Method Article

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

DOI:

10.3791/54394

⸱

April 29th, 2017

 ,  , 
1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieser Artikel beschreibt die Entnahme und Verarbeitung von Proben für die Massenzytometrie-Analyse.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massen-Zytometrie verwendet mit Schwermetalletiketten konjugierte Antikörper, ein Ansatz, der stark erhöht die Anzahl der Parameter und Möglichkeiten für tiefe Analyse weit über hat, was möglich ist mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie. Wie bei jeder neuen Technologie gibt es wichtige Schritte, die die zuverlässige Erzeugung von qualitativ hochwertigen Daten sicherzustellen. Dargestellt ist hier ein optimiertes Protokoll, das mehrere Techniken für die Verarbeitung von Zellproben für die Massen Zytometrie Analyse einbezieht. Die hier beschriebenen Methoden helfen dem Benutzer häufige Fehler zu vermeiden und konsistente Ergebnisse erzielen durch Variabilität zu minimieren, die zu ungenauen Daten führen kann. Um experimentelles Design zu informieren, die Gründe für optionale oder alternative Schritte in dem Protokoll und ihre Wirksamkeit bei der Aufdeckung neue Erkenntnisse in der Biologie des Systems wird untersucht, behandelt. Schließlich wird repräsentative Daten vorgelegt erwarteten Ergebnisse der Techniken presente zu illustrierenhier d.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cytometry ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper Ziele in einer einzelnen Zelle Ebene über große Populationen von Zellen. In herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, die Anzahl der Parameter, die quantifiziert werden kann, wird durch spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum von mehreren Fluorophoren begrenzt, die immer komplexer werdenden Kompensationsberechnungen wie die Anzahl der Parameter ansteigt erfordert. Diese Einschränkungen werden durch Massen adressiert Cytometry, wo Schwermetall-konjugierten Antikörper nachgewiesen werden, und durch Flugzeit (TOF) Massenspektrometrie quantifizieren stark die Anzahl der Parameter gesammelt gleichzeitig expandiert und ein hohes Dimensionsprotein Überfluß Profil für jede einzelne Zelle zu ergeben.

Ein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise des Massen Zytometrie Instrument ist für den Benutzer von Vorteil und kann für die Fehlersuche wesentlich sein. Für eine ausführliche Beschreibung der Abstimmung und eine Masse-Zytometrie Maschine ausgeführt wird,finden Sie im verwandten Manuskript 1. Kurz gesagt, wird eine Zellprobe mit einem Panel von Antikörpern , konjugiert Metallzielzelloberflächenmarker, cytoplasmatische Proteine, nukleäre Proteine, Chromatin-gebundene Proteine oder andere Epitope von Interesse (Figur 1i) markiert. Die markierten Zellen werden auf die Maschine geladen wird, entweder einen nach dem anderen durch manuelle Injektion oder mit Hilfe eines automatischen Probennehmer, dass die Proben von einer 96-Well-Platte. Die beladenen Zellen werden durch einen Zerstäuber injiziert wird , die einen Sprühnebel aus Flüssigkeitströpfchen erzeugt , um die Zellen einkapseln (Abbildung 1II). Dieses Spray wird so positioniert, dass die Zellen durch einen Argonplasmabrenner ionisiert werden. Diese Ionisierung erzeugt eine Partikelwolke aller konstituierenden Atome jeder Zelle (Abbildung 1III) umfasst. Da diese Partikelwolke zu dem Detektor bewegt werden geringe Atommassen Atome aus den Ionen mit hohen Masse durch einen Quadrupol-Massenfilter getrennt. Die verbleibenden Ionen mit hohen Masse weiter zu dem Detektor, wo der abundance jedes Isotop wird (Abbildung 1IV) quantifiziert. Die Rohdaten vom Detektor gesammelt werden, werden von den Massen Cytometry Gerätesoftware analysiert, um Zellereignisse zu identifizieren. Für jedes identifizierte Zelle Ereignis, das Signal in jedem Kanal detektiert wird quantifiziert und mit einem Ausgang .fcs Datei gespeichert. Die Massenkanäle verwendet für das Schwermetall konjugiert Nachweis von Antikörpern eine minimale spektrale Überlappung, die mit den meisten Beiträgen unter 1% von 0-4% liegt. Aufgrund dieses geringen Übersprechens zwischen den Kanälen, ist es in der Regel nicht erforderlich , die Daten mit einer Kompensationsmatrix vor der Analyse 2 zu transformieren. Allerdings sollte Sorgfalt bei der Gestaltung der experimenteller Gruppe von Antikörpern getroffen werden, um sicherzustellen, dass ein Antikörper mit einem Hochfluss-Epitop nicht zu einem Masse Kanal zugeordnet ist, das Signal an einen Kanal zu einem Low-Fülle-Antikörper, da dies zugewiesen trägt eine künstlich hohe Population in dem Kanal erzeugt den Signalbeitrag zu empfangen.

Die genaue Vorbereitung von Proben für Massen Zytometrie-Analyse ist in hohem Maße abhängig von den Typen von Proben gesammelt und die experimentelle Hypothese getestet. Wir stellen Beispiele für zwei Protokolle für die Ernte verschiedene Arten von Zellen (menschliche embryonale Stammzellen) und primäre Zellen (Maus-Brusttumor-Epithelzelle Isolat). Wenn eine Masse Zytometrie Studie beginnen, ist es ratsam, einen kleinen Pilotversuch zum ersten führen, um sicherzustellen, dass alle Protokolle und Antikörpern genutzt werden arbeiten gut in der Hand des Prüfers. Dies ist besonders wichtig, wenn benutzerdefinierte sind konjugierte Antikörper verwendet werden, da die partielle Reduktionsreaktion während der Antikörper-Konjugation hat das Potenzial, Antikörperaffinität zu stören; Daher muss jeder individuelle Antikörper validiert werden empirisch Datengenauigkeit zu gewährleisten. Andere Überlegungen umfassen das Bestimmen, ob der Zelloberfläche Antikörper im Assay verwendet werden, werden ihre Epitope nach der Fixierung erkennen oder wenn sie need angewendet werden Zellen zu leben. Einige Fixierung verhindern richtige Färbung mit Antikörpern Zelloberfläche , wie bekannt ist , auftreten , die mit dem Peptid-MHC - Färbung 3, 4. Durchführen von Zelloberflächen - Antikörper - Färbung an lebenden Zellen kann für einige Antikörper erforderlich sein, aber dies schließt die Möglichkeit zur Antikörpermarkierung vor Strichkodierung da die meisten Strichcodes Verfahren nach der Fixierung durchgeführt werden , obwohl 5 Antikörper-basierte Strichkodierung 6, 7 ist eine Ausnahme.

Bei der Bestimmung der Anzahl von Zellen für die Analyse vorbereitet werden, ist es wichtig zu wissen, dass nur ein Bruchteil der auf die Maschine geladen Zellen werden die Daten erfasst werden und produzieren. Dieser Verlust ist hauptsächlich auf Ineffizienzen, wenn der Zerstäuber um die Probe bei der Fackel Sprays. Der genaue prozentuale Verlust hängt von der Masse Zytometrie Maschinenaufbau und Zelltyp, sondern kann von 50 bis 85% liegen und solltebetrachtet, wenn das Experiment zu entwerfen. Dieses Protokoll wurde für 2x10 6 Zellen pro Probe optimiert, kann aber für die Verarbeitung von kleineren oder größeren Probengrößen angepasst werden. Dieses Protokoll kann von 1 × 10 6 bis 4 x 10 6, mit minimalen Modifikationen für Probengrößen verwendet werden , aber es ist wichtig , dass Fallzahl innerhalb eines Versuchs konsistent gehalten werden. Änderungen in der Zellzahl können die Intensität von Barcodes und Antikörper-Färbung beeinflussen und sollte in etwa konsistent gehalten werden, über Proben direkt miteinander verglichen werden.

Einige Verfahren, wie tote Zellmarkierung und DNA-Markierung, sollen in der überwiegenden Mehrheit durchgeführt werden, wenn nicht alle experimentellen Designs. Die Kennzeichnung von toten Zellen in den Experimenten nur Oberflächenmarker Analyse kann mit Rh103 erreicht werden, aber Rh103 sollte für Experimente vermieden werden, in denen Permeabilisierung erforderlich ist, wie es in Färbung Verlust zur Folge hat. Für Experimente mit Permeabilisierung, ist es ratsam, Cisplatin zu nutzen 8 und, wenn möglich, ein Antikörper gespalten PARP oder gespalten Caspase erkennt apoptotischen und tote Zellen zu erkennen.

Strichkodierung Proben können Antikörper Verbrauch verringern Erfassungszeit reduzieren und eliminieren Probe zu Probe Variabilität 9. Der Prozess der Strichkodierung beinhaltet einen einzigartigen probenspezifischen Code für alle Zellen Anwendung, die verwendet wird, um jede Zelle in seine Ursprungsprobe zuzuordnen. Nachdem die Proben Strichkodierung kann vor der Antikörperfärbung gepoolt werden, ein Verfahren, dass alle Proben gefärbt werden gleichermaßen gewährleistet. Um experimentelle Fehler zu minimieren, ist es ratsam, auf Barcode und bündelt alle Proben, die direkt miteinander verglichen werden. Derzeit gibt es mehrere Methoden für Strichkodierung Proben für Massen Zytometrie Analyse 5, 6, 7, von denen zwei hier vorgestellt werden (siehe unten).

Mit derzeit erhältlichen reagents ist es möglich , die Fülle von 38 Antikörper Targets identifizieren Zellen in S-Phase 10, unterscheiden lebenden und toten Zellen und 8 messen zelluläre Niveaus von Hypoxie 11 in einem gemultiplexten Experiment mehrerer Proben zu quantifizieren. Diese Fähigkeit , hohe Parameter Einzelzellendaten für große Zellpopulationen zu sammeln , ermöglicht eine verbesserte Profilieren von sehr heterogenen Zellpopulationen und hat bereits eine Reihe von neuartigen biologischen Erkenntnissen 12, 13, 14, 15, 16 hergestellt. Destillieren der resultierenden komplexen Daten auf interpretierbare Informationen hat 18 die Verwendung von Computer - Algorithmen , einschließlich Spanning Tree Progression der Dichte Normalized Ereignisse (Pik) 17 und Visne erforderlich.

Dieser Artikel stellt eine leicht zugänglicheÜberblick darüber, wie zu entwerfen und eine Masse-Zytometrie Experiment durchzuführen und stellt grundlegende Analyse von Massendaten-Zytometrie.

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Protocol

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1. Zellernte

  1. Ernten von Zellen von primärem Gewebe
    HINWEIS: Das Verfahren zum Ernten von Zellen aus Primärgeweben beschrieben ist spezifisch für Maus-Brusttumorgewebe und kann nicht anwendbar sein, wie an primäre Gewebe aus anderen Quellen ist.
    1. Bereiten Verdauungspuffer durch Auflösen von 5 mg Hyaluronidase und 30 mg Kollagenase in 10 ml DMEM / F12-Medium pro Gramm Gewebe verarbeitet werden. Filter Verdauungspuffer sterilisieren.
    2. Isolieren primären Brustdrüsentumor aus der Maus und aufzeichnen Tumorgewicht.
    3. Mince Gewebe mit # 10 Skalpell für mindestens 5 min.
    4. Hinzufügen zerkleinerte Gewebe zu geeigneten Volumen Verdauungspuffer (10 ml Puffer pro Gramm Gewebe).
    5. Schütteln zerkleinerte Gewebe in Verdauungspuffer bei 100 Umdrehungen pro Minute für 1-3 h bei 37 ° C.
    6. Erhalten Einzelzellsuspension von Zellen, die durch 0,4-um-Filter in ein 50 ml-Röhrchen übergeben.
    7. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 10 min bei 4 & deg;; C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    8. Resuspendieren des Pellets in 4 ml DMEM / F12 und Transfer in 5 ml Rundbodenrohr.
  2. Ernten von Zellen aus Gewebekultur
    1. Waschplatte oder Kolben von adhärenten Zellen, die mit Calcium und Magnesium-freier phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die Technik zum Ernten von Zellen beschrieben ist speziell anwendbar menschliche embryonale Stammzellen (hES) Kulturzellen haftend. Jedoch ist der Rest des beschriebenen Protokolls breit anwendbar auf andere gezüchteten Zelllinien, nicht adhärenten Linien und Primärzellen.
    2. Hinzufügen wärmten (37 ° C) Trypsin oder andere enzymatische Verdauung Reagens optimiert, um eine Einzelzellsuspension von den adhärenten Zellen zu erreichen. Folgen Protokoll des Herstellers.
      HINWEIS: Trypsin und andere enzymatische Dissoziation Reagenzien haben das Potenzial, zelluläre Marker zu beeinflussen.
    3. Inkubiere die Platte bei 37° C für 2-5 min Zellen abzulösen. Für hohe Konfluenz Kulturen, tippen Sie vorsichtig die Platte, um die Zellen zu lösen.
    4. Überträgt vollständig abgelösten Zellen von der Platte in ein 5-ml-Röhrchen mit runden Boden und sanft pipettieren eine 1-ml-Pipette unter Verwendung von Zellen zu dissoziieren.
      HINWEIS: Für die Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben alle Schritte können alternativ in einer 96-Well-Rundbodenplatte durchgeführt werden. Für die Verarbeitung von Proben in ein 96-Well-Format können alle Waschungen bei einem Volumen von 250 & mgr; l durchgeführt werden. Die Volumina in anderen Schritten beschrieben ist, kann eingestellt werden, um das Gesamtvolumen von 300 & mgr; l nicht übersteigt.
    5. Quenche das enzymatische Verdauung Reagens mit einem gleichen Volumen Waschpuffer (0,5% BSA und 0,02% Natriumazid in PBS).
      HINWEIS: Natriumazid eine gefährliche Chemikalie ist. Die richtige Sicherheitsvorkehrungen müssen zu seiner Herstellung und Handhabung zu beachten.
    6. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 37 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    7. resuspendierenZellen in 1 ml serumfreiem Medium.
    8. Zählen von Zellen durch die Übertragung von 10 ul der Zellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte Aliquots auf ein bekanntes Verhältnis in Trypanblau und Übertragung auf einen Hämozytometer oder automatisierte Zellzählsystem.
  3. Kennzeichnung von S-Phasen - Bevölkerung
    HINWEIS: Wenn S-Phasen-Kennzeichnung ist nicht durchgeführt werden, gehen 1,4 einzudämmen.
    1. Bereiten 1 ml 10 & mgr; M 5-Iod-2'-desoxyuridin (IDU) in serumfreiem DMEM F12 oder anderen geeigneten Medien für je 2 x 10 6 Zellen analysiert werden.
    2. Gib 500 ul 10 uM IdU in serumfreiem Medium für je 2 x 10 6 Zellen.
      HINWEIS: Während IdU Markierung kann in Medien durchgeführt werden, das Serum enthält, wird freies Protein mit Cisplatin reagieren, korrekte Kennzeichnung von toten Zellen zu verhindern. Wenn Medien Serum, das während IdU verwendet wird Beschriftung ein zusätzlicher Waschschritt ist Serum freie Medien ist notwendig, Serumproteine ​​vor Cisplatin Live / Dead sta zu entfernenining.
    3. resuspendieren sanft Pellets mit 1-ml-Pipette.
    4. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C unter leichtem Schütteln.
  4. Live / Dead Kennzeichnung
    1. Für jede Probe vorzubereiten 500 ul 50 uM Cisplatin in serumfreiem DMEM-F12 oder Zellart geeigneten Medien.
      HINWEIS: Wenn die Kennzeichnung der S-Phase Population von IdU nicht durchgeführt werden, Resuspendieren Proben bei einer Konzentration von 4 x 10 6 Zellen / ml. für einheitliche Live / Dead Kennzeichnung Resuspendieren der Zellen vor Cisplatin Zugabe schnelle Durchmischung von Lösungen ermöglicht.
    2. In 500 ul von 50 uM Cisplatin pro 2 × 10 6 Zellen zu den Proben.
    3. Inkubieren bei Raumtemperatur (RT) für 1 min auf einem Schüttler unter konstantem Mischen.
    4. Quenche die Cisplatin mit einem gleichen Volumen Waschpuffer.
    5. Centrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei RT. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    6. Wash Proben zweimalmit 500 & mgr; l Waschpuffer, um überschüssige Cisplatin zu entfernen.
    7. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l PBS überschüssigem Protein zu entfernen.
  5. Beispiel Fixierung
    1. Resuspendieren Probe in 500 & mgr; l PBS.
    2. Hinzufügen gleiche Volumen von 4% PFA in PBS auf eine Endkonzentration von 2%; Pipette zu mischen.
      HINWEIS: Herstellung von 4% PFA frisch aus Pulver, pH auf 6,9 einzustellen, und ein 0,44 um-Filter passieren. 4% PFA in PBS kann für bis zu zwei Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Vermeiden premade Formalin in Ampullen geliefert, sofern nicht speziell geprüft, wie es oft Metallverunreinigungen enthält, die mit den gemessenen Massenkanälen stören können. Geringere Konzentration von PFA ausreichend sein und dazu beitragen, die Wirkung der Fixierung auf Antikörper zu minimieren Bindung sollte aber empirisch getestet werden.
    3. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    4. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen without stören das Pellet.
    5. Waschproben mit PBS PFA-Lösung zu entfernen.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt können Proben kurz bei 4 ° C gelagert werden. Längere Lagerung bei 4 ° C kann zu einer Verschlechterung der Probe zur Folge hat und eine verminderte Färbung.

2. Barcodierung

HINWEIS: Während Methodik monoisotopischen Cisplatin Barcodes und Palladium Barcodes für die Nutzung gleichzeitig präsentiert wird, entweder verwendet unabhängig ganz oder vermieden werden kann, wenn nicht durch das Experiment erforderlich.

  1. Monoisotopischen Cisplatin Barcodierung
    HINWEIS: Da Cisplatin Barcodes und Cisplatin Lebend- / Tot-Färbung beruhen auf den Kanälen Pflege überlappen sollten, dass Hintergrund Cisplatin Lebend- / Tot-Färbung in den lebenden Zellen, da dies minimiert wird sichergestellt werden, kann mit der Genauigkeit des Cisplatin Barcode stören.
    1. Verdünne 1 mM monoisotopischen Cisplatin Stammlösungen zu 200 & mgr; M in PBS.
    2. für eACH einzigartige Cisplatin Barcode ein 1,5 ml - Röhrchen mit 500 & mgr; l PBS für je 2 x 10 6 Zellen herzustellen , den Strichcode empfangen.
    3. Zur Vorbereitung jeder eindeutigen Barcode jeweils anwendbaren monoisotopischen Cisplatin zu einer Endkonzentration von 200 nM hinzuzufügen.
    4. Die Zellen in 500 ul PBS pro 2 x 10 6 Zellen.
    5. In jede Probe ein gleiches Volumen der entsprechenden Barcode-Lösung.
    6. Inkubieren Proben bei RT für 5 min auf einem Schüttler unter konstantem Mischen.
    7. Cisplatin mit einem gleichen Volumen an Waschpuffer quenchen.
    8. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    9. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer überschüssige Cisplatin zu entfernen.
  2. Palladium Barcodierung
    HINWEIS: Palladium Barcodierung Reagenzien können im Handel entweder bereit , 5 oder gekauft werden.
    1. Vorübergehende TeilPermeabilisierung 19
      HINWEIS: Palladium Chelat Strichkodierung Teil Permeabilisierung erfordert für die Reagenzien durch die Zellmembran passieren und robust die Zelle beschriften.
      1. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.
      2. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS plus 0,02% Saponin.
      3. Pellet in Restvolumen.
    2. Bewerben Palladium Barcodes.
      1. Verdünnte 100X Stammlösung von Palladium Strichkodierung Reagenz in 1 ml eiskaltem PBS plus 0,02% Saponin.
      2. Schnell verdünnte Strichkodierung Reagenz zu resuspendierten Probe hinzuzufügen.
      3. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler bei unter konstantem Mischen.
      4. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer.

3. Zeiloberflächenfärbung

HINWEIS: Die Zelloberflächenfärbung kann an lebenden Zellen vor der Fixierung durchgeführt werden. Dies kann zum Nachweis von Antikörpern notwendig sein, die Affinität zu verlieren für their Epitop nach der Fixierung. Einige Zellproben können von zusätzlichen Sperr profitieren, wie Fc Blockierung für Leukozyten, vor der Antikörpermarkierung Hintergrund zu reduzieren. Optimale Blockierung sollte empirisch für bestimmten Probentyp bestimmt werden.

  1. Bereiten Zelloberflächenantikörperfärbung Tafel.
    1. Kombinieren 0,5 ul oder empirisch ermittelten Menge jeden 0,5 mg / ml Zelloberflächen-Antikörper pro Probe in ein 1,5 ml Röhrchen. In Puffer Waschen bei Bedarf Volumen pro Probe bis 10 & mgr; l zu bringen. Mischen durch Pipettieren.
      HINWEIS: Bestimmen Sie für jeden Antikörper vor dem Experiment empirisch durch Titrationsexperiment Arbeitsverdünnung.
    2. Split Zelloberflächenantikörperpool zu gleichen Teilen in ein 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe zu gefärbt werden.
    3. Bereiten 500 ul Waschpuffer in einem 1,5 ml-Röhrchen für jede Probe.
  2. Anwenden Zelloberflächenfärbung zu Proben in normalisierten Volumen für alle Proben.
    HINWEIS: Um ensure konsequente Antikörpermarkierung über mehrere Proben ist es wichtig, das Probenvolumen und Antikörperkonzentration sorgfältig zu kontrollieren. Die folgenden Schritte zielen diese Konsistenz zu erreichen, indem sichergestellt wird, dass die endgültige Probenvolumina nach dem Antikörper einheitlich ist hinzugefügt worden.
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Mit einer 200 & mgr; l-Pipette auf 50 & mgr; l, entfernen von Probepellet und in ein Rohr des aliquotiert Zelloberflächenantikörperpools verbleibenden Lösung.
    3. Pipette bis alle Flüssigkeit in dem Rohr Aliquot ohne Luft in die Pipettenspitze zu ziehen.
    4. Halten der Pipetten Plunger Luft zu vermeiden Ziehen der Spitze in eine vorbereitete Rohr von 500 ul Waschpuffer und bewegen den Kolben freizugeben.
    5. Fügen Sie den Inhalt der Pipettenspitze auf die Probe zurück und resuspendieren die Probe in der Flüssigkeit mit vorsichtigem Pipettieren.
    6. Inkubiere die Proben für 1h bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    7. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer, um sicherzustellen, dass alle freien Antikörper weggewaschen wird.
    8. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.
    9. Resuspendieren des Zellpellets in 500 & mgr; l PBS.
    10. Hinzufügen gleiche Volumen von 4% PFA in PBS; Pipette zu mischen.
    11. Inkubieren für 10 Minuten auf einem Orbitalschüttler.

4. Zellpermeabilisierung und intrazelluläre Färbung

  1. Zellpermeabilisierung
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Die Zellen in Restvolumen durch vorsichtiges Vortexen, bis das Pellet dissoziiert wird.
      HINWEIS: Failure Zellen dissoziieren vor Zugabe MeOH in Zellen führt aneinander haften und einen Dünnfilm erzeugen, die in Teilprobenverlust führen.
    3. Schnell in 1 ml 100% MeOH pro 2 x 10 6 </ Sup> Zellen und sanft Pipette zu mischen.
      Hinweis: andere Permeabilisierung Verfahren können für MeOH substituiert werden und kann erforderlich sein, eine optimale Permeabilisierung für einige Zelltypen zu erreichen. Für einige Zellquellen ein 0,1% Triton X-100, 0,2% Tween-20 oder 0,1% Saponin in PBS-Lösung für Permeabilisierung kann Zellintegrität besser halten, während immer noch konsistente Permeabilisierung bereitstellt.
    4. mindestens 1 h oder bis zu maximal 24 Stunden bei 4 ° C für Permeabilisierung inkubieren Proben.
      HINWEIS: Bei diesem Schritt Proben in Methanol können für bis zu 1 Monat bei -80 ° C gelagert werden.
    5. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    6. 1 ml Waschpuffer für jeden ml MeOH verwendet, um die Probe permeabilisieren. resuspendieren sanft Zellpellet.
    7. Waschprobe zweimal mit 500 & mgr; l Puffer waschen.
  2. Bereiten intrazellulären Antikörperfärbung Tafel.
    1. Kombinieren 0,5 ul oder empirisch ermittelten Menge jedes 0,5 mg / ml intrazellulär Antikörper pro Probe in ein 1,5 ml Röhrchen. In Puffer Waschen bei Bedarf Volumen pro Probe bis 10 & mgr; l zu bringen. Mischen durch Pipettieren.
    2. Split intrazellulärem Antikörperpool zu gleichen Teilen in ein 1,5-ml-Röhrchen für jede Probe.
    3. Bereiten 500 ul Waschpuffer in einem 1,5 ml-Röhrchen für jede Probe.
  3. Tragen Sie die intrazelluläre Färbung an Proben in normalisierten Volumen für alle Proben.
    HINWEIS: Um eine konsistente Antikörpermarkierung über mehrere Proben sicherzustellen, ist es wichtig, das Probenvolumen und Antikörperkonzentration sorgfältig zu kontrollieren.
    1. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    2. Mit 200 & mgr; l-Pipette auf 50 ul eingestellt Beseitigung der verbleibenden Lösung aus Probepellet und in ein Rohr des aliquotiert Zelloberflächenantikörperpools.
    3. Pipettebis die gesamte Flüssigkeit in dem Rohr Aliquot ohne Luft in die Pipettenspitze zu ziehen.
    4. Halten der Pipetten Plunger Luft zu vermeiden Ziehen der Spitze in eine vorbereitete Rohr von 500 ul Waschpuffer und bewegen den Kolben freizugeben, Waschpuffer für eine Gesamtprobenvolumen von 50 & mgr; l der Erstellung.
    5. Fügen Sie den Inhalt der Pipettenspitze auf die Probe zurück und resuspendieren die Probe in der Flüssigkeit mit vorsichtigem Pipettieren.
    6. Inkubiere die Proben für 1 Stunde bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
    7. Wash Proben zweimal mit 500 & mgr; l Waschpuffer.
    8. Wasch Proben mit 500 & mgr; l PBS.

5. Iridium Kennzeichnung

  1. Fix Proben
    1. Resuspendieren Proben in 500 ul PBS.
    2. In 500 & mgr; l von 4% PFA in PBS.
    3. Inkubieren Sie für mindestens 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
  2. Bewerben Iridium Markierung von DNA
    1. Verdünne das 125 uM 500x Iridium interkalierenden Reagenz in 4% PFA auf eine Konzentration von 62,5 nM in PBS.
    2. In 500 ul 62,5 nM Iridium PFA-Lösung zu den Proben.
      HINWEIS: Für Experimente permeabilisierten Zellen, verdünnt die 500x Ir191 / 193 Lager für eine endgültige Verdünnung von 1: 2.000 bis overstaining zu vermeiden.
    3. Inkubieren für 15 min bei RT auf einem Orbitalschüttler unter konstantem Mischen.
      HINWEIS: Wenn monoisotopischen Cisplatin Barcodes Durchführung brüten nicht Proben mit Iridium länger als 15 min, da starke Ir193 Signale an den Pt194 Massenkanal beitragen können und sich negativ auf die Qualität auswirken Barcodes.
    4. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
    5. Waschproben zweimal mit 500 & mgr; l 0,1% BSA in gefiltertem deionisiertem Wasser.
      HINWEIS: Wenn innerhalb von 24 h empfehlen wir die laufenden Proben hergestellt, wenn möglich. Vorbereitete Proben können kurzfristig bei 4 ° C gelagert werden,aber darauf zu achten, Abbau zu vermeiden. Wenn möglich, sollten die endgültigen Waschungen in gefiltertem deionisiertem Wasser ohne BSA durchgeführt werden, da dies die Ablagerung auf dem Sprühkammer und sampler Konen der Maschine zu verringern, die Instrumentenreinigung verringern. Für hESCs ist es notwendig, diese Waschungen durchzuführen, während einschließlich BSA Probenverlust vom Kleben an die Rohroberfläche zu vermeiden.

6. Bereiten Sie die Proben für Acquisition

  1. zählen von Zellen
    1. Die Zellen in 500 & mgr; l 0,1% BSA in gefiltertem deionisiertem Wasser und das Filter in ein frisches Röhrchen durch eine 35 & mgr; m Zellsieb Kappe.
      HINWEIS: Eine Senkung der BSA-Pegel für die endgültigen Waschungen verringert den Rückstand auf der Zytometrie Vernebler Masse verlassen. Nicht-adhärente Zellen können in gefiltertem deionisiertem Wasser gewaschen und wieder suspendiert werden.
    2. Zählen von Zellen durch die Übertragung von 10 ul der Zellsuspension in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Verdünnte Aliquots auf ein bekanntes Verhältnis inTrypanblau (mit Zell Visualisierungen zu unterstützen) und in einem Hämozytometer oder automatisierte Zellzählsystem.
    3. Centrifuge Zellen bei 300 · g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren oder den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören.
  2. Vorbereiten und Lastproben
    1. Zur Herstellung von Kalibrierungsperlen aus dem Kühlschrank entfernen und kräftig schütteln, zu suspendieren.
    2. Wenn Proben laufen eine Masse Cytometry automatischen Probennehmer verwendet wird, werden 50 & mgr; l von Kalibrierungsperlen in jede Vertiefung der Probenplatte dann die gewünschte Anzahl von Zellen hinzuzufügen analysiert werden. Wenn Lauf Proben durch manuelle Injektion 50 & mgr; l Perlen der Kalibrierung hinzuzufügen abzutasten, verdünnte Probe in entionisiertem Wasser filtriert, gut mischen und Belastungsprobe in die Massen Cytometry Probeneinspritzöffnung. Die geeignete Probenverdünnung kann in Abhängigkeit vom Zelltyp abhängig analysiert werden, aber eine Verdünnung von 10 6 ist im Allgemeinen angemessen 1.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll kann hier im Großen und Ganzen auf eine große Vielfalt von gezüchteten und primären Zellproben mit nur geringfügigen Modifikationen angewandt präsentiert werden. Je nach den Anforderungen des Experiments, kann es in einer modularen Art und Weise durchgeführt werden, wenn bestimmte Elemente, wie Barcodes oder Zelloberflächenfärbung, sind nicht erforderlich. Verwendetes in seiner Gesamtheit ermöglicht dieses Protokoll, um die Herstellung von Massen gemultiplexten Cytometry Pr...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das Protokoll hier vorgestellten wurde für die Verarbeitung von verschiedenen kultivierten Zelllinien (H1 und H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) und primäre Gewebeproben (Maus-Knochenmark, embryonale Maus-Leber, Maus Erwachsenen erfolgreich eingesetzt Leber, die Maus-Tumor). Unabhängig von der Quelle, jedes Gewebe, das in einzelne Zellen dissoziiert werden kann, während der zelluläre Zustand bewahren sollte Zytometrie zur Analyse von Massen zugänglich sein, sondern kann eine Protokolloptimierung erforde...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

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Die Arbeit im Barton-Labor wurde durch einen Zuschuss des Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471) unterstützt. Diese Forschung wurde zum Teil durch ein Ausbildungsstipendium für Ryan L. McCarthy vom National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299 unterstützt. Die Core Facility, die das Massenzytometriegerät wartet und betreibt, wird durch CPRIT Grant (RP121010) und NIH Core Grant (CA016672) unterstützt.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
mTeSR1 Medium KitStammzellentechnologien05850Vor Gebrauch bei Raumtemperatur
erwärmen DMEM F-12ThermoFisher11330-032Warm bei 37  ° C vor Gebrauch
AccutaseStem Cell technologies07920Warm bei 37  ° C vor dem Gebrauch
RinderserumalbuminEquitechBAH62
phosphatgepufferte KochsalzlösungHyklonSH30256.01
SaponinSigma-Aldrich47036
Zell-ID Pt194FluidigmBereitgestellt bei 1  mM
cell ID pt195fluidigmbereitgestellt bei 1  mM
cell ID pt196fluidigmbereitgestellt bei 1  mM
CisplatinEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Löslich bis 25  mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding KitFluidigm201060
5-Iod-2'-DesoxyuridinSigma-AldrichI7125Löslich bis 74  mg/ml in 0,2  N NaOH
Rhodium 103 IntercelationsmittelFluidigm201103A
MethanolFisherBP1105-4Kühlen bei -20  ° C vor Gebrauch
NatriumazidSigma-AldrichS2002
5 mL Röhrchen mit rundem BodenFalcon352058
5 mL 35 μ m FilterkappeRöhrchen Falcon352235
EQ Vier-Elemente-KalibrierperlenFluidigm201078
Hyaluronidase Typ I-SSigma-AldrichH3506
Kollagenase aus Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Einweg-Skalpell #10Sigma-AldrichZ69239
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References

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