Hochdurchsatz-Identifizierung von Bakterien abstoßenden Polymere für medizinische Geräte

Zusammenfassung

Es wird eine Hochdurchsatz-Microarray-Methode zur Identifizierung von Polymeren beschrieben, die die bakterielle Oberflächenbindung auf Medizinprodukten reduzieren.

Zusammenfassung

Medizinprodukte werden oft mit Krankenhausinfektionen in Verbindung gebracht, die eine enorme Belastung für Patienten und das Gesundheitssystem darstellen und zur Antibiotikaresistenz beitragen. Ein möglicher Weg zur Reduzierung von produktassoziierten Infektionen ist die Identifizierung von bakterienabweisenden Polymerbeschichtungen für diese Geräte, die eine bakterielle Bindung im ersten Anhaftungsschritt verhindern würden. Ein Verfahren zur Identifizierung solcher abstoßenden Polymere, das auf dem parallelen Screening von Hunderten von Polymeren mit Hilfe eines Microarrays basiert, wird hier beschrieben. Diese Hochdurchsatzmethode führte zur Identifizierung einer Reihe vielversprechender Polymere, die der Bindung verschiedener klinisch relevanter Bakterienarten einzeln und auch als Mehrartengemeinschaften widerstanden. Ein Polymer, PA13 (Poly(methylmethacrylat-co-dimethylacrylamid)), zeigte eine signifikante Verringerung der Bindung einer Reihe von Krankenhausisolaten, wenn es auf zwei kommerziell erhältliche zentrale Venenkatheter aufgetragen wurde. Das beschriebene Verfahren könnte zur Identifizierung von Polymeren für eine Vielzahl von Anwendungen angewendet werden, bei denen die Modifikation der bakteriellen Anheftung wichtig ist.

Einleitung

Polymer - Mikroarrays sind Hochdurchsatz - Plattformen miniaturisierten , in dem bis zu 7.000 Polymeren ¹ werden für Parallelanalyse mit prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen ² auf Glasobjektträger gedruckt. Die hier vorgestellte Methode basiert auf dem , was wir zuerst ³ im Jahr 2010 beschrieben. Dieser Screening - System für zahlreiche Zelltypen , einschließlich humanen Hepatozyten ^4, angewendet worden Stammzellen ^5, renale tubuläre Epithelzellen ^2, Bakterien ^3,6 und Protozoen Erreger ^7. In jedem Fall Polymere , die von den Zellen untersuchten Resists fördern oder Bindungs wurden ⁸ identifiziert. Komplexe von DNA mit synthetischen polykationischen Polymeren sind auch in der Microarray - Format für Hochdurchsatz - Screening von Kandidaten Gentransfektion ⁹ verwendet. Neben Screening für Zell-Substrat - Wechselwirkungen, Polymer - Mikroarrays haben auch zur Bewertung der Materialeigenschaften ¹⁰ verwendet.

"> Die Fähigkeit von synthetischen Polymeren Befestigung von Bakterien an eine Oberfläche zu modulieren ist gut ^3,6,11 hergestellt. Eine Vielzahl von Faktoren einschließlich der Ladung, Hydrophobizität und die Oberflächenrauhigkeit der Polymeroberfläche sind bekannt bakterielle Bindung zu beeinflussen. Die herkömmlichen Ansätze des Entdeckens Biomaterialien die von Bakterien durch sequentielles Resists Bindung oder empirisch Auslegung und Prüfung eines Materials zu einem Zeitpunkt sind arbeitsintensiv, teuer und zeitraubende Prozesse. Polymer-Mikroarrays eine attraktive Alternative bieten für solche Einschränkungen zu umgehen.

Oberflächen-assoziierten Bakterien wachsen, wie eine komplexe Population einen Biofilm genannt - solche Biofilme zu viele Umweltbelastungen und Antibiotika sehr resistent sind. Dies wird teilweise aufgrund ihrer dichten extrazellulären Matrix (bestehend aus Proteinen, Polysacchariden und Nukleinsäuren) ¹² und durch die erhöhte Anwesenheit von robust "persistor" Zellen in Biofilmen ¹³ teilweise . Although die genauen Mechanismen der Oberflächen Vereinigungs- und anschließende Biofilmbildung schwierig zu charakterisieren, wird allgemein angenommen , dass es drei verschiedene Stufen der Oberflächenwachstum ^{14 - 16.} Initiale, reversible Befestigung wird durch stärkere Adhäsion von Zellen gefolgt, die Einrichtung eines Biofilms durch die Produktion eines extrazellulären Protein und Polysaccharid-Matrix und Zellproliferation. Schließlich werden die reifen Biofilm Versionen freilebenden planktonischen Zellen, die an anderer Stelle neue Infektionen auslösen können. Bakterien abweisende Polymere, die die anfängliche Anlagerung von Bakterien zu verhindern, und somit frühen Stadien der Biofilmbildung zu verhindern, was möglicherweise eine ausgezeichnete Lösung dar Infektionen zu minimieren. Angesichts der Zunahme der Antibiotikaresistenz (und auch der an sich einen größeren Widerstand von oberflächen assoziierten Bakterien ^12), antibiotikafreies Mittel von Infektionen zu reduzieren , sind von besonderem Interesse. In einem Krankenhaus, abstoßend Bakterien PolymerBeschichtungen können eine direkte medizinische Anwendung bei der Reduktion von nosokomialen Infektionen haben, die ¹⁷ um implantierte Vorrichtungen häufig bilden.

Hier wird ein Hochdurchsatz - Verfahren zum Screenen von 381 Polymeren für abweisende Wirkung gegen eine Reihe von pathogenen Bakterien mit nosokomialen Infektionen, gefolgt von Treffer Validierung und anschließende Beschichtung und Untersuchung von zentralvenösen Katheter Materialien wird beschrieben (Abbildung 1). Kurz gesagt, wurden die Polymere auf Agarose-beschichtete Glasobjektträger durch Kontaktdrucken und nach dem Trocknen und Sterilisieren getupft wurden die miniaturisierten Arrays mit klinisch wichtige Bakterienkulturen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Mikroarrays vorsichtig gewaschen und anhaftende Bakterienzellen wurden gefärbt und durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Anschließend Polymere, die durch Elektronenmikroskopie durch Beschichtung auf Glasdeckplättchen in einem größeren Maßstab untersucht und visualisiert bakterielle Bindung inhibiert wurden. Ausgewählte abstoßenlieh Polymere wurden dann auf kommerziellen Katheter beschichtet und um fast 100-fach zu reduzieren Befestigung von Bakterien gezeigt.

Protokoll

1. Herstellung von Agarose beschichteten Objektträger

HINWEIS: Bevor Sie die Polymer - Mikroarrays Herstellung, Aminoalkylsilan beschichtete Glasobjektträger werden mit Agarose beschichtet IB zu minimieren unspezifische Hintergrundbindung sein und eine Beurteilung von Polymeren , die ⁶ Bakterien binden oder abstoßen. Silanbeschichtung erleichtert auf die Objektträger aus Agarose die Bindung.

1. Bilden eine 2% (w / v) Lösung von Agarose IB in destilliertem Wasser in einer 250 ml Flasche.
2. Nach dem Verschließen lose die Flasche, erhitzen die Suspension in einem Mikrowellenofen in 30 sec Perioden, bis sie gelöst. Stellen Sie sicher, dass der Deckel nicht dicht geschlossen ist, einen möglichen Druckaufbau zu vermeiden. Entfernen Sie die Flasche regelmäßig und vorsichtig schwenken.
3. Stellen Sie sicher, dass der Feststoff aufgelöst und die Lösung klar ist. Gießen Sie diese Agarose-Lösung in einen 100-ml-Becher, und in einem 65 ° C Wasserbad eine flüssige Lösung zu erhalten.
4. Tauchen Sie die Silan-beschichteten Objektträger in die Agarose-Lösung, die einheitliche Beschichtung und wipe die Rückseite der Folie mit einem Seidenpapier.
5. Trocknen Sie die Folien, mit der beschichteten Seite nach oben in einer staubfreien Umgebung (zB in einem Schrank oder Dunstabzug) für mindestens 24 Stunden.
6. Bestätigen Sie eine gleichmäßige Beschichtung durch visuelle Inspektion. Die Beschichtung kann leicht durch die Atmung auf den Objektträger bewertet werden - Kondensation wird auf unbeschichteten Regionen bilden. Nur Folien vollständig und gleichmäßig beschichtet sollte für Microarray-Drucken verwendet werden.

2. Herstellung von Polymerlösungen zum Drucken

1. Werden die Lösungen (1% w / v) aus einer Auswahl von vorgeformten Polymeren , bestehend aus Polyacrylaten, Polyacrylamiden und Polyurethanen in N - Methylpyrrolidon (NMP) in Glasfläschchen. (Bereiten 1 ml jedes Polymers). Vortexen, bis das Polymer vollständig gelöst. Synthese von Polymeren ist an anderer Stelle ⁶ beschrieben.
2. eine Mikropipette, mit 25 & mgr; l Polymerlösung jeder Vertiefung einer 384-Mikrotiterplatte füllen, dass es sicherzustellen, kein Kreuz Conta istmung und jede Vertiefung enthält eine einzigartige Polymer. Verwenden NMP als negative Kontrolle in wenigstens 2 Vertiefungen. Notieren Sie sich die Identität der Polymerlösung in jede Vertiefung auf einer Well-Platte Vorlage oder Tabellenkalkulationsdatei.

3. Drucken Polymer-Mikroarrays einen Kontakt des Druckers mit

HINWEIS: Das Drucken von Microarrays durchgeführt wurde, einen Kontaktdrucker. Spezielle Anweisungen in Bezug auf Polymer-Mikroarray-Druck sind unten angegeben. Allgemeine Richtlinien zum Einrichten des Druckers und Sicherheitsempfehlungen verwenden, befolgen Sie die Bedienungsanleitung des Herstellers. Obwohl wir könnten einen Kontaktdrucker, eine geeignete manuelle Prägevorrichtung verwenden ebenfalls verwendet werden.

1. Wie in den Drucker Bedienungsanleitung empfohlen, erstellen Sie eine Routine (siehe Schritt 3.3), die das Drucken von 384 Flüssigkeiten (die Polymerlösungen oder NMP) in vierfacher ermöglicht, über einen 32-poligen Microarraying Kopf mit (angeordnet sind, wie 8 Reihen und 4 Spalten).
2. Drucken 1.536 Punkte angeordnet sind, wie 48 Zeilen und 32 Spalten. Programm die Routine in Abschnitt 12 zu druckens, dh., 32 - Lösungen zu einem Zeitpunkt, so daß der Drucker nach dem Drucken jeder Abschnitt für die Reinigung von Stiften zu ermöglichen , angehalten werden.
3. Um eine Druckroutine zu erstellen:
   1. Öffnen Sie die Software und eine der verfügbaren Optionen wählen "Erstellen Sie eine neue Routine". Wählen Sie die "Beschreibung" Register zur Eingabe von Details des Experiments. Wählen Sie den "Kopf" Registerkarte und wählen Sie '32 -Pin Microarraying Kopf '.
   2. Wählen Sie die 'Source' Registerkarte und wählen Plattenhalter (Quelle Plattenhalter (1x5)), Plattentyp (Platte 384 x 6000), Gesamtplatten (1) und der Reihenfolge der Quelle (durch Spalten).
   3. In der Registerkarte "Slide-Design ', wählen Sie' 3x1 '' Dia 'und wählen Sie durch Anordnen" Feldnummer ". Dann wählen Sie "Gruppierungsmuster". Input 'Spot-Ansicht "als" Layout "und" Pattern Dimensionen' als 'Row count' (6), "Spaltenanzahl" (8) "Reihenabstand" (750) und "Spaltenabstand" (560). Wählen Sie einen Abschnitt Tannen zu druckent.
   4. In der "Slide Layout" Registerkarte Eingabe die Anzahl der Folien zum Drucken verwendet. Wählen Sie die "Drucken" Register zur Eingabe der Druckparameter (Anzahl der Marken pro Farb: 1, Zahl der Marken pro Spot: 5, Prägezeit: 200 ms, Farbzeit: 100 ms).
      HINWEIS: Eine Routine nun zum Drucken von 384 Flüssigkeiten (die Polymerlösungen oder NMP) vierfach erstellt wird, einen 32-Pin-Microarraying Kopf mit (angeordnet als 8 Reihen und 4 Spalten). Insgesamt sollte die Routine 1.536 Punkte als 48 Zeilen und 32 Spalten mit einem Reihenabstand von 750 & mgr; m und Spaltenabstand von 560 & mgr; m angeordnet drucken.
4. Legen Sie die Agarose-beschichteten Folien auf der Plattform und gewährleisten Dichtung ein gutes Vakuum die Dias in Position zu halten.
5. Stellen Sie den Druckkopf, so dass alle Stifte auf gleicher Höhe sind. Prüfen Sie dies, indem Sie manuell den Kopf gesenkt auf einem Glasobjektträger und bestätigt, dass die Stifte in der gleichen Zeit nach oben bewegen. Wenn es irgendwelche Unstimmigkeiten mit der Höhe sind, kann durch Anpassung des sleev mite auf dem oben Stift oder unten.
6. Legen Sie die Well - Platte auf dem Plattenhalter in der richtigen Ausrichtung, dh., Gut A1 ist nach oben rechts des Halters und gewährleisten die Well - Platte fest fixiert ist.
7. Mit der Höhenversteller, stellen Sie sicher, dass die Höhe des Plattenhalters ist so, dass, wenn die Polymerlösungen Kommissionierung, die Stifte berühren nicht den Boden der Vertiefungen.
   Hinweis: Dies ist wichtig für die einheitliche Polymer beobachten und auch in angrenzende Vertiefungen Verschütten von Polymerlösungen zu vermeiden, wodurch eine Kreuzkontamination verursachen.
8. Wählen Sie den 'Start' Registerkarte und wählen Sie den 'Run Typ "als" Normal ". Klicken Sie auf "Ausführen", und bestätigen Sie diese Folie, Well - Platte, etc., sind in Position , wenn Sie dazu aufgefordert.
9. Drucken 1 Abschnitt zu einer Zeit (32 Lösungen zu einem Zeitpunkt; 12 Teile), so dass für die Reinigung der Stifte zwischen den Abschnitten. Reinigen Sie die Stifte sorgfältig mit einem Papiertuch in Aceton getaucht, gefolgt von trockenen Tissue-Papier, um sicherzustellen, sind die Stifte vollständig trocken.
10. Nach Beendigung des Druckens der Mikroarrays, so dass sie in einem Diahalter legen und trocknen Sie sie über Nacht in einem Vakuumofen bei 45 ° C das NMP in den Polymerflecken zu entfernen. Nach der Sterilisierung mit UV-Licht für 30 min werden die Mikroarrays für die Inokulation von Bakterien bereit.
11. Bevor Folien mit Bakterien Impfen, eine Messung der Hintergrundfluoreszenz (wie in Kapitel 5). Verwenden Sie diese Messung bei der Berechnung der bakteriellen Bindung.

4. Inokulation von Polymer-Mikroarrays mit Bakterien

HINWEIS: Für gute aseptische Technik. Alle Handhabung der Kulturen sollte in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden: entweder ein Bunsenbrenner oder in einem Strömungshaube verwenden. Die Kulturen sollten mit Sauerstoffverfügbarkeit, Wachstumsmedium und der Temperatur auf die Anforderungen der einzelnen Arten angepasst gezüchtet werden.

1. Bereiten Nacht - Kulturen durch Impfen 5 ml Luria-Bertani - Brühe (LB: 10 g L ^-1 Bacto-Trypton, 5 g NaCl L ^-1 und 10 g L ^{-1 Hefeextrakt) mit einer Kolonie von einer Platte. über Nacht bei 37 ° C inkubieren, bei 200 Umdrehungen pro Minute schütteln.}
2. Bereiten Gefrierschrank Bestände über Nacht Kulturen durch Zusatz von Glycerin (10% Konzentration insgesamt) und speichern Sie die Lager bei -80 ° C.
3. Um die Zellzahlen von Proben der aufgetauten Bakterien-Aktien, um zu bestimmen, führen Sie serielle Verdünnungen von jedem Lager und die Bakterien wachsen über Nacht auf festen Medien. Eine genaue Bestimmung der Zellzahlen in Aktien gewährleistet eine angemessene Impfung jeder Art ^6.
4. Bereiten Sie Inokula für die Microarray. Einzelne Spezies Kulturen wie oben und direkt auf den Mikroarrays gezüchtet. BacMix-1 ist eine bakterielle Mischung von Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) und Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 ist ein Bakteriengemisch , bestehend aus Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus , K. pneumoniae und Enterococcus faecalis (E. faecalis).
5. Zur Herstellung entweder Mischkultur, mischen Übernachtungen in gleichen Volumina (je 3 ml) und verdünnter viermal mit frischem LB (auf etwa 50 ml Endvolumen).
6. Platzieren UV-sterilisiertem Polymer-Mikroarrays in rechteckigem 4-Well-Platten und Inkubieren sie mit 6 ml der gemischten Bakterienkulturen bei 37 ° C unter leichtem Schütteln (30 rpm) für 5 Tage.
7. Nach der Inkubation spülen sanft die microarrays zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO ₄₎ und mit einer Lösung von 1 & mgr; g ml ^-1 von 4 inkubieren ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) stain für 30 min in PBS.
8. Waschen Sie die gefärbten Microarray-Slides in einem frischen Well-Platte, indem sie mit PBS abdeckt und wirbelnden sanft, einmal die PBS zu verändern. Trocken unter einem Luftstrom. Tragen Sie eine Deckglas auf dem Microarray Objektträger und Dichtung an Ort und Stelle mit Klebstoff. Sobald dry, Sterilisieren der äußeren Oberfläche mit 70% (v / v) Ethanol.
9. Entsorgen Sie Kulturen nach ihrer Sicherheitsstufe.

5. Microarray-Imaging und Analyse

1. Erfassen von Einzelbildern für jedes Polymer Stelle in Hell- und DAPI (Ex / Em = 358 nm / 361 nm) Kanäle. Führen Sie diese manuell mit einem Fluoreszenzmikroskop oder unter Verwendung eines automatisierten Fluoreszenzmikroskop (mit einem XYZ-Bühne gesteuert durch eine Bildaufnahme-Software) mit einem 20x-Objektiv ausgestattet.
   HINWEIS: Lesen Sie im Handbuch ¹⁸ für den Betrieb der Software und Einstellen der Mikroskopbilder Kanäle für Hellfeld- und DAPI zu erhalten. Sicherzustellen, dass die Verstärkung und Belichtungszeit für die Bilderfassung für alle Mikroarrays gleich sind.
2. Besorgen Sie sich die durchschnittliche Fluoreszenzintensität von jedem Ort in der DAPI Kanal durch den Punktbereich der Wahl und die Fluoreszenz mit einer Bildverarbeitungssoftware zu quantifizieren.
3. Für die Hintergrundfluoreszenz von jedem Fleck, OBTAin Bildern der Polymer Flecken auf einem Replikat-Microarray inkubiert nur mit Medien ohne Bakterien. Abzüglich der Hintergrundfluoreszenz von der Intensität des Flecks Fluoreszenz von Bakterien zu erhalten.
4. Berechnen durchschnittlichen normalisierten Wert von den vier Punkten, jedes Polymer darstellt, die für Bakterien Vergleich Bindung verschiedener Polymere ^6.
5. Identifizieren Sie die Polymere, die die geringste bakterielle Bindung (niedrigste Fluoreszenz) als "Treffer" Polymere ⁶ aufweisen.

6. Beschichtung der Deckgläser für 'Hit' Validation

1. Zur Beschichtung mit Deckgläser Polymers:
   1. Herstellung von Lösungen der "Treffer" Polymere (~ 2% w / v) in Tetrahydrofuran (THF), oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel.
   2. Spin-Coating-Kreisglasplättchen geeigneter Größe mit den Polymerlösungen einen Spin Coater bei 2000 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden verwendet wird.
      HINWEIS: In Abwesenheit eines Spin Coater, Deck oder andere Materialien können beschichtet sein Dip, obwohl SpinBeschichtung erzeugt eine gleichmäßigere Oberfläche.
   3. Trocknen der beschichteten Deckgläschen in einem Umluftofen bei 40 ° C über Nacht und zu sterilisieren UV-Licht für 30 min vor der Inokulation Bakterien.
2. Um Mantel Deckgläser mit Agarose für die Negativkontrollen:
   1. Saubere Deckgläser entweder durch eine Plasmabehandlung für 10 min oder 4 h in 1 M NaOH eingetaucht wird.
   2. Tauchen Sie die Deckgläser in Acetonitril, enthaltend 1% (3-Aminopropyl) triethoxysilan über Nacht. Reinigen Sie die Deckgläser mit Aceton 3-mal und in einem Ofen (100 ° C) für 1 Stunde.
   3. Tauchlack die getrockneten Deckgläschen mit 1% Agarose-wässrigen Lösung in einem Wasserbad gehalten bei 60 ° C. mit UV-Licht für 30 Minuten vor dem Impfen Bakterien Legen Sie die Agarose-beschichtete Deckgläser auf eine ebene Fläche in staubfreie Umgebungsbedingungen für 24 Stunden und zu sterilisieren.

7. Befestigung und Analyse von Deckglas Mit Rasterelektronenmikroskop (SEM)

1. NachSterilisation mit UV-Licht für 30 Minuten, legen Sie die Deckgläser (Polymer / Agarose-beschichtete oder unbeschichtete Glas) in einem Standard-12-Well-Platte oder Platte mit 24 Vertiefungen (abhängig von der Größe der Deckgläser) und mit Bakterien brüten, wie im Abschnitt 4.
2. Nach Inkubation mit Bakterien, wasche die unbeschichteten und Deckgläser zweimal mit 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) und dann fix mit 2,5% (w / v) Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer (pH 7,4) für 2 Stunden beschichtet.
3. Postfix-Proben mit 1% (w / v) Osmiumtetroxid für 1 Stunde bei Raumtemperatur und entwässern mit sequentieller Ethanol Waschungen bei 50, 70, 90 und 100% (v / v) für 30 min jeweils.
4. Trockenen Proben in CO ₂ gemäß Standardprotokollen ^19. Die Trocknungszeit hängt von der Natur der Probe abhängen.
5. Coat-Proben in einem Gold / Palladium-Legierung (60/40%) mit einem Sputter-Beschichtungsvorrichtung mit Strom bei 30 mA und im Vakuum bei 0,75 Torr mit. Untersuchen Sie unter einem Elektronenmikroskop nach Standardprotokollen ^20.
   HINWEIS: Ensure angemessene Sicherheitsvorkehrungen Risiken zu managen von der Lagerung, Handhabung und Entsorgung von Osmiumtetroxid führt, wie es ist sehr giftig.
6. Visuell vergleichen Bilder der unbeschichteten Deckgläser und die mit Agarose oder den "Treffer" Polymeren beschichtet Bakterienbindungs ​​/ abweisenden Eigenschaften der Polymere zu bestätigen.
   HINWEIS: Widerstand der Befestigung sollte vorhanden als eine Reduktion der Zellen leicht sichtbar sein.
7. Wählen Sie die vielversprechendsten "Treffer" nicht bindende Polymere für die Beschichtung Studien mit Medizinprodukten (zB zentrale Venenkatheter) ^6.

8. Auswahl eines Lösungsmittels für die Beschichtungs Catheters

1. Auswerten verschiedenen Lösungsmitteln auf ihre Verträglichkeit mit dem Verweilkatheter Teil des Katheters, sowie die Fähigkeit, das "Treffer" Polymer aufzulösen. Schneiden Sie Teile von Cath-1 und in zylindrische Stücke 5 mm in der Länge und messen mit einem digitalen Messschieber.
2. Auswerten verschiedenen Lösungsmitteln wie acetic Säure, Ammoniak, Aceton, Acetonitril, Diethylether, Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF), N - Methyl-2-pyrrolidon (NMP), Ethanol, Methanol, Ethylenglykol, Toluol und Xylol. Tauchen Katheterstücke in den Lösungsmitteln für 12 Stunden und Auswertung visuell auf Integrität des Katheters und Klarheit des Lösungsmittels.
   HINWEIS: Wählen Sie ein Lösungsmittel, das nicht die Katheter nicht dazu führen, in einem trüben Lösungsmittel quellen oder sich auflösen oder zur Folge haben. Das Lösungsmittel muß die "Treffer" Polymere aufzulösen.

9. Analyse der bakteriellen Befestigung auf Kathetern durch konfokale Mikroskopie

1. Bereiten 2,5% (w / v) Polymerlösungen in Aceton oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel wie 8. Place 5 mm Katheter in Abschnitt bestimmt Stücke in einem kleinen Glasfläschchen (5 ml) und tauche sie in 1 ml der Polymerlösung für 2 min . Das überschüssige Polymerlösung und trockne die Katheterstücke über Nacht in einem Vakuumofen bei 40 ° C.
2. Bereiten Sie Inokulum durch aufgetauten Bakterien-st Mischocks in 50 ml ca. 10 ⁶ Zellen jeder Art zu geben LB ^6.
3. Sterilisieren beschichteten und unbeschichteten Katheter Stücke mit UV - Licht für 30 min und Inkubation mit 1 ml LB inokuliert , in einer 24-Well - Platte bei 37 ° C für 3 Tage unter leichtem Rühren ^6.
4. Nach der Inkubation waschen die Katheter mit PBS (2x, 2 ml), fixieren die Bakterien mit 10% Paraformaldehyd in PBS für 30 Minuten und waschen mit PBS (1 ml). Beflecken die Bakterien auf Katheterstücke mit DAPI (1 ug ml ^{- 1)} für 20 min und Waschen mit PBS (1 ml).
5. Erhalten konfokale Bilder der Katheterstücke mit den folgenden Einstellungen: 405nm blaue Diodenlaser, Detektorbereich 414-502 nm, Stiftloch - Airy1, Bildgröße - 1.024 × 1.024 Pixel, Voxel Breite - 105,2 nm, Z-Stapel Abstand 0.5μ m Vergrößerung - 40X 1,25.
6. Füllen Sie das konfokale Abbildung von Z-Stapeln 50 Bilder über 100 & mgr; m Länge des Katheters.
7. Analysieren Sie die Bilder mit dafür geeignetele-Analyse-Software: abflachen die Z-stacked Bilder in der Z-Ebene, die Funktion mit Schärfentiefe zu erweitern, um ein einzelnes Bild eines Katheters Stück zu schaffen.
   Hinweis: Dieses Bild sollte dann analysiert werden, um den Bereich des Katheters durch Bakterien bedeckt zu erhalten, nach Hintergrund-Korrektur mit Hilfe der 'Hintergrund glätten' Funktion.

10. Analyse der bakteriellen Befestigung auf Kathetern durch SEM

1. Herstellung von 10% igen Polymerlösung (w / v) in Aceton.
2. Drücken, um eine Pipettenspitze (200 & mgr; l Mikropipette) in den mittleren Abschnitt des geschnittenen Stücks des Katheters um es zu halten und das Stück in der Polymerlösung für etwa 30 sec tauchen. Trocknen des beschichteten Stück unter Umgebungsbedingungen für 30 min. Tragen Sie eine zweite Beschichtung durch erneutes Eintauchen in die Polymerlösung und über Nacht trocknen in den Umgebungsbedingungen.
3. Nach der UV-Behandlung und Inkubation mit Bakterien waschen Sie die Stücke (n = 3) mit PBS (2x, 1 ml) und übertragen sie in 48-Well-Platten 1, enthaltend0% Formaldehyd in PBS für 30 min. Nach dem Fixieren, waschen Sie die Stücke mit PBS (1 ml), trocken über Nacht bei Raumtemperatur einzuhalten, montieren auf Stubs mit leitfähigen Kohlenstoff Platten und Goldschicht eine Sputter-Coater (siehe Schritt 7.5) verwendet wird.
4. Abrufen von Bildern eines Rasterelektronenmikroskops ⁶ verwendet wird .

Ergebnisse

Figur 2 zeigt Bakterienbefestigungs (normierte Fluoreszenzintensität) zu einer Anzahl von Polymeren , wie durch Mikroarray - Analyse bestimmt. Spots ohne Polymer gedruckt (NMP nur) die negative Kontrolle, wie Agarose bakterielle Bindung ⁶ stark wider - aufgezeichnet Fluoreszenz sehr gering ist. Die Polymere angezeigt sind alle low-Bindung, obwohl in den meisten Fällen die abweisenden Eigenschaften eines Polymers getestet variiert signifikant zwischen den Bakterienarten. Darin spiegelt sich die großen Unterschiede zwischen den Befestigungsmechanismen zwischen verschiedenen Arten. Die Auswahl eines geeigneten Polymers ist daher abhängig von der Anwendung, aber die niedrigen bindenden Polymere werden leicht durch Vergleich mit Agarose identifiziert. High-bindende Polymere sind wahrscheinlich in einem Array zu identifizieren, und können als positive Kontrollen für nachfolgende Experimente verwendet werden. Für Polymere, die qualitative co keine Autofluoreszenz im DAPI Kanal zeigenmparison der Punktbilder visuell gemacht werden (wie in Abbildung 3 gezeigt, Hervorhebung einer repräsentativen Hoch bindendes Polymer und drei weise niederbindenden Polymere). Dieser Vergleich, während weniger Informationen als die statistische Analyse enthält, kann eine nützliche visuelle Überprüfung der Intensitätswerte berechnet werden.

Mit 22 geeigneten Polymeren mit dem Microarray, Scale-up-Experimente identifiziert werden durchgeführt, um ihre bakterienabweisende Eigenschaft bestätigen, wenn für die Beschichtung von größeren Flächen eingesetzt. Dargestellt sind die leistungsfähigsten Beispiele sind zur Beschichtung von Glasplättchen (analysiert durch SEM (4 und 5)) und Katheter Scheiben (analysiert durch konfokale Mikroskopie (Abbildung 6) und SEM (Abbildung 7)). Beide mikroskopischen Methoden haben den Vorteil, auf der Oberfläche direkte Zellzahlen ermöglicht, eindeutige Daten; Reduktion der Zellhaftung ist leicht Einsehbaree. Diese Beschichtungen, die am besten für ihre abweisenden Eigenschaften auf Scale-up beibehalten, als auch als offen für großflächige Beschichtungstechniken wurden weiter untersucht. Die gezeigten Ergebnisse zeigen die besten Performance Polymere aus jeder Stufe.

Abb . 1: Die Schritte bei der Identifizierung von Bakterien abweisende Polymere durch Polymer - Mikroarrays für biomedizinische Anwendungen beteiligt SEM = Scanning - Elektronenmikroskopie.

Fig . 2: Bacterial auf einer Reihe von Polymeren Bindung von Mikroarray - Analyse bestimmt Low bakterielle Bindung wird auf einer Reihe von Polyacrylaten / Acrylamide (PA) und Polyurethane (PU) gesehen. Die Ergebnisse aus Polymer-Mikroarrays mit mehreren Bakterien s sondiert Pecies (C. jejuni, C. difficile, C. perfringens, S. mutans und zwei Konsortien; BacMix-1 und BacMix-2) gezeigt. Bakterielle Bindung ausgedrückt als Hintergrund korrigierte mittlere DAPI Fluoreszenzintensität (normalisiert). Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung. Angepasst von Referenz ^6. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3:. Beispielbilder von Polymerflecken Fluoreszenz (DAPI) und Hellfeldmikroskopie Bilder von BacMix-2 zeigt bakterielle Bindung an repräsentativen Polymeren. Ein stark bindendes Polymer ist zum Vergleich zu mehreren nicht bindenden Polymere (PU-20, PA-336 und PU-179) enthalten. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Angepasst von Referenz ^6.: //www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg "Target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: Scale-up Versuche mit Glasplättchen REM - Aufnahmen zeigen bakterielle Befestigung auf unbeschichtetem Glas und Glas , beschichtet mit "Hit" Polymere (Beispiele aus der Tabelle ausgewählt 1).. Maßstabsbalken = 20 um.

Abbildung 5:. Bakterielle durch Zellzählungen von REM - Aufnahmen quantifiziert Bindung Vergleich der pro Flächeneinheit von Oberflächen mit den besten "Hit" Polymeren beschichtet anhaftenden Zellen. Agarose wurde als Kontrolle "nicht bindenden" Oberfläche, mit Glas als Steuerbindungsoberfläche verwendet. Fehlerbalken stellenStandardabweichung.

Abbildung 6: Vergleich der bakteriellen Bindung an beschichteten und unbeschichteten Katheter slices Konfokale Bilder unbehandelten Katheter (Cath-1) (A) und der Katheter beschichtet mit PA13 (B) nach der Inkubation mit BacMix-2 zu vergleichen.. Bilder, die mit einem 40X-Objektiv (Maßstabsbalken = 20 & mgr; m). Angepasst von Referenz ^6.

Abbildung 7:. Vergleich der bakteriellen Bindung an beschichteten und unbeschichteten Katheter Scheiben SEM - Bilder zeigen den Vergleich der unbehandelten Katheter (Cath-1) (A) und Katheter mit PA13 beschichtet (B) nach der Inkubation mit einer bakteriellen Cocktail bestehend aus BacMix-2 - Skala. Balken = 101; m. Angepasst von Referenz ^6.

Polymer	Monomer 1	Monomer 2	Monomer 3	Verhältnis von Monomeren
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	HEMA	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13		DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	BICH	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	BICH	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

Tabelle 1: Zusammensetzung der Bakterien nicht bindenden "Treffer" Polymere in Abbildung 2.

Diskussion

Befestigung von Bakterien an eine Oberfläche ist ein komplexer Prozess von einer Vielzahl von Faktoren abhängig von den Bakterienarten bestimmt, die Eigenschaften der Oberfläche des umgebenden Mediums und der physikalischen Umgebung. Obwohl bestimmte chemische Gruppen bakterielle Bindung zu beeinflussen sind bekannt (Polyglykole, beispielsweise widerstehen typischerweise Befestigungs ^11), ist die biologische Wirkung von Polymeren mit ihren chemischen Strukturen Korrelieren schwierig, rationale Design von Polymeren für spezifische Funktionen anspruchs machen. In Abwesenheit von detaillierten Befestigungsmechanismen, haben andere Studien natürlich vorkommende abweisenden Oberflächen nachzuahmen versucht, mit langwierigen und umfangreichen Optimierungsprozesse ^21. Die miniaturisierten Hochdurchsatzverfahren hier vorgestellten windet diese Herausforderungen durch parallele Screening von Hunderten von Polymeren zu erleichtern führt zur weiteren Untersuchung zu identifizieren.

Die Ergebnisse der Mikroarray-Verfahren hauptsächlich dazu dienen, identify wahrscheinlich Lead - Kandidaten dar. 2 22 Kandidaten mit geringer Bindung von mindestens einer Spezies zeigt, während 3 in Bindungskapazität die deutliche Reduktion demonstriert. Alle 22 Low-bindende Polymere in in Abbildung 2 gezeigt wurden , nach vorne in Scale-up Versuche gemacht, bei dem die beste (in Bezug auf Abweisung und Beschichtungseigenschaften) bestimmt PU83, PA13 und PA515 (4 und 5) zu sein. Polyacrylaten bieten eine größere Flexibilität bei der Polymerisation Methoden und so die niedrigste bindenden Polyacrylat, PA13, wurde für Katheter Beschichtungsstudien ausgewählt (6 und 7). Nähere weitere Arbeit wurde auf andere Kandidaten durchgeführt und an anderer Stelle ⁶ gemeldet.

Durch eine Reihe von experimentellen Wiederholungen fanden wir eine Reihe von kleineren Schritten zum Erfolg und Reproduzierbarkeit Schlüssel waren. Sowie erleichtern die Haftung desPolymere auf die Glasobjektträger, eine Agarose-under-Beschichtung sorgt für einen sauberen Hintergrund verwenden, wie Agarose sehr resistent gegen bakterielle Besiedlung ist. In ähnlicher Konsistenz in der Polymerflecken sich sowohl innerhalb der gleichen Anordnung und zwischen den Anordnungen, ist von entscheidender Bedeutung, und daher der Druck der Arrays müssen sorgfältig kontrolliert werden. Durch gezielte Einstellung der Stifte in den Druckkopf und auch eine gleichmäßige Befüllung der 384-Well-Platte erforderlich sind einheitliche Spek zu gewährleisten. Da einige der verwendeten Polymere wir ein gewisses Maß an Eigenfluoreszenz zeigten, Hintergrund Fluoreszenzdaten für jede Folie nehmen vor der Inkubation mit Bakterien lebenswichtig war. Zur Berücksichtigung Variationen und robusten Daten Replikate von Microarrays erhalten werden empfohlen.

Der Fleck verwendet hier (DAPI) keine Selektivität für Bakterienspezies, Bindung unspezifisch an DNA. Daher gute aseptische Technik ist wichtig, wenn Bakterienkulturen eingeführt werden als Verunreinigungen unbemerkt bleiben können, die Ausle verwirrendtation der Ergebnisse. Das gleiche gilt für spätere Experimente Rasterelektronenmikroskopie, wo es nur möglich ist, Stäbchen und Kokken zu unterscheiden, aber nicht Gattung oder Spezies.

Nach dem Microarray-Screening sollte viel versprechende Polymere für die weitere Validierung gewählt werden. Im hier vorgestellten Beispiel sieben Polymere von Interesse wurden durch ihre deutliche Reduktion der Fluoreszenz auf dem Mikroarray und deren Hemmung der Bindung identifiziert wurde durch Beschichten sie auf größeren Flächen bestätigt. 4 und 5 zeigen die Reduzierung auf Glasplättchen erreicht Bindung, ein praktisches Mittel, das Verhalten der Polymeren als bulk Beschichtungen nicht als Microarray-Spots zu testen. Anschließend wurden diese Polymere auf medizinische Vorrichtungen beschichtet zur vollständigen Reduktion der Bakterienbefestigungs quantifizieren. Es ist wichtig, dass das Lösungsmittel für diesen Beschichtungs Studien (siehe Abschnitt 8-Protokoll) ausgewählt ist gutartig auf das gewünschte Substrat (hier den Katheter), während behaltening Fähigkeit, das Polymer von Interesse, um zu ermöglichen Beschichtung aufzulösen. Hier haben wir Aceton, die, wie auch die genannten Eigenschaften, einen niedrigen Siedepunkt hat und verdunstet schnell eine gleichmäßige Beschichtung zu verlassen.

Die Mittel zur Validierung ausgewählt wird von der spezifischen Anwendung abhängen, untersucht. Als Beobachtung der Zellen durch Elektronen- und Fluoreszenzmikroskopie direkte Quantifizierung einzelner Zellanheftung kann, wählten wir diese Techniken als Ergänzung zu der Masse-Färbung Microarray-Assay. Die Ergebnisse sind in den 6 und 7 gezeigt , die die Bedeutung von komplementären Validierungsmethoden nachweisen. Die konfokale Bilder in Abbildung 6 liefern eine sehr klare Bilder der einzelnen Zellen, während der SEM den zusätzlichen Vorteil, dass eine Bewertung der Oberfläche des Polymers, die hier glatt und einheitlich ist. Diese Verfahren werden durch das Sichtfeld der Mikroskope beschränkt verwendet, und daher ist es important eine Reihe von Momentaufnahmen zu machen Vertrauen in die Ergebnisse zu haben. Das oben beschriebene Verfahren kann nicht bakterielle Adhärenz über die gesamte Oberfläche zu quantifizieren, nur Abdeckung aus einer Anzahl kleiner Regionen schließen. Wir glauben, dass dies für die beschriebene Anwendung ausreichend ist. Reduktion der bakteriellen Bindung konnte durch Auflisten Oberfläche anhaftenden Bakterien auf dem gesamten beschichteten und unbeschichteten Katheter Stücke unter Verwendung von Methoden beurteilt werden , wie an anderer Stelle ²² beschrieben. Jedoch erfordern solche Verfahren die Biomaterialoberflächen gesiebt, um eine gleichmäßige Oberfläche aufweist, die nur schwer zu erhalten, wenn Assays mit medizinischen Geräten durchgeführt werden, die oft komplexe Geometrie aufweisen.

Natürlich muss jedes Gerät für den klinischen Gebrauch bestimmt gehen durch erhebliche weitere Prüfung der Sicherheit und Wirksamkeit beim Menschen zu gewährleisten. Die hier vorgestellte Methode stellt den Beginn dieses Prozesses und die weitere Arbeit muss Bestätigung der in - vivo - Aktivität umfassen. In diesem Fall studieren venösen catheters, erste Arbeiten konnte die Bindung von Blutbestandteilen und ganzen Zellen an das Polymer zu untersuchen. Die Wirkung von Blutkomponenten auf die bakterielle Bindungs sollte auch in Betracht gezogen werden, möglicherweise durch die Bindungstests in Gegenwart von inaktivierten Serum wiederholende oder de-fibrinated Blut ^23. Der endgültige Test der Technologie wird in einem in vivo - Modell sein, wie ein subkutanes Implantat Infektionsmodell ^24.

Wir demonstrieren das Potential des Polymermikroarray-Verfahren zum Screenen von oberflächenverändernden Polymere. Solche Polymere (sowohl Widerstand und bakterielle Bindung zu fördern) haben eine große Anzahl von Anwendungen in der Medizin, der Lebensmittelindustrie und Biotechnologie, diese Methode Sinn nützlich sein können, in vielen Bereichen der Forschung. Obwohl hier die Arbeit Bakterien verwendet, könnte das Verfahren auf andere Zelltypen, und ebenso anderen chemischen Mikroarrays angepasst werden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Agarose	Sigma	05066
Silanpräparate	Sigma	S4651
Polymere	Eigensynthetisiert	Nicht zutreffend
NMP	Sigma	494496
LB Bouillon	Oxoid	CM1018
DAPI	Thermo Fisher	D1306
Tetrahydrofuran	Sigma	401757
(3- Aminopropyl) Triethoxysilan beschichtete Objektträger	Sigma	Silan-prep
Cacodylatpuffer	Sigma	97068
Katheter 1	Arrow	International CS12123E
Katheter 2	Baxter Healthcare	ECS1320
Osmium tetroxide	Sigma	201030
Equipment
Kontakt Drucker	Genetix	Qarraymini
Microarray Mikroskop	IMSTAR	Pathfinder
Spin Coater	Speedline Technologies	6708D
Konfokales Mikroskop	Leica	SP5
Bildanalysesoftware	Media Cybernetics	Image-Pro Plus
Rasterelektronenmikroskop	Philips	XL30CP
Sputter-Coater	Bal-Tec	SCD050