Abstract
Adoptiv overføring av ex vivo utvidet autologe tumor infiltrerende lymfocytter (Tīlss) kan megle holdbare og komplett respons i betydelige undergrupper av pasienter med metastatisk melanom. Store hindringer ved denne tilnærmingen er den redusert levedyktighet av overførte T-celler, forårsaket av telomerer forkortes, og det begrensede antall Tīls oppnådd fra pasienter. Mindre differensierte T-celler med lang telomerer ville være et ideelt T-celleundersett for adoptiv T-celleterapi, men genererer store antall av disse mindre differensierte T-celler er problematisk. Denne begrensningen av adoptiv T celleterapi kan teoretisk overvinnes ved hjelp induserte pluripotente stamceller (iPSCs) som selv fornye, vedlikeholde pluripotency, har langstrakte telomerer, og gir en ubegrenset kilde til autologe T-celler for immunterapi. Her presenterer vi en protokoll for å generere iPSCs bruker Sendai virusvektorer for transduksjon av omprogrammering faktorer i Tīlss. Denne protokollen generereer fullt omprogrammeres, vektorfrie kloner. Disse TIL-avledet iPSCs kan være i stand til å generere mindre differensiert pasient og tumor-spesifikke T-celler for adoptiv T celleterapi.
Introduction
Cellular omprogrammering teknologi som tillater generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCs) via overekspresjon av et definert sett av transkripsjonsfaktorer har store løftet innen celle-baserte terapier 1,2. Disse iPSCs vise transkripsjons og epigenetiske funksjoner og har kapasitet for selvfornyelse og pluripotency, på samme måte som embryonale stamceller (ESCs) 3-5. Bemerkelsesverdig framgangen i omprogrammering teknologi i løpet av det siste tiåret har tillatt oss å generere menneskelige iPSCs selv fra terminalt differensierte celler, slik som T-celler 6-8. T-celle-avledet iPSCs (TiPSCs) opprettholde den samme omar konfigurasjon av T-cellereseptoren (TCR) kjedegener som de opprinnelige T-celler, noe som tillater regenerering av antigen-spesifikke T-celler fra TiPSCs 9-11.
Nesten 80% av melanom-infiltrerende lymfocytter (Tīlss) erholdt fra en pasients tumor spesifikt å gjenkjenne tumorassosierte antigener etnd opprett cytotoksisitet mot de opprinnelige kreftcellene 12. Spesielt, ble ekspresjonen av programmert celledød protein-1 (PD-1) på Tīlss funnet å identifisere den autologe tumor reaktive repertoar, inkludert mutert neoantigen-spesifikke CD8 + lymfocytter 13. Adoptiv overføring av ex-vivo ekspanderte autologe Tīlss i kombinasjon med preparative lymphodepleting regimer og systemisk administrering av interleukin-2 (IL-2) kan føre til betydelig regresjon av metastatisk melanom i undergrupper av pasienter 14. Til tross for oppmuntrende resultater i prekliniske modeller og hos pasienter, dårlig overlevelse av infundert T-celler og eksistensen av immunsuppressive veier ut til å svekke det fulle potensialet av adoptiv T celleterapi. Nåværende kliniske protokoller kreve omfattende ex vivo manipulering av autologe T-celler for å oppnå store tall. Dette resulterer i genereringen av terminalt differensierte T-celler som har dårlig overlevelse, redusert Proliferative kapasitet, og høye nivåer av PD-1 15.
Denne begrensningen av adoptiv T celleterapi kan teoretisk overvinnes ved hjelp av iPSCs som kan gi en ubegrenset kilde til autologe T-celler for immunterapi. Vi har nylig rapportert at omprogrammering av melanom Tīlss som uttrykker høye nivåer av PD-1 ved Sendai-virus (SeV) -mediert transduksjon av de fire transkripsjonsfaktorer, OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC 16. Mens retrovirusvektorer krever integrering i verts kromosomer å uttrykke omprogrammering gener, Sev vektorer er ikke-integrering og blir til slutt eliminert fra cytoplasma. Omprogrammering effektivitet er mye høyere med en SeV system sammenlignet med lentivirus eller retrovirusvektorer 6-8. Videre kan SeV spesifikt omprogrammere T-celler i perifere mononukleære blodceller (PBMC), mens noen IPSC kloner generert av lentivirus eller retrovirusvektorer kan være av ikke-lymfoide linjene 6-8. Her har vi detaljfremgangsmåten implementert for isolering og aktiveringen av human melanoma Tīls og for generering av TIL-avledet iPSCs ved hjelp av et SeV omprogrammering system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Pasienter bør gi informert samtykke til å delta i Institutional Review Board and Human pluripotent Stem Cell Komiteen godkjente studien.
1. Isolering og kultur Tīlss
- Skaff svulst materiale som ikke er nødvendig for histopatologisk diagnose fra patologi tjenesten / vev anskaffelser kjerne. Plasser 20-100 g av tumorprøver i et 50 ml rør med 30 ml tumor samle media (tabell 1).
- Dissekere solid, fast, normalt vev av tumor prøven fra skjøre og / eller blodig nekrotiske områder ved hjelp av saks. Etter fjerning av nekrotisk vev, bruke saks for å hakke prøven så liten som mulig.
- Distansere de hakket prøven i en enkelt-cellesuspensjon ved hjelp av en dissociator og svulst dissosiasjon kit (human) i henhold til produsentens instruksjoner. Filtrer suspensjonen med en 70 mikrometer celle sil som er satt på et 50 ml rør og vaske sil 2 ganger med2 ml RPMI 1640.
- Sentrifuger ved 200 xg ved romtemperatur i 5 min. Kast supernatanten og resuspender cellene i 10 ml T-cellemedium (Tabell 1).
- Fremstille en to-trinns gradient løsning slik som Ficoll (gradient løsning) i en 50 ml rør, med et nedre trinn med 10 ml 100% gradient oppløsning og et midtre trinn med 30 ml 75% gradient oppløsning fortynnet med Dulbeccos fosfat- bufret saltløsning, ingen kalsium, noe magnesium (D-PBS (-)).
- Layer cellesuspensjonen (fra trinn 1.4) på gradienten oppløsning (fra trinn 1.5). Sentrifuger ved 400 xg ved 20 ° C i 45 minutter.
- Samle laget som inneholder det berikede Tīlss ved grenseflaten mellom 100% gradient oppløsning og 75% gradient oppløsning i et 50 ml rør. Fortynn lag av løsningen med beriket Tīlss ved tilsetning av 20-30 ml D-PBS (-).
- Sentrifuger ved 200 xg ved romtemperatur i 5 min. Kast supernatanten og resuspender TIL-anriket fraksjon i 10 mlav T-celle-media.
- Kultur fraksjonen (fra trinn 1.8) med 2 ml av T-celle media og 6000 IU / ml rekombinant human (rh) IL-2 i en 6-brønners plate ved 37 ° C, 5% CO2.
- Endre halve media på dag 5 etter kultur initiering og etter 2-3 dager etterpå.
- Splitte cellene i et forhold på 1: 2 uten trypsinering etter mykt susp, dobling av antall brønner når nå 80-90% konfluens. Legg til en halv volum (1 ml) fra friske T-cellemedier og rhIL-2 på 6000 IU / ml.
2. Utarbeidelse av mitomycin-C-behandlede SNL Feeder Cell Plate
- Kultur SNL feeder-celler i 10 ml av snl mater cellemedium (Tabell 1) på en 0,1% gelatin-belagte 10 cm tallerken inntil 80-90% konfluens (3-4 x 10 celler 6) er nådd.
- Legg 310 mL av 0,4 mg / ml mitomycin C oppløsning direkte inn i snl materen cellekulturskål og inkubert ved 37 ° C, 5% CO2 i 2 timer og 15 min. Aspirer media ennd vaske cellene to ganger med 5 ml D-PBS (-).
- Tilsett 0,5 ml av 0,25% trypsin / 1 mM EDTA og inkuber ved værelsestemperatur i 1 min for å skille cellene. Legg 4,5 ml SNL mater celle media for å nøytralisere og re-suspendere cellene i en enkelt suspensjon.
- Overfør cellene inn i et 15 ml rør og sentrifuger ved 200 xg i 5 minutter. Aspireres media, og telle cellene med et hemocytometer etter re-suspendering i 10 ml snl mater cellemateriale.
- Plate 1.5 x 10 6 celler per brønn i SNL feeder-celler på en 10 cm plate, og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2. Bruk SNL mateceller i løpet av 3 dager.
3. generasjon av iPSCs Bruke Sendai Virus (SeV) Vector
- Høster Tīls (fra trinn 1.11) og aktiverer 5 x 10 5 celler av Tīlss med plate-bundet muse-anti-humant CD3 (1 pg / ml) og oppløselige mus anti-human CD28 (5 ug / ml), med rhIL-2- (6000 IU / ml) i 2 ml T-cellemateriale i en 6-brønn plate med tre7 ° C, 5% CO2 i 5 dager.
- Høste Tīlss (fra trinn 3.1) i et 15 ml rør ved hjelp av en pipette og telle celle tall med en hemocytometer.
- Reaktivere 1 x 10 5 celler av Tīlss med plate-bundet muse-anti-humant CD3 (1 pg / ml), og oppløselige mus anti-human CD28 (5 ug / ml), med rhIL-2 (60 IE / ml) i 500 ul av reprogrammerings-medium (tabell 1) per brønn i en 24-brønners plate ved 37 ° C, 5% CO2 i 24 timer. Forbered 3 brønner for SeV infeksjon: OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC (1 tillegg); SeV infeksjon (GFP: grønn fluorescerende protein) (1 tillegg); og celletall (en brønn).
- Etter 24 timer (fra trinn 3,3), telle celle tall med en hemocytometer og bestemme volumet av hvert virus av ulike (3-20) multiplicities på infeksjon (MOI). Fjern ett sett av Sendai virus vektor rør fra -80 ° C lagring. Tine SEV vektorer raskt i et vannbad (37 ° C) og plassere dem på is.
Volum av virus (il)= MOI (CIU / celle) x antall celler / titer av viruset (CIU / ml) x 10-3 (ul / ml) - Legg de beregnede volumer av hver av de fire Sendai virus vektor rør som hver for seg bæres OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC ved å tilsette en blanding av SEV vektorer ved 10-20 MOI inn i de medier, inkludert aktivert Tīlss.
- For å bestemme transduksjon effektivitet, legger de beregnede volumer av SeV-GFP i en brønn av aktiverte Tīlss.
- Sett fatet (fra trinn 3,5 og trinn 3.6) i inkubator ved 37 ° C, 5% CO 2 i 24 timer. Etter 24 timer anslå infeksjon effektivitet ved hjelp Tīlss infisert med SeV-GFP henhold fluorescens mikroskopi.
- Samle celler (i trinn 3,5) i et 15 ml rør. Sentrifuger ved 200 xg ved romtemperatur i 5 min.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 0,5 ml hESC media med Primate ES celle medium og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 4 ng / ml).
- Overfør suspensjonen i en 10 cm rett som Contains mitomycin-C-behandlede SNL feeder-celler i 10 ml hESC media. Endre hESC media annenhver dag inntil koloniene er vokst.
- Rundt dag 18-21, fjerne SNL mater cellene rundt koloniene under et mikroskop ved hjelp av en 10-mL tips i ren benk.
- Skrap koloniene ved hjelp av en 10-mL spiss og overføre dem ved hjelp av en 200-mL spiss inn i 100 pl av iPSCs media pr brønn i en 96-brønners vevkulturplate. Pipettes opp og ned til 2-3 ganger for å bryte koloniene i små klumper med en gjennomsnittlig størrelse på 50-100 pm.
- Overfør de små klumper i 6-brønns vevskulturplater med mitomycin-C-behandlede feeder-celler SNL (fra trinn 2) i 2 ml pr brønn av iPSCs media med basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 4 ng / ml). Endre iPSCs media hver dag.
- Overfør iPSCs til 6-brønns vevskulturplater med fersk mitomycin-C-behandlede SNL feeder-celler med 1 mg / ml kollagenase IV hver 5-6 dager. Forbered 2 brønner per plater av hver klon for immunostaining.
- Bestem fulle omprogrammering av hver klon ved immunhistokjemisk farging av pluripotency markører (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, og OCT3 / 4) 1.
MERK: For ytterligere evaluering av pluripotency potensial, bekrefter at fullt omprogrammeres IPSC linjer kan skille i tre bakterie lag av en embryoid kroppen formasjon og differensiering assay eller et teratom formasjon analysen 16. - Bekreft at fullt omprogrammeres IPSC linjer demonstrere en normal karyotype ved cytogenetisk analyse.
- For teratom formasjon, injiserer en udifferensiert TIL-avledet IPSC (1 x 10 6) suspensjon i 100 ul DMEM inneholdende 10% FCS inn i det subkutane vev på 6-8 uker gamle hunn-NOD / SCID-mus. Flekke teratom seksjoner med hematoxylin og eosin.
4. Immunofluorescensanalyse Farging av iPSCs for SSEA3, SSEA4, TRA1-60 og TRA1-81
- Vask iPSCs med 1 ml PBS og fikse iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehyde løsning i 10 min. Fjern den 4% paraformaldehydløsning og vask iPSCs med 1 ml PBS 3 ganger.
MERK: Vær forsiktig når du bruker paraformaldehyde fordi det er giftig. - Forbehandle iPSCs med blokkeringsbuffer (tabell 1) i 30 min. I mellomtiden, fortynne de primære antistoffer (rotte anti-human SSEA3, mus anti-human SSEA4, mus anti-human TRA1-60 og mus anti-human TRA1-81) 1:50 i 1,5% geit serum løsning fortynnet med PBS og TritonX -100 (totalvolum: 1 ml).
- Fjern blokkeringsbufferen (tabell 1). Legge til den fortynnede primære antistoff-løsning og inkuberes i 1 time ved romtemperatur. I mellomtiden, fortynne det sekundære antistoff (anti-mus IgG og IgM eller anti-rotte-IgM) 1:50 i 1,5% geiteserum oppløsning.
- Fjern den fortynnede primære antistoff-oppløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 ganger, hver gang i 5 min. Legge til den fortynnede sekundære antistoffløsning og inkuber i 45 minutter ved romtemperatur i et mørkt rom. Fjern den fortynnede sekundære antistoff-oppløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 ganger, hver gang i 5 min. Observer iPSCs med immunfluorescens mikroskopi.
5. Immunofluorescensanalyse Farging av iPSCs for Oct3 / 4
- Vask iPSCs med 1 ml PBS og fikse iPSCs med 1 ml 4% paraformaldehyde løsning for 10 min. Fjern 4% paraformaldehyde løsning og vaske iPSCs med PBS 3 ganger.
- Legg permeabiliseringsbuffer (tabell 1) og inkuber ved romtemperatur i 10 min. Fjern det permeabiliseringsbuffer og tilsett blokkeringsbuffer (tabell 1).
- Inkuber ved romtemperatur i 30 min. I mellomtiden, fortynne det primære antistoff (mus anti-human Oct3 / 4) 1:50 i blokkeringsbuffer.
- Legge til den fortynnede primær antistoffløsning og inkuber ved 4 ° C over natten.
- Fjern den fortynnede primære antistoff-oppløsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 ganger, hver gang i 5 min. I mellomtiden, dilutt det sekundære antistoff (geite-anti-muse-IgG / IgM) 1: 100 i blokkeringsbuffer.
- Legge til den fortynnede sekundære antistoffløsning og inkuber ved værelsestemperatur i et mørkt rom i 45 minutter.
- Fjern den fortynnede sekundære løsning og vaske iPSCs med 1 ml PBS 3 ganger, hver gang i 5 min. Observer iPSCs henhold immunfluorescens mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser oversikt over fremgangsmåten som involverer den første utvidelse av melanom Tīlss med rhIL-2, som er etterfulgt av aktivering med anti-CD3 / CD28 og genoverføring av OCT3 / 4, KLF4, SOX2, og c-MYC til Tīlss for generering av iPSCs. Vanligvis Tīlss på kultur med rhIL-2 start for å danne kuler 21-28 dager etter oppstart av kultur. På dette punktet, Tīlss er klar til å bli aktivert med anti-CD3 / CD28. Figur 2A viser Tīls, på kultur med rhIL-2 på dag 21, som er klar til å bli aktivert med anti-CD3 / CD28. Figur 2B viser GFP innføring av Sendai virus (SeV) transfektert ved 20 MOI. Figur 2C viser et typisk pluripotent klone på SNL mater celler som vises 18-21 dager etter SeV infeksjon. Figur 2D viser at de genererte tIL-avledet iPSCs har en normal karyotype. Figur 3 viser immunfluorescens farging for å bekrefte pluripotency markør uttrykk på iPSCs (SSEA3, SSEA4, TRA1-81, TRA1-60, og OCT3 / 4). Figur 4 viser at iPSCs avledet fra melanom Tīlss er i stand til å danne teratom som inneholder en rekke celler fra tre bakterie lag (nevrale vev, respiratorisk epitel, og brusk). Figur 5 viser at genererte TIL-avledet iPSCs beholde TCR rearrangements.
Fig. 1: Skjematisk oversikt over genereringen av iPSCs fra melanom Tīlss Protokollen omfatter tre trinn: isolering og kultur av Tīlss med IL-2, T-celleaktivering med anti-CD3 / CD28, og celle omprogrammering med Sendai virus (SeV) vektor koding OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC. klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Generering av iPSCs fra melanom Tīlss (A) Et bilde som representerer morfologi av Tīlss i rhIL-2 når de begynte å utvide 2-3 uker etter oppstart av kulturen. (B) som representerer morfologi og GFP uttrykk for Tīlss en dag etter SeV infeksjon. (C) En typisk ESC-lignende IPSC koloni på dag 21 etter infeksjon SeV. Skalaen barer = 200 mikrometer. (D) Cytogenetisk analyse på tyve G-båndede metafase-celler fra en av de iPSCs avledet fra melanom Tīlss. Figur (D) er tilpasset fra Saito et al 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
ftp_upload / 54375 / 54375fig3.jpg "/>
Figur 3:. Immunfluorescens farging med stamcelle pluripotente markører The immunfluorescens analysen viser at TIL-avledet iPSCs fra to pasienter er positive for SSEA3, SSEA4, TRA-1-81, TRA-1-60, og OCT3 / 4. Skalaen barer = 100 μm.The Figuren er tilpasset fra Saito et al 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Bekreftelse på pluripotency for iPSCs med teratom formasjon Hematoxylin- og eosin-farget representative Teratom deler avledet fra TIL-avledet iPSCs klone (6 uker etter injeksjon i NOD / SCID mus) er vist. Figur tilpasset fra Saito et al 16..com / filer / ftp_upload / 54375 / 54375fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 5: Et bredt utvalg av TCR-beta-genet arrangement mønstre i TIL-iPSCs TCR-beta-genet rearrangementer i TIL-iPSCs blir identifisert ved kapillær elektroforese. Den grønne linje er avledet fra bandet for Jβ1-genet, og den blå linjen er avledet fra bandet for Jβ2 genet. Figuren er tilpasset fra Saito et al 16. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: Sammensetning for T-cellen, omprogrammering, tumor innsamling, SNL mater celle, og IPSC media, og permeabilization og blokkerer buffere. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viste vi en protokoll for omprogrammering melanom Tīlss til iPSCs av SeV-mediert transduksjon av de fire transkripsjonsfaktorer OCT3 / 4, SOX2, KLF4, og c-MYC. Denne fremgangsmåten, ved hjelp av et SeV system for å omprogrammere T-celler, har fordelen av en ikke-integrert metode 7.
En tidligere studie viste at en SeV omprogrammering systemet var svært effektiv og pålitelig å omprogrammere ikke bare fibroblaster, men også i perifert blod T-celler 7,17. I tillegg har vi nylig vist at melanom Tīlss som er mer differensiert og uttrykker høyere nivåer av inhibitoriske reseptorer så som PD-1 enn perifere blod T-celler også kan omprogrammeres ved hjelp av SeV vektorer 16. Timing av stimulering med anti-CD3 / CD28 og infeksjon med SeV vektor var kritisk i omprogrammering Tīlss. Perifere blod-T-celler kan bli stimulert med anti-CD3 og IL-2 for å omprogrammere umiddelbart etter høsting fra emnet 7, while Tīlss trenger å bli dyrket i 3-4 uker med IL-2 før stimulering.
Selv om mer enn 99% av Tīlss var CD8 T-celler etter 3-4 uker med kultur med IL-2 og aktivering med anti-CD3 / CD28 16, anbefaler vi analyse av TCR omorganisering i iPSCs å bekrefte at generert iPSCs er fra Tīlss (figur 5). Av notatet, tidligere studier inkludert vårt indikerte at hver iPSCs generert ved hjelp SeV fra perifert blod mononukleære celler eller Tīlss hadde TCR omorganisering 7,16.
Selv generasjonen iPSCs fra melanom Tīlss var gjennomførbart, fant vi at omprogrammering effektiviteten av melanom Tīlss var lavere (0,01-0,05%) 16 enn for perifert blod T-celler (0,1%) 7. Årsaken til dette er uklar, men det kan være forbundet med den høyere ekspresjon av inhibitoriske reseptorer eller det større antall differensierte T-celleundergrupper i Tīlss 13,16. Siste betydelig fremgangfor omprogrammering teknologi kan forbedre omprogrammering effektivitet for generering av TIL-iPSCs. Den andre generasjonen SeV vektor, TS12KOS, ble funnet å ha høyere effektivitet av IPSC generasjon enn de konvensjonelle SeV vektor anvendt i tidligere studie 18,19.
Selv om avledning av menneskelige iPSCs med et SeV omprogrammering system er mulig, er det flere begrensninger som skal vurderes i denne protokollen. Vi bruker føtalt bovint serum i løpet av SeV infeksjon i denne protokollen. Vi fant at omprogrammering effektiviteten av melanom Tīlss var betydelig lavere ved bruk av medier med humant serum under SeV infeksjon sammenlignet med en med føtalt bovint serum, til tross for lik spredning av Tīlss. Vi bruker også en mus mater lag for IPSC generasjon og vedlikehold, men en definert mater-fri og xeno-free system kan være alternative metoder i fremtidige studier.
Det tar rundt to måneder fra tidspunktet for svulst høst å generere iPSCsfra melanom Tīlss. I tillegg vil det ta ytterligere 1-2 måneder å få transgene fritt iPSCs. Dette kan bli forkortet ved anvendelse av den nye typen SeV vektor, TS12KOS, som har vist en mer effektiv virus eliminasjonshastighet 19.
I konklusjonen, er den generasjonen av menneskelige iPSCs fra melanom Tīlss gjennomførbart. Den nåværende protokoll kan være et viktig skritt for å generere et uendelig antall kreftspesifikke T-celler for adoptiv T celleterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gentle MACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| gentle MACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Tumor Dissociation Kit, human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Strainer | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes | BD | 352070 | |
| IMDM | Life technologies | 12440053 | |
| human AB serum | Life technologies | 34005100 | |
| L-glutamine (200mM) | Life technologies | 25030-081 | |
| 2-mercaptoethanol (1000x, 55mM) | Life technologies | 21985-023 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| gentamicin | Life technologies | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | Life technologies | 14040-133 | |
| recombinant human (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3 | BD | 555329 | |
| Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28 | BD | 555725 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Cumberland Pharmaceuticals Inc. | NDC 66220-207-30 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (6-well) | Corning | 353046 | |
| Falcon Tissue Culture Plates (24-well) | Corning | 353047 | |
| Sendai virus vector | DNAVEC | ||
| SNL feeder cells | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| mitomycin C | SIGMA | M4287 | soluble in water (0.5 mg/ml) |
| gelatin | SIGMA | G1890 | |
| basic fibroblast growth factor (bFGF) | Life technologies | PHG0264 |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Maherali, N., et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).
- Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448, 313-317 (2007).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7, 20-24 (2010).
- Nishimura, T., et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 114-126 (2013).
- Vizcardo, R., et al. Regeneration of Human Tumor Antigen-Specific T Cells from iPSCs Derived from Mature CD8(+) T Cells. Cell Stem Cell. 12, 31-36 (2013).
- Wakao, H., et al. Expansion of functional human mucosal-associated invariant T cells via reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 12, 546-558 (2013).
- Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Shelton, T. E., Even, J., Rosenberg, S. A. Generation of tumor-infiltrating lymphocyte cultures for use in adoptive transfer therapy for melanoma patients. J Immunother. 26, 332-342 (2003).
- Gros, A., et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J Clin Invest. 124, 2246-2259 (2014).
- Rosenberg, S. A., et al. Durable Complete Responses in Heavily Pretreated Patients with Metastatic Melanoma Using T-Cell Transfer Immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17, 4550-4557 (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat Rev Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Saito, H., et al. Reprogramming of Melanoma Tumor-Infiltrating Lymphocytes to Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 11 (2016).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 14234-14239 (2011).
- Fujie, Y., et al. New Type of Sendai Virus Vector Provides Transgene-Free iPS Cells Derived from Chimpanzee Blood. PLoS One. 9, e113052 (2014).
