Abstract
Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) kunnen duurzaam en volledige reacties bij belangrijke subgroepen van patiënten met metastatische melanoom bemiddelen. Grootste obstakels van deze aanpak zijn de verminderde levensvatbaarheid van de overgedragen T-cellen, veroorzaakt door telomeerverkorting, en het beperkte aantal van TIL's verkregen van patiënten. Minder gedifferentieerde T-cellen met lange telomeren zou een ideale T cel subsets voor adoptieve T-celtherapie, maar genereren van grote aantallen van deze minder gedifferentieerde T-cellen is problematisch. Deze beperking van adoptieve T cel therapie kan in theorie worden overwonnen door het gebruik van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), die zichzelf vernieuwen, te behouden pluripotentie, hebben langwerpige telomeren, en zorgen voor een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie. Hier presenteren we een protocol om iPSCs behulp van Sendai-virus vectoren voor de transductie van herprogrammering factoren in TIL te genereren. Dit protocol genererens volledig geherprogrammeerd, vector-vrije klonen. Deze TIL-afgeleide iPSCs zou kunnen minder gedifferentieerde patiënt- en tumor-specifieke T-cellen voor adoptieve T-celtherapie te genereren.
Introduction
Cellulaire herprogrammering technologie die generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) maakt het mogelijk via overexpressie van een gedefinieerde set van transcriptiefactoren houdt grote belofte in het gebied van cel-gebaseerde therapieën 1,2. Deze iPSCs vertonen transcriptie en epigenetische kenmerken en hebben de capaciteit voor zelf-vernieuwing en pluripotentie, net als embryonale stamcellen (SER) 3-5. Opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het herprogrammeren technologie de afgelopen tien jaar heeft ons toegelaten om de menselijke iPSCs zelfs van terminaal gedifferentieerde cellen, zoals T-cellen 6-8 te genereren. T-cellen afgeleide iPSCs (TiPSCs) behouden dezelfde herschikte configuratie van T-celreceptor (TCR) ketengenen de oorspronkelijke T-cellen, die regeneratie van antigenspecifieke T-cellen van TiPSCs 9-11 toelaat.
Bijna 80% van melanoom infiltrerende lymfocyten (TIL's) verkregen uit een patiënt de tumor specifieke wijze tumor-geassocieerde antigenen eennd handhaven cytotoxiciteit tegen de oorspronkelijke kankercellen 12. Met name de expressie van geprogrammeerde celdood eiwit-1 (PD-1) op TIL bleek de autologe tumor-reactieve repertoire te identificeren, inclusief gemuteerd neoantigeen-specifieke CD8 + lymfocyten 13. Adoptieve overdracht van ex vivo geëxpandeerde autologe TIL's in combinatie met preparatieve lymphodepleting regimes en systemische toediening van interleukine-2 (IL-2) kunnen aanzienlijke regressie van metastatische melanoom veroorzaken subgroepen van patiënten 14. Ondanks bemoedigende resultaten in preklinische modellen en patiënten, slechte overleving van T-cellen toegediend en het bestaan van immuunonderdrukkende paden lijken het volledige potentieel van adoptieve T-celtherapie compromitteren. Huidige klinische protocollen vereisen uitgebreide ex vivo manipulatie van autologe T-cellen om grote aantallen te verkrijgen. Dit resulteert in de vorming van terminaal gedifferentieerde T-cellen die slechte overleving, verminderde Proliferative capaciteit en hoge PD-1 15.
Deze beperking van adoptieve T-celtherapie kan theoretisch worden overwonnen door iPSCs dat een onbeperkte bron van autologe T-cellen voor immunotherapie kan bieden. We hebben onlangs gemeld herprogrammering van melanoom TIL die hoge niveaus van PD-1 van Sendaivirus (SeV) gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren, Oct3 / 4, SOX2, KLF4 en c-MYC 16. Hoewel retrovirusvectoren integratie in gastheerchromosomen eisen herprogrammering genen tot expressie, SeV vectoren zijn niet-integrerende en worden uiteindelijk verwijderd uit het cytoplasma. Herprogrammering efficiëntie is veel hoger bij een SeV systeem in vergelijking met lentivirus of retrovirus vectoren 6-8. Bovendien SeV kan herprogrammeren specifiek T-cellen in perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's), terwijl sommige iPSC klonen gegenereerd door lentivirus of retrovirus vectoren kunnen worden van nonlymphoid lijnen 6-8. Hier hebben we detailde procedures toegepast voor de isolatie en activatie van humane melanoom TIL en voor het genereren van TIL afkomstige iPSCs met een SeV herprogrammering systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Patiënten moeten geïnformeerde toestemming om deel te nemen in de Institutional Review Board en menselijke pluripotente stamcellen zijn goedgekeurd studie geven.
1. Isolatie en cultuur van de TIL
- Verkrijgen tumor materiaal dat niet nodig is voor histopathologische diagnose van de pathologie dienst / weefselverkrijging kern. Plaats 20-100 g tumor specimens in een 50 ml buis met 30 ml tumor verzamelen media (tabel 1).
- Ontleden solide, stevig, normaal weefsel van de tumor specimen van fragiel en / of bloederig necrotische gebieden met een schaar. Na het verwijderen van het necrotische weefsel Gebruik de schaar om het monster vermalen zo klein mogelijk.
- Distantiëren het gehakte preparaat in een enkele-celsuspensie met een dissociator en tumor dissociatie kit (menselijke) volgens de instructies van de fabrikant. Filter de suspensie met een 70 micrometer cel zeef die is ingesteld op een ml tube 50 en was de zeef 2 maal met2 ml RPMI 1640.
- Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 ml T-celmedium (tabel 1).
- Bereid een tweestaps gradiënt oplossing zoals Ficoll (gradiënt oplossing) in een 50 ml buis met een lagere stap van 10 ml 100% gradiënt-oplossing en een middelste stap van 30 ml 75% gradiënt oplossing verdund met fosfaat Dulbecco's gebufferde saline, geen calcium, magnesium niet (D-PBS (-)).
- Laag de celsuspensie (van stap 1,4) op het verloop oplossing (van stap 1,5). Centrifugeer bij 400 xg bij 20 ° C gedurende 45 minuten.
- Verzamel de laag met het verrijkte TIL's op het grensvlak tussen de 100% gradiënt oplossing en de 75% gradiënt-oplossing in een 50 ml buis. Verdun de laag van de oplossing met de verrijkte TIL's door toevoeging van 20-30 ml D-PBS (-).
- Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de TIL-verrijkte fractie in 10 mlT cel media.
- Cultuur de fractie (van stap 1,8) met 2 ml van T-celmedium en 6000 IU / ml recombinant humaan (rh) IL-2 in een 6-puts plaat bij 37 ° C, 5% CO2.
- Verander de helft van de media op dag 5 na het kweken initiatie en om de 2-3 dagen daarna.
- Splits de cellen in een verhouding van 1: 2 zonder trypsine na zachtjes suspenderen, verdubbeling van het aantal putten bij het bereiken van 80-90% confluentie. Voeg een half volume (1 ml) vers T-celmedium en rhIL-2 bij 6000 IU / ml.
2. Bereiding van mitomycine-C behandelde SNL Feeder Cell Plate
- Cultuur SNL voedingscellen in 10 ml SNL feeder celmedium (tabel 1) op een 0,1% gelatine beklede 10 cm schaal tot 80-90% confluentie (3-4 x 10 6 cellen) bereikt.
- Voeg 310 ul van 0,4 mg / ml mitomycine C oplossing onmiddellijk in SNL feeder celkweekschaal en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2 uur en 15 minuten. Aspireren de media eennd was de cellen tweemaal met 5 ml D-PBS (-).
- Voeg 0,5 ml 0,25% trypsine / 1 mM EDTA en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut om de cellen dissociëren. Voeg 4,5 ml van SNL feeder cel media te neutraliseren en resuspendeer de cellen in een enkele ophanging.
- Breng de cellen in een 15 ml buis en centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten. Zuig het medium en de cellen te tellen met een hemocytometer na opnieuw suspenderen in 10 ml SNL feeder celmedium.
- Plaat 1,5 x 10 6 cellen per putje van de SNL voedingscellen op een 10 cm schaal en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2. Gebruik de SNL feeder cellen binnen 3 dagen.
3. Productie van iPSC De Sendai virus (SeV) Vector
- Oogst de TIL's (uit stap 1,11) en activeer 5 x 10 5 cellen of TIL met plaatgebonden muis-anti-humaan CD3 (1 ug / ml) en oplosbare muis-anti-humaan CD28 (5 ug / ml), waarbij rhIL-2 (6000 IU / ml) in 2 ml van T cel media in een 6-well plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 dagen.
- Oogst de TIL's (van stap 3,1) in een 15 ml buis met behulp van een pipet en tel het aantal cellen met een hemocytometer.
- Reactiveren 1 x 10 5 cellen of TIL met plaatgebonden muis-anti-humaan CD3 (1 ug / ml) en oplosbare muis-anti-humaan CD28 (5 ug / ml), waarbij rhIL-2 (60 IU / ml) in 500 gl herprogrammering media (tabel 1) per putje in een 24-puts plaat bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. Bereid 3 putten voor SeV infectie: Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC (1 ook); SeV infectie (GFP: green fluorescent protein) (1 ook); en celgetal (1 ook).
- Na 24 uur (in stap 3,3), tel het aantal cellen met een hemocytometer en het bepalen van het volume van elk virus voor diverse (3-20) multipliciteit van infectie (MOI). Verwijder een set van Sendai virus vector buizen uit de -80 ° C opslag. Ontdooi de SeV vectoren snel in een waterbad (37 ° C) en leg ze op ijs.
Volume van virus (pl)= MOI (CIU / cel) x aantal cellen / titer van het virus (CIU / ml) x 10-3 (pl / ml) - Voeg de berekende hoeveelheden van elk van de vier Sendai-virusvector buizen die afzonderlijk uitgevoerde Oct3 / 4, SOX2, KLF4 en c-MYC door toevoeging van een mengsel van SeV vectoren 10-20 MOI in de media, inclusief geactiveerde TIL.
- Om de transductie efficiëntie te bepalen, voeg de berekende volumes van SeV-GFP in een put van geactiveerde TIL.
- Zet de schaal (van stap 3,5 en 3,6 stap) in de incubator bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 24 uur. Na 24 uur, de mogelijke infectie-efficiëntie met behulp TIL geïnfecteerd met SeV-GFP onder fluorescentiemicroscopie.
- Verzamel de cellen (uit stap 3.5) in een 15 ml buis. Centrifugeer bij 200 xg bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 0,5 ml medium met hESC Primate ES celmedium en basische fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng / ml).
- Breng de suspensie in een 10 cm gerecht dat contains mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen in 10 ml van hESC media. Verander de hESC media om de andere dag, totdat de kolonies worden geteeld.
- Rond dag 18 tot 21, verwijder de SNL feeder cellen rond de kolonies onder een microscoop met een 10-ul tip in de schone bench.
- Schraap de kolonies met een 10-ul tip en overbrengen via een 200-gl tip in 100 pl iPSC medium per putje van een 96 putjes weefselkweekplaat. Pipet op en neer 2-3 keer naar de koloniën in kleine groepjes breken met een gemiddelde grootte van 50-100 urn.
- Breng de kleine klonten in 6-well weefselkweek platen met mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen (van stap 2) in 2 ml per putje iPSC media met basische fibroblast groeifactor (bFGF, 4 ng / ml). Verander iPSCs media elke dag.
- Breng de iPSCs tot 6-putjes weefselkweekplaten met verse mitomycine-C behandelde SNL voedingscellen met 1 mg / ml collagenase IV elke 5-6 dagen. Bereid 2 waterputten per platen van elke kloon voor IMMUNostaining.
- Bepaal de volledige herprogrammering van elke kloon door immunohistochemische kleuring van pluripotentie markers (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, en Oct3 / 4) 1.
LET OP: Voor een verdere evaluatie van pluripotentie potentieel, bevestigen dat volledig geherprogrammeerd iPSC lijnen in drie kiem lagen kunnen onderscheiden door een embryoid formatie lichaam en differentiatie assay of een teratoom formatie assay 16. - Controleer of volledig geherprogrammeerd iPSC lijnen tonen een normaal karyotype door cytogenetische analyse.
- Voor teratoma formatie injecteren ongedifferentieerd TIL afkomstige iPSC (1 x 10 6) suspensie in 100 pi DMEM dat 10% FCS in het subcutane weefsel van 6-8 weken oude vrouwelijke NOD / SCID-muizen. Vlek teratoma secties met hematoxyline en eosine.
4. immunofluorescentiekleuring van iPSCs voor SSEA3, SSEA4, TRA1-60 en TRA1-81
- Wash iPSCs met 1 ml PBS en bevestig de iPSCs met 1 ml van 4% per jaarraformaldehyde oplossing gedurende 10 min. Verwijder de 4% paraformaldehyde oplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 keer.
LET OP: Wees voorzichtig met paraformaldehyde, want het is giftig. - Voorbehandelen iPSCs met blokkerende buffer (Tabel 1) gedurende 30 min. Ondertussen, verdunnen de primaire antilichamen (rat anti-humaan SSEA3, muis anti-humaan SSEA4, muis anti-humaan TRA1-60 en muis anti-humaan TRA1-81) 1:50 in 1,5% geit serum verdund met PBS en TritonX -100 (totaal volume: 1 ml).
- Verwijder de blokkerende buffer (Tabel 1). Voeg de verdunde primaire antilichaamoplossing en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Ondertussen verdunnen het secundaire antilichaam (anti-muizen IgG en IgM of anti-rat IgM) 1:50 in 1,5% geit serum oplossing.
- Verwijder de verdunde primaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Voeg de verdunde secundaire antilichaamoplossing en incubeer gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in een donkere kamer. Verwijder de verdunde secundaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Let op de iPSCs met immunofluorescentie microscopie.
5. immunofluorescentiekleuring van iPSCs voor Oct3 / 4
- IPSCs wassen met 1 ml PBS en bevestig de iPSCs met 1 ml 4% paraformaldehyde gedurende 10 min. Verwijder de 4% paraformaldehyde oplossing en was de iPSCs met PBS 3 keer.
- Voeg permeabilisatie buffer (Tabel 1) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Verwijder de permeabilisatie buffer en voeg blokkerende buffer (Tabel 1).
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Ondertussen, verdun het primaire antilichaam (muis anti-humaan Oct3 / 4) 1:50 in blokkeerbuffer.
- Voeg de verdunde primaire antilichaamoplossing en incuberen bij 4 ° C overnacht.
- Verwijder de verdunde primaire antilichaamoplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Ondertussen, diluit het secundaire antilichaam (geit anti-muis IgG / IgM) 1: 100 in blokkerende buffer.
- Voeg de verdunde secundaire antilichaamoplossing en incubeer bij kamertemperatuur in een donkere kamer gedurende 45 minuten.
- Verwijder de verdunde secundaire oplossing en was de iPSCs met 1 ml PBS 3 maal, telkens 5 min. Let op de iPSCs onder immunofluorescentie microscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont een overzicht van de procedure dat de aanvankelijke groei van melanoom TIL met rhIL-2, gevolgd door activatie met anti-CD3 / CD28 en gentransfer van Oct3 / 4, KLF4, SOX2, en c-MYC om TIL impliceert voor het genereren van iPSCs. Meestal TIL op de cultuur met rhIL-2 start om bolletjes te vormen 21-28 dagen na het begin van de cultuur. Op dit moment TIL gereed zijn geactiveerd met anti-CD3 / CD28. Figuur 2A toont TIL op kweek met rhIL-2 op dag 21, die wordt geactiveerd met anti-CD3 / CD28. Figuur 2B toont GFP introductie van Sendaivirus (SeV) getransfecteerd bij 20 MOI. Figuur 2C toont een typische pluripotente kloon op SNL voedingscellen dat verschijnt 18-21 dagen na SeV infectie. Figuur 2D toont de opgewekte TIL afkomstige iPSCs een normaal karyotype. Figuur 3 toont immunofluorescentiekleuring p bevestigenluripotency markerexpressie op iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60 en Oct3 / 4). Figuur 4 toont dat iPSCs afgeleid van melanoom TIL kunnen teratoma dat verschillende cellen bevatten drie kiemlagen vormen (neuraal weefsel, respiratoire epitheel, en kraakbeen). Figuur 5 laat zien dat gegenereerd TIL-afgeleide iPSCs behouden TCR herschikkingen.
Figuur 1. Schematische weergave van de productie van iPSCs van melanoom TIL Het protocol omvat drie stappen: het kweken van TIL's met IL-2, T-celactivering met anti-CD3 / CD28 en cel herprogrammering van de Sendai virus (SeV) vector encoding Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Genereren van iPSCs van melanoom TIL (A) Een afbeelding van de morfologie van de TIL's in rhIL-2 toen ze begonnen om 2-3 weken uit te breiden na het begin van de cultuur. (B) beelden die morfologie en GFP expressie van TIL één dag na SeV infectie. (C) Een normale ESC-achtige iPSC kolonie op dag 21 na SeV infectie. De Schaal bars = 200 urn. (D) Cytogenetische analyse twintig G-banded metafase cellen van een van de iPSCs afgeleid van melanoom TIL. Figuur (D) is een bewerking van Saito et al 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg "/>
Figuur 3:. Immunofluorescentie kleuring met stamcellen pluripotent markers De immunofluorescentie assay toont aan dat de TIL-afgeleide iPSCs van twee patiënten zijn positief voor SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, en Oct3 / 4. De Schaal bars = 100 μm.The cijfer is aangepast van Saito et al 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Bevestiging van pluripotentie voor iPSC met teratoom vorming Hematoxylin- en eosine gekleurde secties representatieve teratoom afgeleid van de TIL afkomstige iPSCs kloon (6 weken na de injectie in NOD / SCID-muizen) getoond. Figuur aangepast van Saito et al 16..com / files / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5:. Een grote verscheidenheid van TCR-β gen arrangement patronen in TIL-iPSCs TCR-β genherschikking in TIL-iPSCs geïdentificeerd door capillaire elektroforese. De groene lijn is afgeleid van de band voor de Jβ1 gen, en de blauwe lijn is afgeleid van de band voor de Jβ2 gen. Het cijfer is een bewerking van Saito et al 16. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Samenstelling van de T-cel, herprogrammering, tumor verzamelen, SNL feeder cel en iPSC media, en de permeabilisatie en het blokkeren van buffers. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we aangetoond een protocol voor het herprogrammeren van melanoom TIL te iPSCs door SeV gemedieerde transductie van de vier transcriptiefactoren Oct3 / 4, SOX2, KLF4, en c-MYC. Deze benadering, met een SeV systeem om T-cellen te herprogrammeren, biedt het voordeel van een niet-integratiemethode 7.
Een eerdere studie toonde aan dat SeV herprogrammering systeem is zeer efficiënt en betrouwbaar niet alleen fibroblasten maar ook perifeer bloed T-cellen 7,17 herprogrammeren. Bovendien hebben we onlangs aangetoond dat melanoom TIL's die meer gedifferentieerd en expressie hogere remmende receptoren zoals PD-1 dan perifeer bloed T-cellen kunnen ook worden geprogrammeerd via SeV vectoren 16. Timing van de stimulatie met anti-CD3 / CD28 en infectie met SeV vector was kritisch in herprogrammering TIL. Perifere bloed T-cellen kan worden gestimuleerd met anti-CD3 en IL-2 te herprogrammeren onmiddellijk na de oogst van het onderwerp 7, while TIL nodig gekweekt gedurende 3-4 weken met IL-2 voor stimulatie.
Hoewel meer dan 99% van de TIL's werden CD8 T cellen na 3-4 weken kweken met IL-2 en activatie met anti-CD3 / CD28 16, raadzaam analyse van TCR omlegging in iPSCs bevestigen dat gegenereerd iPSCs bent TIL (figuur 5). Van de nota, eerdere studies waaronder de onze aangegeven dat elke iPSCs gegenereerd met behulp van SeV uit perifere bloed mononucleaire cellen of TIL had TCR omlegging 7,16.
Hoewel generatie iPSCs van melanoom TIL haalbaar was, vonden we dat de herprogrammering efficiëntie van melanoom TIL lager (0,01-0,05%) 16 dan die van perifeer bloed T-cellen (0,1%) 7. De reden hiervoor is onduidelijk, maar het kan worden geassocieerd met de hogere expressie van remmende receptoren of groter aantal gedifferentieerde T-cel subsets in TIL 13,16. Recente aanzienlijke vooruitgangvoor herprogrammering technologie kan de herprogrammering efficiëntie voor de opwekking van TIL-iPSCs verbeteren. De tweede generatie SeV vector, TS12KOS, bleek hogere efficiëntie van iPSC generatie dan de conventionele SeV vector gebruikt in de eerdere studie 18,19 hebben.
Hoewel de winning van menselijke iPSCs met SeV herprogrammering haalbaar is, zijn er verschillende beperkingen beschouwd in dit protocol. We maken gebruik van foetaal runderserum tijdens SeV infectie bij dit protocol. We vonden dat de herprogrammering efficiëntie van melanoom TIL was significant lager bij gebruik van media met humaan serum tijdens SeV infectie opzichte van een met foetaal runderserum, ondanks vergelijkbare proliferatie van TIL. We gebruiken ook een muis feeder laag voor iPSC productie en onderhoud, maar een bepaalde feeder-vrij en xeno-free-systeem kan worden alternatieve methoden in de toekomst studies.
Het duurt ongeveer twee maanden vanaf het moment van de tumor oogst iPSCs genererenvan melanoom TIL. Bovendien zou het nog eens 1-2 maanden om transgene vrij iPSCs verkrijgen. Dit kan worden verkort door het gebruik van het nieuwe type SeV vector, TS12KOS, die een efficiëntere eliminatie virus 19 is getoond.
Concluderend, het genereren van humane melanoom iPSCs van TIL haalbaar. Het huidige protocol kan een belangrijke stap voor het genereren van een oneindig aantal tumor-specifieke T-cellen voor adoptieve T-celtherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
