellen Quelle von odorierten Luft gefüllt ist. Die Arena hat eine gespitzten Sternform, die Bildung von vier experimentell definierten Geruchs Quadranten zu maximieren. Wenn Geruch in einer der Ecken zugeführt wird, dann wird sie enthalten, nur in diesem einen Quadranten. Das Verhalten der Tiere können verfolgt werden, da sie den Geruch Quadranten betreten und verlassen, und leicht im Vergleich zu ihrem Verhalten in den drei Steuer Quadranten. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer Assay somit Aufzeichnungen räumliche und zeitliche Verhaltensreaktion auf die Geruchsreize über einen großen experimentellen Arena.

Der Vier-Quadranten - Olfaktometer wurde zuerst von Pettersson et al. ¹⁵ und Vet et al. ¹⁷ , um die ol zu untersuchenFabrik Verhaltensreaktionen einzelner parasitären Hautflügler. Faucher et al. ¹⁸ und Semmelhack und Wang ¹⁶ angepasst ist, die Einrichtung , die geruchlichen Reaktionen der einzelnen Drosophila zu überwachen. Der Vier-Quadranten-Olfaktometer ist ebenso empfindlich auf anziehende und abstoßende Reaktionen, so dass für eine breite Palette von Test Geruchs- und Bedingungen. Sonderanfertigungen geschrieben fly - Tracking - Software, entwickelt von Alex Katsov ¹⁹ und aktuell gehalten von Julian Brown (detailliert in Materialien), eingeführt zusätzliche Vorteile auf neuere Implementierungen des Vier-Quadranten - Olfaktometer ^14,20-23. Es ist nun möglich, 100 fliegt mit hoher räumlicher (27,5 Pixel / cm) und zeitliche (30 Bilder pro Sekunde) Auflösung gleichzeitig zu testen, die unsere verschiedenen Parameter wie Position, Geschwindigkeit und Beschleunigung von Fliegen zu jedem Zeitpunkt erlaubt das Extrahieren. Dies ermöglicht Untersuchungen über die Dynamik der Verhaltensreaktionen auf Gerüche "Fliegen ²⁰ . Es sollte jedoch angemerkt werden, dass die Identität der einzelnen Fliegen in der Bevölkerung während der gesamten Verfolgungsperiode nicht aufrecht erhalten wird. Stattdessen wird jeder Flugbahn so lange wie zwei fly Spuren aufgezeichnet nicht schneiden. An welchem ​​Punkt werden neue Spuren zugewiesen, nachdem die Fliegen auseinander. Durch die Integration von anderen Video-Capturing - Software ( die in Werkstoff - Tabelle), kann die gleiche Konfiguration flexible Tracking - Perioden und könnte verwendet werden , Fliegen für bis zu 24 Stunden zu verfolgen , indem Sie Bilder mit einer niedrigeren Bildrate nehmen. Diese Option wurde verwendet , um Eiablageverhalten von Fliegen und vergleichen ihre Körperpositionen mit Eiablage Präferenzen ¹⁴ studieren. Das Vier-Feld Olfaktometer kann auch Antworten verwendet werden , um zu studieren , um zu multimodal (zB olfaktorischen und visuellen) Stimuli oder optogenetische ⁹ oder thermogene ²¹ Stimulation mit Präsentationen von Sinnesreizen zu kombinieren. Darüber hinaus ermöglicht die hohe zeitliche Auflösung der Extraktion von Trajektorien for jedes einzelne Haar in der Ensemble-Datensatz. Daher ermöglicht das Verfahren Untersuchung in olfaktorischen geführte Bevölkerung Verhaltensweisen und auch individuelle soziale Interaktionen. Die Daten, die durch diesen Test erzeugt sind robust und hoch reproduzierbar, was die Verwendung des Vierfeld-Olfaktometer für Verhaltens Bildschirmen.

Wir beschreiben hier die Setup-Baugruppe für ein Vier-Quadranten-Olfaktometer. Wir zeigen weiterhin, seine Verwendung bei der Untersuchung von olfaktorischen Reiz in Reaktion auf Apfelessig und Abstoßung in Reaktion auf hochkonzentrierte Ethylpropionat. Schließlich beschreiben wir und Beispielcode für die Analyse der aufgezeichneten Flugverfolgungsdaten bereitzustellen.

Protocol

1. Setup-Assembly

1. Herstellung der sternförmigen Arena (19,5 cm 19,5 cm 0,7 cm) aus Polytetrafluorethylen (PTFE) gemäß der bereitgestellten Zeichnung (Ergänzende Materialien, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf). Die Arena kann durch Ausübung einer gewerblichen oder einer benutzerdefinierten Einrichtung hergestellt werden.
2. Erwerben zwei Glasplatten (20,25 cm mal 20,25 cm mit einer Dicke von 2 mm), und ein Loch bohren (~ 0,7 cm im Durchmesser) genau in der Mitte von einer der Glasplatten ein diamantbeschichteten Bohrer.
3. Herstellung eines lichtdichten Verhalten Feld für die Verhaltens Arena. Auch die Herstellung einer lichtdichten Kameragehäuse für die Infrarot-CCD-Videokamera nach den zur Verfügung gestellten Zeichnungen (Supplementary Materials, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). Die Boxen können durch eine kommerzielle oder eine benutzerdefinierte Einrichtung hergestellt werden.
4. Montieren Sie das Klimagerät an der hinteren Wand und den LED-Arrays an den Seitenwänden des Verhaltens Box. Legen Sie die Temperaturfühlerim Verhalten Feld durch ein Seitenloch für Echtzeit - Temperatur - Feedback und Anpassung (siehe Abbildungen 1 und 2 für Details).
5. Befestigen Sie den IR-Filter und Zirkularpolarisator auf die Kamera, und montieren Sie die Baugruppe in das Kameragehäuse. Das Verhalten Feld und Kamerafeld werden durch ein Glasfenster für eine bessere Temperatursteuerung des Verhaltens Kasten (siehe 1 und 2 für Details) getrennt.
6. Schließen Sie den Infrarot-CCD-Kamera mit einem Kameraadapter. Schließen Sie die Kamera-Adapter an einen USB-Konverter. Schließen Sie den USB-Konverter an einen USB-Anschluss am Computer für die Datenerfassung.
7. Installieren Sie den Treiber für den Video-Konverter auf dem Computer nach den Anweisungen des Herstellers. Optional installieren Sie eine breitere Palette von Kameraeinstellungen und Aufnahmeparameter Bildverarbeitungssoftware vom Hersteller des USB-Videowandler zur Verfügung gestellt zuzugreifen.
8. Schließen Sie das Klimagerät (durch "-Ausgabe"Auf der Rückseite der Temperatursteuerung) und der Temperatursonde (durch" Thermoelement "auf der Rückseite der Temperaturregler) auf die Temperatur-Controller. Die Sonde in das Verhalten Feld.
   Hinweis: Das Temperatursteuersystem in unserem Layout Aufrechterhaltung der Box Temperatur zwischen 18 ° C und 30 ° C fähig ist. Höhere oder niedrigere Umgebungstemperaturen für thermogene (dTrpA1, TRPM8 oder shibire ^ts) Experimente nützlich sein könnten neuronale Aktivität oder hemmen die synaptische Übertragung zu manipulieren. Bei den meisten Experimenten wird die Temperatur bei 25 ° C gehalten.
9. Montieren Sie den Geruch Abgabesystem in den folgenden Schritten (siehe Abbildung 1B für detaillierte Schaltpläne und Anschlussarmaturen):
   1. Verwenden, um die Luftdruckregler des Lufteingang von dem zentralen Luftsystem zu steuern. Schließen Sie einen Kohlenstoff Luftfilter (gefüllt mit Holzkohle) mit dem Druckregler, um die Luft aus dem zentralen ein reinigenir-System.
   2. Montieren Sie den Stromregelsystem, das aus mehreren Kanälen geregelt durch hochauflösende Messröhren.
   3. Verbinden Sie den Ausgang aus dem Kohlenstoff - Luftfilter des Durchfluss - Messrohre über einen Verteiler , wie in 1B und 2F gezeigt. Richten Sie die Ausgabe der Messröhren durch elektronisch gesteuerte 3-Wege - Magnetventile zu regulieren , wenn saubere Luft , um die Durchflussmessgeräte verlassen in den Raum ausgestoßen wird oder in diese eingegeben maßgeschneiderte Geruch Kammern ^24.
   4. Installieren Sie das Magnetventilsteuerung entsprechend der Anleitung des Herstellers.
10. Installieren Sie die elektronische Luftmengenmesser, indem sie es mit einem Datenerfassungsgerät (DAQ) und eine Stromversorgung anschließen gemäß der Anleitung des Herstellers. Installieren Sie die DAQ-Interface-Software zu gleichen Flussraten in jedem Quadranten der Arena überprüfen Sie vor jedem Experiment.

2. olfaktorischer Stimuli Vorbereitung

1. Bereiten Sie 5 Geruchant Kammern ²⁴ , die aus einem Kunststoffaußenbehälter bestehen, Glasinnenbehälter, eine maßgeschneiderte PTFE Deckeleinsatz, original Behälterdeckel mit Mittelteil entfernt und zwei Einwegventile.
   Hinweis: Ein O-Ring um den Deckel aus PTFE verwendet werden könnten Luftleck aus dem Geruchskammer während Geruchs Perfusion zu verhindern. Siehe Abbildung 1 für schematische und 2 für Fotos der Kammern.
2. Verwenden Sie vier Riechstoff Kammern für Lösungsmittelkontrollen und eine Kammer für einen Test Riechstoff. Füllen Sie die Glasbehälter mit 1000 ul Lösungsmittel bzw. Riechstoff Verdünnung (Test Riechstoffe + geeigneten Lösungsmitteln, gründlich mischen, bevor Experimente), legen Sie den Glasbehälter im Inneren der entsprechenden Kunststoffkammer (verschütten Sie nicht die Flüssigkeit in die Kunststoffkammer) und ziehen Sie den Deckel . Achten Sie darauf, immer eine saubere Kammer für den Test Riech- und Lösungsmittelkontrollen verwenden.
   Hinweis: olfaktorischen Reiz kann durch 1/16 Verdünnung von Apfelessig (5% Säure) in w ausgelöst werdenater. Im Gegensatz dazu kann olfaktorischen Abstoßungsverhalten unter Verwendung einer 10% igen Verdünnung von Ethylpropionat in Mineralöl sucht werden. Steuer Stimuli in diesen Fällen sind geruchsKammern mit reinem Mineralöl.

3. Fly Vorbereitung

1. Hinten fliegt auf Standard cornmeal Medium. Legen Sie 30 männliche und 30 weibliche Eltern Fliegen in einer Standardflasche, und lassen Sie sie legen Eier für 5 Tage bei 25 ° C oder Raumtemperatur.
2. Für jedes Experiment collect neu geschlüpften (<1 Tag alt) 25 männlich und 25 weiblich fliegt unter kurzen CO ₂ Narkose.
3. Halten Sie fliegt in einem Fläschchen mit Standard-fly Medium für 2-4 Tage.
4. 40-42 Stunden vor dem Experiment, übertragen die Fliegen ohne CO ₂ Narkose   in ein Fläschchen mit ~ 10 ml 1% iges Agarosegel. Dies wird die Fliegen halten, ohne Nahrung angefeuchtet, die ihre Bewegungsaktivität zu erhöhen hilft.
   Hinweis: Mehr als 90% der Fliegen den Hunger überleben sollte. Einige Genotypen sind weniger heilendein und kann nicht durch eine 40 Stunden Hunger machen. In diesen Fällen kürzere Zeiträume, wie beispielsweise 24-28 h sind akzeptabel, aber sollten die gleiche für alle Versuchsbedingungen und repeats gehalten werden.

4. Verhaltensreaktionen auf Attraktive und Repellent Riechstoffe

1. Schalten Sie den Temperaturregler und stellen Sie es auf 25 ° C.
2. Verbinden Sie die Riechstoffkammern (Kontroll- und Test Riechstoffe) durch den Schlauch mit dem Auslass des Riechstoffkammer einlegen und auf die Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld.
3. Überprüfen Sie die Strömungsgeschwindigkeit in jedem Quadranten durch den Luftmengenmesser verwendet, um sicherzustellen, dass die Steuer- und Riechstoffluftströme auf 100 ml / min gleich sind.
4. Reinigen Sie die PTFE-fly-Arena und die Glasplatten mit 70% Ethanol 2-3 mal und lassen Sie sie vollständig trocknen (~ 3-4 min).
5. Befestigen Sie die Glasplatten in die Arena mit Klammern.
6. Transfer fliegt ohne CO ₂ Narkose in die Arena durch das Loch in einer der Glasplatten. Achterner kann die Übertragung, legen Sie eine kreisförmige Gitter auf dem Loch entfernt entweichen zu verhindern.
   Hinweis: CO ₂ Anästhesie gezeigt wurde ²⁵ Drosophila Verhalten zu beeinflussen , und nicht innerhalb von 24 h einer Verhaltensexperiment verwendet werden soll.
7. Legen Sie die Arena mit Fliegen in die lichtdichte Kammer, schließen Sie die vier Steuerluftströme durch den Schlauch an den Push-to-Connect-Fitting auf das Verhalten Feld der Arena Ecken angebracht verbinden, schließen Sie die Tür der Kammer und warten 10- 15 Minuten, damit sich die Fliegen an die neue Umgebung gewöhnen. Wenn möglich, schalten Sie das Licht in den Raum ab, wo die Experimente durchgeführt werden, möglichst wenig Licht Leck zu vermeiden, die Vorspannung der experimentellen Ergebnis kann.
8. Führen Sie einen 5-10 min Kontrollexperiment, bei dem Fliegen zu 4 Steuerluftströmen ausgesetzt sind.
9. Analysieren Sie die Daten sofort (siehe Datenanalyse Abschnitt weiter unten), um sicherzustellen, dass die Fliegen gleichmäßig in der Arena verteilt sind, und die Art der Index in der Nähe0. Dieser Schritt ist wichtig, da es , dass es in der Arena sind keine unkontrollierten Quellen der Präferenz oder Vermeidung überprüft (zB Licht von außen, ungleichmäßige Temperaturverteilung, unebene Arena, Geruchsbelästigungen undicht, etc.). Wenn die Fliegen ungleicher verteilt sind oder ihre Bewegungsaktivität niedrig ist, verwerfen die Fliegen, reinigen Sie die Arena wieder (Schritt 4.4) und eine neue Charge von Fliegen verwenden, um das Experiment zu wiederholen.
10. Schließen Sie den Test Riechstoff Kammer mit dem Setup durch Einschalten der 3-Wege-Ventile oder Umstecken der Verbinderrohre.
11. Führen Sie Testversuch für 5-10 Minuten und die Daten analysieren , wie in Abschnitt 5 weiter unten (siehe auch Referenz 14 und Abbildung 3). Aufnahmen länger als 20 Minuten können in Dateien kommen, die rechnerisch Prozess schwierig sein kann. Wenn mehr experimentelle Aufnahmen gewünscht werden, schnell zu stoppen und das Tracking-Programm neu starten. Dies führt zu einer ~ 10 sec Lücke zwischen experimentellen Aufnahmen.
12. discard Fliegen.
13. Saubere Arena und Glasplatten mit 70% Ethanol (Schritt 4.4) und Anschlussrohre innerhalb der lichtdichten Gehäuse ersetzen. Zur Beschleunigung der Experimente kann eine neue, saubere Arena verwendet werden, und die schmutzige Arena gereinigt, während Versuchsdurchläufe durchführen.
14. Führen Sie ein anderes Experiment mit einer neuen Charge von Fliegen, falls erforderlich. Wenn mehrere Experimente am selben Tag ausgeführt werden, extreme Vorsicht walten, um sicherzustellen, dass keine Geruchsstoff in dem System von einer vorherigen Testlauf gelassen wird. Dies ist normalerweise kein Problem mit geringen Konzentrationen von Geruchsstoffen oder mit CO _2, aber zur Herstellung hochkonzentrierter Stimuli bis zu einem 24 - Stunden - Abstand zwischen Versuchsdurchläufe erforderlich sein. Darüber hinaus können alle Rohre, nachdem die Strömungsrohre ersetzt werden, wenn Riechstoff Kontamination während Kontrollversuchen vermutet wird. Lassen Sie immer die trockene Luft auf zwischen den Versuchen, um kontinuierlich das System spülen

5. Datenanalyse

Hinweis: Die vorgeschlagene fly-Tracking-Akquisition software (die in Materialien), verfolgt Fliegen in Echtzeit während der Erfassung und speichert den Zeitstempel und Koordinaten aller erkannten Fliegen im Format * .dat. Wir haben eine maßgeschneiderte Matlab Routine entwickelt, um die Daten in ein Matlab-Format zu konvertieren, und die Daten zu analysieren. Code-Beispiele sind in ergänzenden Materialien zur Verfügung gestellt, aber Einzelheiten der Umsetzung werden auf der Software zur Datenerfassung ab.

1. Legen Sie die Rohdaten. Erstellen Sie eine räumliche Maske , die die Konturen der Arena und die Maske auf die Rohdaten folgt alle Datenpunkte zu entfernen , die außerhalb der Arena fallen , wie sie repräsentieren Lärm (4A, Ergänzender - Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. m).
2. Entferne alle Datenpunkte , die mit einer Geschwindigkeit unter 0,163 cm / s für mehr bewegen als 3s, da diese Daten wahrscheinlich Rauschen sein oder erzeugt durch unbewegte Fliegen (4B, Ergänzender - Code TemporalFiltering.m).
3. Visualisieren verbleibenden DatenPunkte , indem sie aus auf einmal oder als einzelne Trajektorien (Abbildung 3, Ergänzender Kodex SingleTrajectoryViewer.m) aufgetragen ist .
   Hinweis: Die Lage der Geruchsgrenzen in der Vier-Felder von einer Reihe von Faktoren, die abhängig ist, wie die Eigenschaften jeder Geruchsstoff und die Luftströmungsraten verwendet werden. Zum Beispiel wird sehr flüchtige Riechstoffe wahrscheinlich den Geruch Quadrant vollständiger als weniger flüchtige Riechstoffe füllen. So ist es wahrscheinlich, dass jeder Geruchsstoff leicht Grenzen unterschiedlicher Geruch aufweisen kann. Die Verwendung eines Photoionisationsdetektor Geruchsgrenzen zu messen, kann problematisch sein, da es ein Vakuum verwendet Luft von einer bestimmten Stelle zu probieren, und stört so die Odormittelkonzentration an dieser Stelle. Dennoch können schnell geschätzten Grenzen Geruch auf Basis von Verhaltensdaten fliegen. So kann beispielsweise eine Geruchsgrenze basierend auf kumulierten fly Tracks in Reaktion auf verschiedene Gerüche deutlich in den Figuren 3C und 3D zu beobachten.
4. Calculate eine Attraktion Index zu bestimmen , ob Kontrollexperimenten keine Präferenz Reaktion erzeugen, und auch die Antwort auf Riechstoff zuzugreifen (oder optogenetische ⁹⁾ Reiz. Um eine Art Index (AI) zu berechnen, verwenden Sie die letzten 5 min von einer Steuer- oder Testaufzeichnung. Um ein Maß der Anziehung zu erhalten, die zwischen +1 (absolute Attraktion) und -1 (absolute Abstoßung) fällt, wird die folgende Formel verwendet, um die AI zu berechnen:
   
   wobei N _Test die Anzahl von Datenpunkten in dem Test Quadranten ist, N _Steuer die durchschnittliche Anzahl der Datenpunkte in den drei Steuer Quadranten. Diese Maßnahme ist intuitiv wie egal wäre von nahezu Null-Werte angegeben werden. Allerdings ist es nicht richtig, den Anteil der Gesamtzahl von Fliegen zeigen, die in der Riechstoff Quadranten befinden. Um diese Maßnahme zu erhalten, ein Anteil Index (PI) verwendet werden:
   wobei N - _Test ist die Zahl der Datenpunkte in dem Test Quadranten und N _total die Gesamtzahl der Datenpunkte in allen vier Quadranten. Diese Formel stellt eine Maßnahme , die zwischen 0 und 1, mit 0,25 entspricht , ohne Verhaltenspräferenz (3E und 4C Ergänzungs - Code AttractionIndex.m) fällt.
5. Führen Sie 5-10 Wiederholungen jeder Versuchsbedingung, eine neue Gruppe von Fliegen für jede Wiederholung verwenden. Vergleichen Sie die Attraktion Indizes zwischen den Bedingungen oder gegen Kontrollen durch den Kolmogorov-Smirnov nicht-parametrischer Test (Abbildung 3F, kstest2 Funktion in Matlab).

Results

Die Vier-Quadranten-Olfaktometer-Assay erfasst und analysiert die Wanderaktivitäten von vielen Fliegen über einen großen Verhaltens Raum. Geruchsstoffe können in die Luftströme eingeführt werden, die man eingeben, zwei, drei oder alle vier Quadranten. In Abwesenheit von Gerüchen, werden die Fliegen frei zwischen allen vier Quadranten bewegen. Dieses Verhalten ist von entscheidender Bedeutung zu beobachten, denn sie zeigt, dass nicht-absichtlich Vorurteile wurden nicht in den Test eingefü...

Discussion

Das Vier-Feld Olfaktometer beschrieben hier ist ein vielseitiges Verhaltenssystem zur Untersuchung der olfaktorischen Reaktionen von großen Populationen von Wildtyp und Mutante Drosophila - Fliegen. Jeder Versuch dauert ca. 1 Stunde (einschließlich Setup, Versuchsdurchläufe und Reinigung), und 4-6 Experimente können routinemäßig jeden Tag durchgeführt werden. Ein typischer Test 40-50 Fliegen für 5 Minuten unter Verwendung erzeugt etwa 450.000 Datenpunkte für die Analyse verfolgt. Die beschriebene Anordnung kann...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Luftzuführsystem  <			strong>(benötigte Menge)
Schläuche und Anschlüsse
Thermoplastische NPT(F) Verteiler	Cole-Parmer, IL, USA	R-31522-31	1
Sechskant-Reduziernippel (1/4MNPT->1/8MNPT)	McMaster-Carr, IL, USA	5232T314	1
Schlauch ( ID:1/8)	McMaster-Carr, IL, USA	5108K43	50 Ft
Rohre (ID:1/16)	McMaster-Carr, IL, USA	52355K41	100 Ft
Rohrverschraubungen mit Widerhaken	McMaster-Carr, IL, USA	5117K71	1 Packung
Rohrverschraubungen	McMaster-Carr, IL, USA	5779K102	4
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/4MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K439	1 Packung (10)
Rohrverschraubungen mit Stacheln (1/8MNPT->1/8BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K438	2 Packung (10)
Rohrverschraubungen mit Widerhaken (1/8MNPT->1/16BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5463K4	2er Pack (10)
Stachelrohrverschraubungen (1/4MNPT->1/4BF)	McMaster-Carr, IL, USA	5670K84	1
Sechskantstecker	McMaster-Carr, IL, USA	48335K152	1
Luftdruckregler, Luftfilter und Durchflussmesser			(benötigte Menge)
Labatorische Gastrocknungseinheit	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA	Modell: L68-NP-303; Lager #26840	1
Mehrrohrrahmen für 150 mm Durchflussschläuche	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-30	1
Mehrrohrrahmen für 150 mm Durchflussschläuche	Cole-Parmer, IL, USA	R03215-76	1
150 mm Durchflussschläuche	Cole-Parmer, IL, USA	R-03217-15	9
Ventilpatrone	Cole-Parmer, IL, USA	R-03218-72	9
Präzisions-Luftregler	McMaster-Carr, IL, USA	6162K13	1
Magnetventile	Automate Scientific, Berkeley, CA	02-10i	4
Magnetventilregler	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA	01-18	1
Elektronischer Durchflussmesser	Honeywell	AWM3100V	1
DATENERFASSUNG (NI USB-6009, National Instruments) und a	National Instruments	NI USB-6009	1
Netzteil	Extech Instruments	382200	1
Geruchskammern
Polypropylen Weithalsglas 2 oz; 60 ml	Nalgene	562118-0002	Pro Experiment sind mindestens 5 Dosen erforderlich, für jede Verdünnung jedes Odoriermittels ist jedoch eine separate Kammer erforderlich. Erhältlich im Container Store, Teil #635114)
Glasgeruchskammer, 0,25 oz	Sunburst-Flasche	LB4B	Mindestens 5 werden pro Experiment benötigt
"In"-Ventil für Geruchskammer	Smart Products, Inc., CA, USA	214224PB-0011S000-4074	1 dieser Teile wird pro Geruchskammer verwendet, muss aber häufig ausgetauscht werden
"Out"-Ventil für Geruchskammer	Smart Products, Inc., CA, USA	224214PB-0011S000-4074	1 dieser Teile wird pro Geruchskammer verwendet, muss aber häufig ausgetauscht werden
O-Ring	RT Dygert International, MN, USA	AS568-029 Buna-N O-R	1 Packung (100)
Fly Arena, Kamera- und Verhaltensboxen			(Benötigte Menge)
Verhalten und Kamerabox-Material	Interstate Plastics, CA, USA	ABS schwarz extrudiert (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 sq inch
Teflon für Einsätze in der Fliegenarena und Geruchskammer, 3/8" dick, 12" x 12"	McMaster-Carr, IL, USA	8545K27	1
Glasplatten, 1/8" dick, 9" x 9"	McMaster-Carr, IL, USA	8476K191	arabische Ziffer
Dual-wirkende thermoelektrische Steuerung	WAtronix Inc, CA, USA	DA12V-K-0	1
IR-LED-Array	Advanced Illumination, Rochester, VT, USA	AL4554-88024, PS24-TL	2 LED-Arrays und ein Netzteil
Klimaanlage Einheit	Melcor Store	MAA280T-12	1
Imaging System			(Benötigte Menge)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 mm F/1,4) C-Mount-Objektiv	B UND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	KP	1
CCXC-12P05N Verbindungskabel	B UND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	SOCCXC12P05N	1
DC-700 Kameraadapter	B UND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA		1
B+W 40,5 093 IR-Filter	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA	65-072442	1
TiFFEN 40,5 mm Zirkularpolarisator	Amazon		1
IR-Videokamera	Industrial Vision Source, FL, USA	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB-Videokonverter	The Imagingsource, NC, USA	DFG/USB2-It	1
iFlySpy2 (Flugverfolgungssoftware)	Julian Brown, Stanford, Kalifornien: julianrbrown@gmail.com	iFlySpy2	1
IC Capture 2.2 Software	The Imagingsource, NC, USA (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)
Sonstiges			(Benötigte Menge)
Dremel Rotationswerkzeug	Dremel, Racine, WI, USA	Dremel 8000-03	1
Diamantbeschichtete Bohrer zum Schneiden von Glas	Erhältlich von verschiedenen Anbietern; MSC industrial Supply Co, Melville, NY	90606328	1