CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

Summary

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

Abstract

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Die äußere Schicht der Epidermis besteht aus den interfollikulären Epidermis, die eine geschichtete Plattenepithel ist die meisten unserer Körper abdeckt und epidermalen Anhangs wie die Haarfollikel und Schweißdrüsen. Die Epidermis erfährt Regeneration während des Lebens und in Reaktion auf eine Verletzung. Dies wird ermöglicht durch K14-exprimierenden basal epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen, die von mehreren Regulationsmechanismen streng reguliert werden aktiv in der Epidermis und zwischen Epidermis und Dermis. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, mit voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und K14-Protein-Expressionsmuster visualisieren, Ki67 Zellen markiert wuchernden, Nile Red markierten Sebozyten und DAPI Kern Kennzeichnung auf Einzelzell Auflösung in 3D. Diese Methode ermöglicht eine genaue Bewertung und Quantifizierung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. Das CUBIC-Protokoll ist the beste Methode bisher verfügbaren molekularen und zellulären Wechselwirkungen in Vollhautbiopsien bei einzelnen Zelle Auflösung zu untersuchen.

Introduction

Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Es besteht aus drei Hauptschichten die äußeren Epidermis, die Dermis und die Hypodermis. Die Epidermis ist ein hoch regenerative Gewebe. Es ist ein Plattenepithelkarzinom geschichteten Epithels, bestehend hauptsächlich aus Keratinozyten. Keratinozyten sind in der basalen Schicht geboren und nach oben durch die Suprabasalschichten bewegen, während Differenzierung, und schließlich werden sie in der äußeren Hornschicht etwa einen Monat nach ihrer Geburt zu vergießen. Die Epidermis entsteht eine Reihe von Anhängsel einschließlich der Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Haarfollikel regenerieren auch in einer zyklischen Art und Weise während des gesamten Lebens ^1. Die regenerative Kapazität der Epidermis wird durch die Anwesenheit von Stamm- und Vorläuferzellen aktiviert , die in der Basalschicht der Epidermis und interfollikulären Haarfollikel ² befinden.

Viele Signalwege wurden in epidermalen Entwicklung und Regeneration gebracht. Einige davon treten innerhalbdie Epidermis nur, wie das Hedgehog-Weg. Andere Signalereignisse stattfinden zwischen Dermis und Epidermis ^3. Zum Beispiel Wnt - Signale von der Dermis sind gedacht für Haarfollikel - Entwicklung wichtig zu sein, und sie werden von der dermalen Papille zu Beginn der anagenen sekretiert Haarfollikel Ausbuchtung Stammzellen / Vorläuferzellproliferation und Haarfollikel Wachstum ⁴ aktivieren. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die den epidermalen Entwicklung und Regeneration zu steuern, besser zu verstehen, wie sie in der regenerativen Hautkrankheit gestört werden kann, wie Hautkrebs.

Dieser Artikel beschreibt eine C lear, nobstructed U B regen I maging Cocktails und C omputational Analyse (kubisch) Protokoll ^5-7 ganze Berg Hautpräparate zu klären und Proteinexpressionsmuster in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Die CUBIC Verfahren beinhaltet das Eintauchen HautGewebe in zwei Aminoalkohol-basierten chemischen Cocktails. Diese Lösungen stellen Sie die Brechungsindizes in der Hautprobe, so dass das Gewebe transparent und die Proteine ​​intakt, so dass Immunnachweis auf Einzelzellauflösung.

Mit diesem CUBIC-Protokoll, die basale und wuchernden Keratinozyten-Populationen in den interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel wurden in Vollhautbiopsien von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von Anti-Keratin14 (K14) und Anti-Ki67-Antikörper abgebildet. Talgdrüsen in Wildtyp- Hautbiopsien wurden auch Färbung mit Nile Red sichtbar gemacht. Schließlich wurden ⁸ verglichen die basalen Keratinozyten - Populationen in Wildtyp- und hyperplastischem YAP2-5SA-& Delta; C Hautbiopsien.

Dieses CUBIC-Protokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Proteinexpression in Vollhautbiopsien bei Einzelzellauflösung und ist ein wichtiges Instrument epidermalen Anatomie und morphologische Defekte in der Haut von gentechnisch veränderten zu schätzenMäuse und die zellulären und molekularen Mechanismen der epidermalen Entwicklung und Regeneration zu untersuchen.

Protocol

Ethikerklärung: Alle Verfahren unter Verwendung tierischer Probanden folgen den Richtlinien der Animal Care and Ethics Committee (ACEC) bei UNSW Australien unter ACEC genehmigten Protokoll 13 / 64B.

1. Vorbereitung der Transparent-Maus Hautgewebe

Anmerkung: Alle Mäuse in dieser Studie verwendet wurden, waren auf einer C57BL / 6 genetischen Hintergrund

1. Sammlung der Maushautgewebe.
   1. Human euthanize die Mäuse durch zervikale Dislokation.
   2. Sorgfältig Haare aus dem jeweiligen Hautbereich zu entfernen mit einem Trimmer kümmert sich nicht um die Haut zu verletzen.
   3. Haut mit 70% Ethanol in Phosphat-gepufferter Saline (PBS) zu dekontaminieren.
   4. Heben Sie dorsalen Halshaut mit einer Pinzette und machen Schnitt mit einer Schere.
   5. Sezieren einen großen Bereich der dorsalen Haut von Mäusen (ca. 1,5 x 4 cm).
   6. Flatten Haut Dermis-Seite nach unten auf einem Filterpapier, und notieren Sie sich die anterior-posteriore Ausrichtung der Probe.
   7. Trim Filterpapier um den sezierten Haut und in einem 15 ml Röhrchen mit frisch hergestelltem 4% Paraformaldehyd (PFA) -Lösung in PBS gefüllt.
   8. Fix für 1 h bei Raumtemperatur oder über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C.
   9. Waschen Sie die Haut 2 x 5 min in PBS in einem 15-ml-Tube.
      Hinweis: Die folgenden (1.1.10 - 1.1.12) sind optionale Schritte zur Langzeitlagerung von Gewebe.
   10. Dehydratisieren seziert Haut in PBS mit einer Konzentration von Ethanol Erhöhung (25%, 50% 70%) in einem 15 ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur.
   11. Lagern Sie dehydrierte Haut in 70% Ethanol in PBS in einem 15-ml-Röhrchen bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung.
   12. 4 Stunden vor dem Clearing, das Hautgewebe in PBS rehydriert mit Ethanolkonzentration abnimmt (70%, 50%, 25%, 0%) in einem 15-ml-Röhrchen während 1-stündigen Waschschritte bei Raumtemperatur.
2. Löschen der Maus Hautbiopsien
   1. Bereiten Sie die CUBIC1 Klärlösung durch Auflösen 3,85 g Harnstoff und 3,85 g N, N, N ', N'Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin in 5,38 ml Wasser auf die Heizung auf 60 eingestellt destilliert - 70 ° C. Verwenden Sie einen heißen Rührer.
   2. Hinzufügen, 2,31 g Polyethylenglykol-mono-p-isooctylphenylether / Triton X-100 zu der Lösung, wenn es klar ist, und auf Raumtemperatur abgekühlt.
   3. Schneiden Sie die Haut von Mäusen mit einer scharfen Rasierklinge in Biopsien von ungefähren Abmessungen 0,2 x 0,5 cm, und in 5 ml CUBIC1 Clearing-Lösung in einem 15-ml-Röhrchen versenken. Um die Visualisierung der Haarfollikel zu optimieren, dass die längere Seite der Biopsie entlang der antero-posterioren Richtung der Probe geschnitten wird.
   4. Platzieren auf einer rotierenden Plattform in einem Hybridisierungsofen bei 37 ° C.
   5. Ändern Sie den Clearing-Lösung nach 7 Tagen. Bereiten Sie frische CUBIC1 Lösung vor der Verwendung.
   6. Überprüfen Sie die Transparenz des Gewebes nach 7 Tagen. Bei Bedarf lassen Biopsien in CUBIC1 Clearing-Lösung, bis das Gewebe vollständig transparent ist.
   7. Sobald die Hautbiopsie ist transparent,Entfernen Sie die CUBIC1 Lösung und 4 ml 1 × PBS, das Gewebe 4 mal 6 Stunden bei 37 ° C zu waschen.
   8. Waschen Sie die Hautgewebe in 20% w / v Sucrose in PBS in einem 15 ml Röhrchen für 4 Stunden bei 37 ° C.
   9. Frieren Sie das Gewebe in Eindeckmediums optimale Schnitt Temperatur (OCT) Verbindung in einem 15-ml-Röhrchen über Nacht in einem -80 ° C Gefrierschrank.
      Hinweis: Dieser Schritt der Biopsie der Permeabilität für die Antikörper-Penetration in den nachfolgenden Schritten wird zunehmen.

2. Immunfluoreszenzanfärbung

1. Auftauen Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 - 3 Stunden.
2. Wasch Gewebe in der 15-ml-Röhrchen mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur OCT-Verbindung zu entfernen.
3. Transfer Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, und Inkubieren Gewebe in 1 ml Kaninchen-anti-Keratin14 oder Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörper, beide verdünnt 1: 100 in PBST (PBS + 0,1% Triton-X100) für 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C heißen Ofen.
4. Transfer-Biopsien in ein 15-ml-Röhrchen, einnd waschen Gewebe 4 mal für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen.
5. Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml Anti-Kaninchen-Alexa594 sekundären Antikörper 1: 100 verdünnt in PBST und Inkubation 3 Tage auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen.
6. Transfer Biopsien in ein 15 ml-Röhrchen und wasche 4 Mal Gewebe für 6 Stunden in 5 ml PBST auf einem Schüttler in einem 37 ° C-Ofen.
7. Transfer-Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen, 1 ml 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Kern counterstain Lösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen.
8. Entfernen DAPI Gegenfärbelösung und 1 ml PBST auf die 2-ml-Röhrchen Gewebe 4 mal 6 Stunden auf einem Schüttler in einem 37 ° C warmen Ofen zu waschen.
   Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden.

3. Nil-Rot-Färbung

1. Auflösen Nile Red Pulver in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Endkonzentration von 1 mg / ml
2. 1 & mgr; l Nile Red Lösung auf 1 ml PBS auf eine Endkonzentration von 1 & mgr; g / ml.
3. Auftau-Gewebe aus 1.2.9) auf Raumtemperatur für 2 bis 3 h und wasche mit 5 ml PBS für 8 h bei Raumtemperatur.
4. Übertragen Biopsien in ein 2-ml-Röhrchen und unterzutauchen Gewebe in 1 ml Nile Red Färbelösung 2,5 h bei Raumtemperatur.
5. Waschen Sie die Hautbiopsien in der 2-ml-Röhrchen mit 1 ml PBST 4 mal für 30 min bei Raumtemperatur.
6. Entfernen PBST-Lösung aus dem 2-ml-Röhrchen, 1 ml DAPI Kern Gegenfärbelösung (1: 1000) in PBST und Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur.
7. Entfernen DAPI Gegenfärbelösung, und fügen Sie 1 ml PBST im 2-ml-Röhrchen das Hautgewebe 4 mal 6 Stunden bei Raumtemperatur zu waschen.
   Hinweis: Optional Schritt: Biopsien können im Dunkeln in 1x PBS mit 0,02% Natriumazid für mindestens 3 Wochen gelagert werden.

4. Imaging

1. Bereiten Sie die CUBIC2 Clearing-Lösung, die 50 enthält% (W / v) Saccharose, 25% (w / v) Harnstoff, 10% (w / v) 2,2 ', 2' '- Nitrilotriethanol und 0,1% (v / v) Triton X-100.
2. Inkubiere das Hautgewebe in 1 ml CUBIC2 Lösung in einem 2-ml-Röhrchen auf einem Schüttler für 24 h in einem 37 ° C-Ofen. Dieser Schritt wird der Brechungsindex des Gewebes gleichmäßig.
3. Überprüfen Sie die Klarheit des Gewebes. Sobald es klar ist, positionieren die gesamte Hautbiopsie (0,2 x 0,5 cm) an seiner längeren Seite auf einem Deckglas, so dass die Richtung der Länge der Haarfollikel ist parallel zur Deckfläche (# 1 24 x 60 mm)
   Hinweis: Optional Schritt: Antikörper-gefärbten Biopsien für ungefähr 7 Tage in CUBIC2 Lösung gelagert werden. Nile Red-gefärbten Biopsien können nur für bis zu 1 Tag in CUBIC2 Lösung gelagert werden und sollte so schnell wie möglich abgebildet werden.
4. Bereiten Abbildungskammer (Abbildung 1)
   Hinweis: Verbrauchsmaterialien für die Herstellung der Abbildungskammer erforderlich sind: blau tack, Knete oder ähnlich, und zwei Deckgläser (24 x 50 mm) (Fild 1A).
   1. Bereiten Sie zwei dünne Streifen blau Tack (Durchmesser ca. 1 mm x 2 cm) und zwei Deckgläser (1B).
   2. Legen blau tack Streifen auf einem Deckglas, so dass genügend Platz für die Hautbiopsie (1C). 4.4.3)
   3. Platzieren Hautbiopsie in zwischen den Streifen auf dem Deckglas in einem Tropfen CUBIC2 Lösung (1C).
   4. Bedecken Hautbiopsie mit dem zweiten Deckglas (1D).
5. Setzen Sie die Druckkammer mit der montierten Hautbiopsie auf die Bühne eines konfokalen Mikroskops und das Gewebe in den Lichtweg zu bewegen.
6. Scannen Sie die Probe unter Verwendung eines Quecksilber oder Halogen - Lichtquelle und Standard - Epifluoreszenz - Filter (zB DAPI / GFP / Cy3 / Cy5) zu fluoreszierend gefärbten Regionen von Interesse zu identifizieren.
7. Bildbereiche von Interesse unter Verwendung eines 10X und 20X Objektiv (NA 0,75) und Standard - konfokale Fluoreszenz - Imaging - Techniken (z. B. mit DAPI gefärbten Proben beleuchten mit einem 405-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 425-475 nm und mit Alexa Fluor 594 oder Nile Red-gefärbten Proben beleuchten mit einem 561-nm-Laser und sammeln Fluoreszenzsignal zwischen 570-620 nm).
8. Generieren Bild Z-Stapel jeder Region von Interesse unter Verwendung des Mikroskops Z-Stapel Bildaufnahme - Software (z. B. unter Verwendung von NIS Elemente Imaging Software 4.13 wie unten beschrieben).
   1. Sorgen für eine optimale Laserleistung und PMT HV / Offset-Einstellungen ausgewählt wurden Probenfluoreszenz zu sammeln.
   2. Öffnen Sie die "ND Acquisition" Symbolleiste "Acquisition Controls".
   3. Wählen Sie "Z-Serie Setup" Register (sicherzustellen, dass alle anderen Registerkarten nicht ausgewählten) sind.
   4. Während Live-Scannen, den Fokus auf das obere Ende der Probe und drücken Sie die "Top" Taste.
   5. Fokus auf der Unterseite der Probe und drücken Sie die "Unten" -Taste.
   6. Eingabe erforderlich Schrittgröße (oder drücken Schrittgröße Taste optimiert).
   7. Vorss die "Run now" klicken.
   8. Speichern resultierende Z-Stapel als einzelne Tiff Bildstapel (1 Fluorochrom pro Bild Z-Stack).
9. Verwenden Bild Z-Stapel 3D - Volumen Regionen von Interesse mit Hilfe von 3D - Analyse - Software zu rekonstruieren (z. B. unter Verwendung von Imaris x64 7.2.3 wie unten beschrieben).
   1. Starten Sie Analyse-Software.
   2. Wählen Sie "Surpass" Button in der Toolbar für 3D-Volumen Generation.
   3. Öffnen erstes Farbbild Z-Stapel (z. B. DAPI).
   4. Verwenden Sie den "Channel hinzufügen" Tool zusätzliche Farbkanäle hinzuzufügen, einen Kanal pro Fluorochrom. So wird eine Probe sowohl DAPI und Alexa Fluor 594 Fluorochrome enthalten, werden zwei Kanäle erfordern.
   5. Verwenden Sie die "Bild-Eigenschaften" Werkzeug richtig Pixel (Voxel) Dimensionen (XYZ) zu setzen, wie in 4.7 oben bestimmt.
   6. Verwenden Sie "Display - Einstellung" Werkzeugkanal Farben nach Bedarf zu ändern (zB Set DAPI Kanal zu blau, Alexa Fluor 594 - Kanal rot).
   7. Um position das 3D-Volumen im Bildfenster, verwenden Sie die Computer-Maus nach Bedarf durch Klicken und Ziehen Volumen.
   8. Verwenden Sie den "Snapshot" Werkzeug in der Werkzeugleiste Screenshots des 3D-Bild zu erzeugen.
   9. Verwenden Sie die "Animation" in der Werkzeugleiste Filme von 3D-Probenrotation zu erzeugen.

Results

Volle Dicke dorsalen Hautbiopsien von erwachsenen Wildtyp - Mäuse wurden geklärt, gefärbt mit einem Antikörper - Bindung basalen Keratinozyten Marker Keratin14 (K14) und Kerne wurden counterstained mit DAPI - Färbelösung (Abbildung 2 und Film 1).

DAPI-positiven Kerne sichtbar waren in der gesamten Probe (2A, C) und K14 - Färbung sichtbar war ausschließlich in der Ein-Zelle dick Basalschicht der interfollikulären Epidermis, und umreißt die Ta...

Discussion

Die regulatorischen Mechanismen steuern Haut Entwicklung und Homöostase werden am häufigsten in 2D untersucht unter Verwendung von Gewebe Schnitte und histologischen Färbung oder die Markierung mit Antikörpern, die nur eine eingeschränkte Anerkennung der Hautmorphologie, Zellpopulationen oder Proteinexpression ermöglicht. Eine Anzahl von Verfahren wurden die Visualisierung der räumlichen Organisation von Zellen und Proteinen an Einzelzellauflösung in 3 Dimensionen in epidermal ganze Halterungen ^10-13 zu verbe...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6418
Ethanol 96% (nicht denaturiert)	Chem-supply	UN1170
Nilrot	Sigma-Aldrich	72485-100MG
4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)	Roche	10236276001
N,N,N',N' -Tetrakis (2-Hydroxypropyl)-, Ethylendiamin	, Merck Millipore	821940
Polyethylenglykolmono-p-isooctylphenylether	Merck Millipore	648462
Triton X-100	Merck Millipore	648462
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
Tissue-Tek	4583
Anti-Keratin14-Antikörper	Covance	PRB-155P
anti-Ki67-Antikörper	Abcam	ab16667
Esel Anti-Kaninchen Alexa 594	Life Technologies	A21207
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D2650
Harnstoff	Merck Millipore	66612
2,2′,2′ '-nitrilotriethanol	Merck Millipore	137002
Konfokalmikroskop	Nikon Instruments Inc Nikon A1	- Konfokalmikroskop
cruZer6 Gesichtstrimmer	Braun	Braun cruZer6 Gesicht
Natriumazid	Sigma-Aldbsp;