Methodenartikel

Probenvorbereitung für die Massen Cytometry-Analyse

DOI:

10.3791/54394

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29. April 2017

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1Epigenetics and Molecular Carcinogenesis, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieser Artikel beschreibt die Entnahme und Verarbeitung von Proben für die Massenzytometrie-Analyse.

Zusammenfassung

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Massen-Zytometrie verwendet mit Schwermetalletiketten konjugierte Antikörper, ein Ansatz, der stark erhöht die Anzahl der Parameter und Möglichkeiten für tiefe Analyse weit über hat, was möglich ist mit herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie. Wie bei jeder neuen Technologie gibt es wichtige Schritte, die die zuverlässige Erzeugung von qualitativ hochwertigen Daten sicherzustellen. Dargestellt ist hier ein optimiertes Protokoll, das mehrere Techniken für die Verarbeitung von Zellproben für die Massen Zytometrie Analyse einbezieht. Die hier beschriebenen Methoden helfen dem Benutzer häufige Fehler zu vermeiden und konsistente Ergebnisse erzielen durch Variabilität zu minimieren, die zu ungenauen Daten führen kann. Um experimentelles Design zu informieren, die Gründe für optionale oder alternative Schritte in dem Protokoll und ihre Wirksamkeit bei der Aufdeckung neue Erkenntnisse in der Biologie des Systems wird untersucht, behandelt. Schließlich wird repräsentative Daten vorgelegt erwarteten Ergebnisse der Techniken presente zu illustrierenhier d.

Einleitung

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Cytometry ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Antikörper Ziele in einer einzelnen Zelle Ebene über große Populationen von Zellen. In herkömmlichen fluoreszenzbasierten Durchflusszytometrie, die Anzahl der Parameter, die quantifiziert werden kann, wird durch spektrale Überlappung zwischen dem Emissionsspektrum von mehreren Fluorophoren begrenzt, die immer komplexer werdenden Kompensationsberechnungen wie die Anzahl der Parameter ansteigt erfordert. Diese Einschränkungen werden durch Massen adressiert Cytometry, wo Schwermetall-konjugierten Antikörper nachgewiesen werden, und durch Flugzeit (TOF) Massenspektrometrie quantifizieren stark die Anzahl der Paramet....

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Protokoll

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1. Zellernte

  1. Ernten von Zellen von primärem Gewebe
    HINWEIS: Das Verfahren zum Ernten von Zellen aus Primärgeweben beschrieben ist spezifisch für Maus-Brusttumorgewebe und kann nicht anwendbar sein, wie an primäre Gewebe aus anderen Quellen ist.
    1. Bereiten Verdauungspuffer durch Auflösen von 5 mg Hyaluronidase und 30 mg Kollagenase in 10 ml DMEM / F12-Medium pro Gramm Gewebe verarbeitet werden. Filter Verdauungspuffer sterilisieren.
    2. Isolieren primären Brustdrüsentumor aus der Maus und aufzeichnen Tumorgewicht.
    3. Mince Gewebe mit # 10 Skalpell für mindestens 5 min.
    4. Hinzufügen zerklei....

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Ergebnisse

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Das Protokoll kann hier im Großen und Ganzen auf eine große Vielfalt von gezüchteten und primären Zellproben mit nur geringfügigen Modifikationen angewandt präsentiert werden. Je nach den Anforderungen des Experiments, kann es in einer modularen Art und Weise durchgeführt werden, wenn bestimmte Elemente, wie Barcodes oder Zelloberflächenfärbung, sind nicht erforderlich. Verwendetes in seiner Gesamtheit ermöglicht dieses Protokoll, um die Herstellung von Massen gemultiplexten Cytometry Pr.......

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Diskussion

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Das Protokoll hier vorgestellten wurde für die Verarbeitung von verschiedenen kultivierten Zelllinien (H1 und H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10A) und primäre Gewebeproben (Maus-Knochenmark, embryonale Maus-Leber, Maus Erwachsenen erfolgreich eingesetzt Leber, die Maus-Tumor). Unabhängig von der Quelle, jedes Gewebe, das in einzelne Zellen dissoziiert werden kann, während der zelluläre Zustand bewahren sollte Zytometrie zur Analyse von Massen zugänglich sein, sondern kann eine Protokolloptimierung erforde.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Arbeit im Barton-Labor wurde durch einen Zuschuss des Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471) unterstützt. Diese Forschung wurde zum Teil durch ein Ausbildungsstipendium für Ryan L. McCarthy vom National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299 unterstützt. Die Core Facility, die das Massenzytometriegerät wartet und betreibt, wird durch CPRIT Grant (RP121010) und NIH Core Grant (CA016672) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
mTeSR1 Medium KitStammzellentechnologien05850Vor Gebrauch bei Raumtemperatur
erwärmen DMEM F-12ThermoFisher11330-032Warm bei 37  ° C vor Gebrauch
AccutaseStem Cell technologies07920Warm bei 37  ° C vor dem Gebrauch
RinderserumalbuminEquitechBAH62
phosphatgepufferte KochsalzlösungHyklonSH30256.01
SaponinSigma-Aldrich47036
Zell-ID Pt194FluidigmBereitgestellt bei 1  mM
cell ID pt195fluidigmbereitgestellt bei 1  mM
cell ID pt196fluidigmbereitgestellt bei 1  mM
CisplatinEnzo Life SciencesALX-400-040-M250Löslich bis 25  mg/ml in DMSO
Cell-ID 20-plex Pd Barcoding KitFluidigm201060
5-Iod-2'-DesoxyuridinSigma-AldrichI7125Löslich bis 74  mg/ml in 0,2  N NaOH
Rhodium 103 IntercelationsmittelFluidigm201103A
MethanolFisherBP1105-4Kühlen bei -20  ° C vor Gebrauch
NatriumazidSigma-AldrichS2002
5 mL Röhrchen mit rundem BodenFalcon352058
5 mL 35 μ m FilterkappeRöhrchen Falcon352235
EQ Vier-Elemente-KalibrierperlenFluidigm201078
Hyaluronidase Typ I-SSigma-AldrichH3506
Kollagenase aus Clostridium histolyticumSigma-AldrichC9891
Einweg-Skalpell #10Sigma-AldrichZ69239
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Referenzen

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  1. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398(2012).
  2. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015....

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Schlagwörter

Zellf rbungCisplatin MarkierungAntik rper CocktailIridium MarkierungSPADE AlgorithmusDurchflusszytometrieEinzelzellanalyseZellpermeabilisierung

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