Summary
Her beskrives en fremgangsmåde under anvendelse af en permeabel insert-baserede infektion systemet membran for at studere virkningerne af Streptolysin S, et udskilt toksin produceret af gruppe A Streptococcus, på keratinocytter. Dette system kan let anvendes på studiet af andre udskilte bakterielle proteiner på forskellige vært celletyper under infektion.
Abstract
Mange bakterielle patogener udskiller potente toksiner til støtte i ødelæggelse af værtsvæv, at indlede signalændringer i værtsceller eller at manipulere immunsystemet reaktioner under infektionens forløb. Selvom fremgangsmåder er blevet udviklet med succes oprense og fremstille mange af disse vigtige virulensfaktorer, er der stadig mange bakterielle toksiner, hvis unikke struktur eller omfattende posttranslationelle modifikationer gør dem vanskelige at oprense og studere i in vitro systemer. Selv når der kan opnås rent toksin, der er mange udfordringer forbundet med at studere de konkrete virkninger af et giftstof i henhold til relevante fysiologiske betingelser. De fleste in vitro-cellekultur modeller designet til at vurdere virkningerne af udskilte bakterielle toksiner på værtsceller involverer inkubere værtsceller med en engangs-dosis af toksin. Sådanne fremgangsmåder dårligt tilnærme hvad værtsceller faktisk erfaring under en infektion, hvor toksin kontinuerligt produceret afbakterieceller og fik lov til at akkumulere gradvist i løbet af infektionen. Denne protokol beskrives udformningen af en permeabel membran insert-baserede bakterieinfektion system til at undersøge virkningerne af Streptolysin S, en potent toksin produceret af gruppe A Streptococcus, på humane epiteliale keratinocytter. Dette system efterligner nærmere det naturlige fysiologiske miljø under en infektion end metoder, hvor ren toksin eller bakterielle supernatanter anvendes direkte til værtsceller. Vigtigt er det, denne metode eliminerer også forspændingen af værtsresponser, der skyldes direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. Dette system er blevet udnyttet til at effektivt at vurdere virkningerne af Streptolysin S (SLS) på vært membran integritet, cellulær levedygtighed, og cellulære signalering svar. Denne teknik kan let påføres på studiet af andre udskilte virulensfaktorer på en række mammale vært celletyper at undersøge den specifikke rolle et udskilt bakteriel faktor dnder infektionens forløb.
Introduction
Forståelse funktionen af bakterielle virulensfaktorer i forbindelse med værtscellen infektion er et vigtigt fokus for bakteriel patogenese forskning. Mange bakterielle patogener udskiller aktivt toksiner og andre opløselige faktorer for at hjælpe til ødelæggelse af værtsvæv, at indlede signalændringer i værtsceller eller at manipulere immunsystemet reaktioner under infektion 1 - 10. Selvom fremgangsmåder er blevet udviklet med succes oprense og fremstille mange af disse vigtige virulensfaktorer til studier, nogle bakterielle produkter har unikke strukturer eller omfattende posttranslationelle modifikationer, der gør dem genstridige kandidater til oprensningsmetoder og kan således ikke undersøges isoleret under anvendelse af in vitro-systemer . For eksempel Gruppe A Streptococcus, det bakterielle patogen, som et utal af infektioner lige fra pharyngitis til nekrotiserende fasciitis og toksisk shock syndrom, producerer en secerneretbakterielt toksin kendt som Streptolysin S (SLS) 11 - 17. Dette ribosomalt produceret peptid kodes af Streptolysin S associerede gen (SAG) klynge, og det modne produkt er estimeret til 2,7 kDa i størrelse 14 -. 17 Protoksinet, der kodes af Saga, modificeres posttranslationelt med flere enzymer (SAGB, SagC, og SagD) for at fremstille det modne, funktionelle formular 15 -. 17 Kompleksiteten af disse post-translationelle modifikationer kombineret med toksinet usædvanlige aminosyresekvens har gjort toksinet uforenelig med alle rensning og Strukturopklaring indsats, der er forsøgt til dato 15,17. Disse udfordringer har komplicerede indsats for at bestemme den særlige rolle, dette toksin i vært patogenese.
I tilfælde, hvor udarbejdelsen af oprensede toksiner eller andre udskilles faktorer er enten komplekst eller ikke er mulig, mekanismer tilbelyse funktionen af disse produkter er traditionelt blevet undersøgt gennem udarbejdelse af filtrerede bakterielle supernatanter, som derefter anvendes til værtsceller 18-20. Der er flere udfordringer forbundet med denne teknik. Første er mange af disse udskilte faktorer, herunder SLS, ikke opretholde maksimal eller sammenhængende aktivitet, når lagring og værtsceller på et senere tidspunkt. Derudover, når supernatanter opsamles på et enkelt tidspunkt og derefter anvendt til værtsceller, er det vanskeligt at bestemme fysiologiske relevans og drage direkte konklusioner om den naturlige infektion proces, hvor udskilte faktorer får lov til at akkumulere under infektion til en fysiologisk relevant koncentration. Denne anden udfordring gælder ikke kun for anvendelsen af bakterielle supernatanter, men også anvendelsen af oprensede toksiner i værtscelleproteiner studier 1 - 3,8. For at løse disse problemer, en permeabel membran Insert-baserede infektion er udviklet til at vurdere virkningerne af SLS på værtsceller på en måde, som opretholder optimal toksin-aktivitet, og også eliminerer variabel for direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. I dette system er humane epitelceller dyrket i et monolag i bunden kammer i et to kammer brønd, og bakterier indføres i det øvre kammer i samme brønd. En porøs membran (0,4 um porer) adskiller de øvre og nedre kamre, så udskilte faktorer, der skal udveksles mellem de to kamre, men forhindrer passage af bakterier. Dette system har givet mulighed for effektiv evaluering af værtens reaktioner, der alene skyldes vedvarende udskilles bakterielle komponenter samtidig fjerne alle svar, der kan opstå ved direkte kontakt under gruppe A streptokok-infektion. Skønt andre udskilte bakterielle faktorer end SLS også kan passere gennem den porøse membran, anvendelse af en isogen mutant panel herunder vildtype (WT), en SLS-knockout (ΔsagA) og en saga suppleret stamme (ΔsagA + saga) giver mulighed for præcis evaluering af værtens reaktioner, der er strengt SLS-afhængige 21.
Selvom lignende permeable membran indsætte systemer er blevet anvendt til studiet af udskilte faktorer involveret i virusinfektioner, kræft biologi og immuncellemigrering 22-26, få studier, der involverer bakterielle interaktioner med værtsceller har udnyttet denne tilgang 6,27,28. Selv undersøgelser, som har beskæftiget sådanne systemer til at udforske interaktioner mellem bakterier og værtsceller har primært fokuseret på migration af inflammatoriske celler eller bakterier gennem en epitelial eller endotelmonolaget udpladet på den permeable membran insert. Den permeable membran insert-baserede infektion heri beskrevne er en enkel og effektiv metode, der bygger på adskillelse af bakterier og værtsceller via en porøs membran til at vurdere effects af det secernerede toksin, SLS, om værten membran integritet, cellulær levedygtighed, cellulær signaltransduktion, og udskilte værtscelleproteiner faktorer. Denne teknik kan tilpasses til studiet af andre udskilte virulensfaktorer på en række mammale vært celletyper til at undersøge den rolle, som en specifik bakteriel faktor i løbet af en infektion.
Protocol
1. bakteriekultur
- Generere isogene mutante stammer, der skal anvendes til studiet af specifikke udskilte faktor af interesse 21.
Bemærk: De GASM1T1 5448 stammer anvendt til disse eksperimenter inkluderet WT GAS ', en saga Δ kat SLS-mangel mutant (forkortet i teksten som Δ saga), og en saga suppleret stamme (forkortet i teksten som Δ saga + saga) 21. - Forbered natten flydende kulturer af bakteriestammer af interesse. Grow GAS M1T1 5448 stammer i -10 ml Todd-Hewitt-bouillon ved 37 ° C i 16-20 timer før infektion af humane celler.
- Centrifuger natten bakteriekulturer (2400 RCF i 10 min) og resuspender i frisk bakterielt medium.
Bemærk: Opblanding i samme volumen som de overnatskulturer blev dyrket i (5-10 ml) generelt producerer en ønskelig indledende optisk tæthed. - Normaliser bakteriekulturer tillige udgangsmaterialer koncentrationer ved fortynding af resuspenderede kulturer i yderligere bakteriel medium indtil samme optiske densitet ved 600 nm (OD600) opnås for alle stammer, der skal testes (OD600 på ca. 1,0 anbefales for nemheds skyld).
Bemærk: I disse studier blev stationær fase bakteriekulturer anvendes til at inficere værtsceller umiddelbart efter normalisering. Eftersom nogle bakteriestammer exit stationær fase nonsynchronously kan det være mere hensigtsmæssigt at begynde værten infektioner med log-fase-kulturer, hvis dette viser sig at være tilfældet for stammerne af interesse. - Før yderligere analyse, udføre en koloni optælling assay til bestemmelse af kolonidannende enheder (CFU) per milliliter stede i udgangsmaterialet kulturer, således at infektionsmultiplicitet (MOI), eller forholdet mellem bakterier pr værtscelle kan bestemmes,.
- Forbered 1 ml seriefortyndinger af bakterielle kulturer, der er blevet normaliseret til den ønskede optiske Density i phosphatbufret saltvand (PBS) eller passende bakterielle vækstmedium (Todd-Hewitt-bouillon blev anvendt i disse undersøgelser). Forbered fortyndinger i området fra 10 -1 til 10 -6 til at producere mindst ét sæt agarplader med tællelige kolonier (30-300 kolonier). Udføre alle fortyndinger i tre eksemplarer.
- Overfør 100 ul af hver seriefortynding på en agarplade indeholdende passende medium til de bakterielle arter, der analyseres.
Bemærk: Todd-Hewitt agar blev anvendt i disse undersøgelser. - Brug et glas eller plast bakteriel sprederen at fordele 100 pi alikvot over hele overfladen af agarpladen, og fortsætte spredning indtil væsken er blevet absorberet i agaren. Udfør under flamme ved hjælp af steril teknik.
- Inkubér agarpladerne ved 37 ° C natten over eller indtil tællelige kolonier vises.
- Kolonierne, som vokser på hver plade og beregne CFU / ml i den oprindelige kultur ved følgende formulela: Antallet af kolonier x inverse af seriel fortynding / kultur volumen forgyldt i milliliter.
f.eks (200 kolonier x 1/10 -5 fortynding) / 0,1 ml udpladet = 2,0 x 10 8 CFU / ml
2. værtscellekulturen
- Opnå en passende værtscelle linje for de ønskede analyser.
Bemærk: HaCaT humane epiteliale keratinocytter 29, en slags gave fra V. Nizet blev anvendt til disse undersøgelser.- Opretholde HaCaT celler i 100 mm dyrkningsskåle i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS). Der inkuberes ved 37 ° C med 5% CO2.
3. Vært Cell Infektion med membran Insert System
- Plate celler i passende vævsdyrkningsskåle og give dem mulighed for at vokse, indtil de når 90% sammenflydning.
Bemærk: De HaCaT celler, der anvendes i disse studier typisk flyder sammen inden for 2-3 days efter plating.- For lysat samling (f.eks signalering analyse og adenosintriphosphat (ATP) Bestemmelse assays), plade HaCaT celler i 6 brønd skåle ved en seeding tæthed på ca. 3 x 10 5 celler / brønd.
- For immunofluorescens billeddannelse eksperimenter, varmeplader celler på sterile dækglas inden 6 brønd skåle ved en podning densitet på ca. 3 x 10 5 celler / brønd.
- For ethidiumhomodimer membranpermeabilisering og lactatdehydrogenase (LDH) analyser frigivelse, plade HaCaT celler i 24-brønds skåle ved en podning densitet på ca. 5 x 10 4 celler / brønd.
- Umiddelbart før behandling, vaske cellerne med 1x sterilt PBS.
- Påfør frisk vækstmedium til cellerne. For betingelserne beskrevet her, anvendes 2 ml medium per brønd i 6-brønds plader eller 0,5 ml medium per brønd i 24 brønds plader. Hvis farmakologiske behandlinger testes, blandes med frisk medium og anvendes under denne stes.
Bemærk: Nogle assays kan kræve alternative medier. For eksempel som phenolrødt og høj serumkoncentrationer interferere med LDH-frigivelse-assay, phenolrødt-frit DMEM suppleret med 1% bovint serumalbumin (BSA) (vægt / volumen), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat var anvendt til disse eksperimenter. - Efter frisk medium er blevet påført, omhyggeligt placere en steril 0,4 um membran indstik i hver brønd. Udføre dette trin i en laminær strømning, og bruge steril pincet til at overføre den permeable membran insert i hver brønd.
- Anvende frisk celledyrkningsmedium til det øvre kammer i hver brønd efter producentens anvisninger. For betingelserne beskrevet her, anvendes 1 ml medium per brønd i 6-brønds plader eller 0,1 ml medium per brønd i 24 brønds plader.
- Påfør en passende mængde normaliserede bakteriekulturer (se afsnit 1) til det øverste kammer i permeable membran insert system. Brug bakterielt medium til uinficeret control behandlinger. For resultaterne beskrevet her, tilsættes 25 pi de normaliserede kulturer pr kammer til plader med 24 brønde, og 100 pi af kulturerne pr kammer til plader med 6 brønde.
Bemærk: I disse undersøgelser blev vildtype eller mutant GAS anvendes til værtsceller ved en MOI på 10. MOI blev beregnet på grundlag af de endelige eukaryot celle tal (f.eks 2 x 10 6 celler / brønd), således at 10 gange så mange bakterier blev tilsat pr værtscelle ved begyndelsen af infektionen periode (f.eks 2 x 10 7 CFU per brønd). Passende MOI vil variere med forskellige bakteriearter og med de ønskede opfølgende analyser.
Bemærk: Ud over at anvende bakterielt medium til ikke-inficerede kontroller, andre nyttige styringer til visse anvendelser af denne teknik kan omfatte varmedræbte bakterier eller brugt bakterielt medium til sammenligning. - Inkuber inficerede celler ved 37 ° C med 5% CO2.
4. Prøvetagning
<ol>- Saml mediet fra det nedre kammer i 1,5 ml rør. Undgå at forstyrre monolag under indsamlingen.
- Centrifuger prøverne ved 14.000 rcf i 10 minutter ved 4 ° C til fjernelse cellerester.
- Tag alle 50 pi af supernatanten til et frisk 1,5 ml rør og opbevares ved -20 ° C eller anvendes straks.
- aspireres forsigtigt mediet over monolaget af værtsceller. Undgå at forstyrre monolag, da dette kan resultere i prøve tab.
- Skyl celler en gang med 1x PBS.
- aspirere forsigtigt PBS. anvendes straks et passende volumen iskold lyseringspuffer at opnå den ønskede proteinkoncentration, og inkuberesprøverne på is i 15 min. Anvendelse mellem 200 pi og 350 pi lysepuffer pr brønd af hver 6-brønds plade til opnåelse af proteinkoncentrationer mellem 0,5 og 1,5 mg / ml.
Bemærk: Lysispufferen anvendt i disse undersøgelser bestod af deioniseret vand, 1% (v / v) Nonidet P40 stedfortrædere, en phosphatase inhibitor cocktail, og en proteasehæmmer cocktail. Specifikke reagenser er angivet i afsnittet Materialer og udstyr. - Brug en celleskraber for at frigøre cellerne fra pladen overflade af hver brønd og pipette hele indholdet af hver brønd i et 1,5 ml rør.
- Centrifuger prøverne ved 14.000 rcf i 20 min ved 4 C.
- For at vurdere opløselige lysat komponenter, fjern supernatanten til et nyt rør og opbevares ved -20 ˚C eller bruge med det samme.
- For at vurdere nukleare eller andre uopløselige lysat komponenter, forbeholder pellet og opbevares ved -20 ˚C eller bruge med det samme.
- Sompirat medium og vask cellerne i 1x kold PBS.
- Fix celler natten over i 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS (vægt / volumen).
Bemærk: I disse undersøgelser blev 1 ml PFA tilsat pr brønd af hver brønd plade 6.
5. Foreslåede applikationer
- Vært signaltransduktion Analyse af SDS-Page og vestlige Blotting
- Saml værtscellelysater som beskrevet i afsnit 4.3.
- Bestem proteinkoncentrationen af hver prøve lysat ved bicinchoninsyre (BCA) -assay eller tilsvarende anvendelse af protein standarderne 30.
- Normalisér protein fusioner og prøver forud for lastning og kører prøverne på en 4-15% polyacrylamid gel eller passende alternativ 31.
- Normalisér prøvernes koncentrationer ved pipettering det samme protein beløb fra hver prøve (fx 20 ug) i en ny 1,5 ml rør og tilføjer variable mængder af lysisbuffer (buffer volumen = totalvolumen - prøvevolumentilsat) til hvert rør for at gøre det samlede volumen (fx 50 pi) og endelig proteinkoncentration ækvivalent tværs prøver.
- Overfør prøver til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (eller tilsvarende). For resultaterne beskrevet her, overføre prøver ved 25 volt i 2 timer før forøge spændingen til 70 volt i yderligere 45 min. Brug overførsel puffer sammensat af 200 mM Tris-base, 1,5 M glycin og 20% methanol (vol / vol) i deioniseret vand.
- Blok membraner i 5% BSA + 0,1% Tween 20 i Tris-bufret saltvand (TBS). Juster derfor baseret på producentens anbefalinger for antistoffet, der skal bruges.
- Inkuber membraner med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. Anvendelse på producenten anbefalede fortynding.
- Vask membraner i 1,5 timer i TBS + 0,1% Tween 20; opdatere buffer hver 10-15 min.
- Inkuber med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof ved en fortynding på 1: 5.000 i 1,5 timer ved stue Temperature.
- Vask membraner i 1,5 timer i TBS + 0,1% Tween 20; opdatere buffer hver 10 - 15 min.
- Inkuber membraner med kemiluminescensdetektion reagens før udvikling på film ifølge producentens anvisninger. Andre påvisningsfremgangsmåder kan anvendes som ønsket.
- Host Cell Immunofluorescens Farvning og Imaging
- Fix dækglas indeholder værtsceller som beskrevet i afsnit 4.4.
- Fjern PFA opløsning og vask dækglas indeholder behandlede celler to gange i PBS, opsugning mellem vaskene.
Bemærk: PFA er meget giftigt og skal bortskaffes korrekt. - Blokere dækglassene i 2 timer ved stuetemperatur i PBS med 1% (vægt / volumen) normalt gedeserum, 2% (volumen / volumen) Triton X-100, og 0,5% (v / v) Tween 20.
- Vask dækglas med PBS i 30 min, forfriskende bufferen hver 10 min.
- Inkubér dækglas med primært antistof ved en 1:50 ratio (eller som anbefalet af producenten) i blokerende solution natten over ved 4 ° C.
- Vask dækglassene i 1,5 timer i PBS, forfriskende buffer hver 30 min.
- Inkuber dækglassene i 2 timer ved stuetemperatur i sekundært antistof (gede anti-kanin IgG AlexaFluor488 blev anvendt til disse undersøgelser) anvendelse af en 1: 200-forhold af antistof til blokeringsopløsning.
- Wash Dækglas i 1 time, forfriskende bufferen hver 20 min.
- Anvend ønskede pletter.
Bemærk: Disse undersøgelser anvendte DAPI (nuklear farvning) og rhodamin-phalloidin (actin-farve) i forhold på 1: 1.000 i blokeringsopløsning. - Inkuber dækglas med nukleare og actin pletter i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask dækglas i PBS i 30 minutter ved stuetemperatur, forfriskende buffer hver 10 min.
- Montere dækglassene på objektglas under anvendelse monteringsmedium.
- Tillad dækglas at sætte på dias natten før forsegling og billedbehandling. For resultaterne beskrevet her, indsamle billeder på et fluorescensmikroskop USIng en standard 20 x objektiv. Brug ImageJ og mikroskop imaging software til at behandle de optagne billeder.
- Ethidiumhomodimer celledød Assay
- Aspirer medium fra hver brønd og vask cellerne to gange med sterilt PBS.
- Påfør 4 uM ethidiumhomodimer-1 i PBS.
- Cellerne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke.
- Bestemme niveauet af fluorescens under anvendelse af en pladelæser sat til 528 nm excitation og 617 nm emission med en afskæringsværdi på 590 nm.
- Tilføj 0,1% (vægt / volumen) Saponin til hver brønd efter den første læsning og så pladen inkuberes i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur (med rocking) inden aflæsning af pladen en gang med samme indstillinger.
- Bestemme procent membranpermeabilisering individuelt for hver brønd ved at dividere den indledende fluorescens aflæsning (efter behandling) af den anden fluorescens aflæsning (post-Saponin).
- ATP Bestemmelse Assay
- Normalize proteinniveauer i lysaterne via BCA-assay eller lignende 30.
- Bestem cellulære ATP-niveauer under anvendelse af en luminescens-baserede ATP bestemmelse kit eller tilsvarende ifølge producentens anvisninger.
- Normalisere behandlede værdier til de tilsvarende ikke-inficerede kontrolprøver.
- LDH frigivelsesassay
- Efter infektion, indsamle supernatanter som beskrevet i afsnit 4.3.
- Evaluere LDH-frigivelse under anvendelse af en cytotoksicitet detektion kit til LDH frigivelse ifølge producentens anvisninger.
Representative Results
Den permeable membran insert-baserede infektion systemet protokol udviklet til undersøgelse af udskilte bakterielle faktorer er detaljeret i figur 1. Dette system er baseret på adskillelsen af bakterier og værtsceller via en porøs membran til at vurdere virkningerne af udskilte bakterielle faktorer, i dette tilfælde streptolysin S (SLS), om værten reaktioner såsom vært membran integritet, cellulær levedygtighed, cellulær signaltransduktion, og udskilles vært celle faktorer. figur 2 giver repræsentative Western Blot data, der viser, at dette system kan anvendes til at vurdere ændringer i aktiveringen af kontakt -uafhængige vært signalering proteiner. Konkret viser de repræsentative data væsentligt forbedret p38 MAPK aktivering i nærværelse af SLS-producerende GAS stammer. Dette system kan også anvendes til at visualisere virkningerne af udskilte bakterielle faktorer på værten proteinlokalisering ved immunfluorescens mikroskopi (<strong> figur 3). Dataene viser SLS-afhængig aktivering af nøglen inflammatorisk mediator Nuclear Factor kappa B (NFKB), der translokerer fra cytoplasmaet til cellekernen ved aktivering 21. Resultaterne i figur 2 og 3 indikerer, at både SLS-afhængige inflammatoriske signaleringsresponser ikke kræver direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. Som tidligere forsøg har allerede vist, SLS-afhængig p38 og NFKB-aktivering i direkte infektion modeller 21, tilsvarende niveauer af p38 eller NFKB aktivering blandt de tre GAS stammer i indsatsen system membran ville have indikeret, at svaret krævede direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller. Figur 4 viser, at denne infektion systemet kan anvendes til at vurdere toksin-afhængige ændringer i host cytotoksicitet via ethidiumhomodimer og LDH frigivelse assays. Dette fremgår af den betydelige stigning in både membranpermeabilisering og i frigivelsen af LDH fra værtsceller udsat for GAS stammer indeholdende SLS sammenlignet med ikke-inficerede celler eller celler udsat for SLS-deficient stamme. Disse ændringer i cytotoksicitet er ikke øjeblikkelig, da betydelige virkninger er ikke indlysende indtil 12 timer efter infektion i tilfælde af membranpermeabilisering og 16 timer i tilfælde af LDH-frigivelse. De repræsentative data illustrerer vigtigheden af at vælge passende tidspunkter og infektion betingelser til evaluering af disse værtsresponser. Ud over at tillade for vurderingen af værten signalændringer og cytotoksicitet, insertet-baserede infektion systemet permeabel membran anvendes til studiet af metaboliske ændringer såsom nøjagtig bestemmelse af værten ATP-niveauer ved at forhindre bakteriel forurening af værtscellelysater (figur 5) . Disse data viser et betydeligt tab af keratinocyt ATP som reaktion på GAS infektion med 16 timer efter infektion, med forbedret ATP tab in tilstedeværelsen af SLS. Disse resultater er konsistente med de observerede toxin-afhængige stigninger i værtens stress-respons signalering og cytotoksicitet.
Figur 1: Diagram over membran Insert-Based Infektion System-protokollen at vurdere virkningerne af udskilt Bakterielle Faktorer på Host Celler Humane keratinocytter er belagt i det nederste rum og vokset til 90% sammenflydning.. En collagen coatede membran med 0,4 um porer adskiller de øvre og nedre kamre, og bakterier tilsættes til det øverste kammer af den permeable membran insert system til den ønskede infektion periode. Cellekultursupernatanter og værtsceller kan indsamles efter infektionen periode, og anvendes til en række forskellige analyser. Klik her for at se en større versionaf dette tal.
Figur 2:. Den permeable membran Insert-Based Infektion System kan anvendes til Host cellelysat Analyse ved SDS-PAGE og Western Blotting De repræsentative data viser, at SLS forøger aktiveringen af p38 MAPK-vejen i inficerede keratinocytter. (A) HaCaTs blev inficeret med GAS i 7 timer via den permeable membran insert infektion systemet (ved MOI = 10) og lysater blev vurderet for aktivering af p38. (B) Densitometri fra tre uafhængige Western blots blev udført for at kvantificere den relative aktivering af p38 som respons på GAS'infection. Gennemsnit fra tre biologiske gentagelser vises, med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen. Relativ aktivering af p38 er repræsenteret som phosphoryleret / total protein niveau. Statistisk signifikans blev bestemt i forhold tilinficerede celler. Den samlede p-værdi blev bestemt ved ANOVA (p = 0,0063). Dunnetts test blev udført post hoc for at sammenligne hver betingelse til den tilsvarende uinficeret kontrol betyder. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = ,0001-,001; ****, P <0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Flaherty et al. 2015 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Den permeable membran Indsæt-Based Infektion system giver mulighed for visualisering af Host signalændringer ved immunfluorescensmikroskopi De repræsentative data viser, at Streptolysin S øger pro-inflammatorisk signalering gennem aktivering af NFKB. HaCaT humane keratinocytter blev inficeret med GAS på en M OI af 10 i 8 timer ved hjælp af permeable membran insert-baserede infektion system. (A og B) Nuklear lokalisering af NFKB blev vurderet ved immunofluorescens billeddannelse. Procentdelen af nukleare lokaliserede celler blev beregnet ved at tælle antallet af celler, i hvilke NFKB havde translokeres fra cytoplasmaet til cellekernen for et givet område og dividere dette tal med det totale antal celler for samme felt. Scale søjler indikerer 100 um. (A) Gennemsnittet af tre biologiske gentagelser er repræsenteret for hver betingelse med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen. Den samlede p-værdi blev bestemt ved ANOVA; p <0,0001. Dunnetts test blev udført for at sammenligne hver betingelse til den tilsvarende uinficeret kontrol betingelse. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = ,0001-,001; ****, P <0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Flaherty et al. 2015 21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. Den permeable membran Indsæt-Based Infektion system giver mulighed for bestemmelse af bakteriel-medieret Membrane Permeabilisering og cytotoksicitet i mangel af direkte kontakt mellem bakterier og værtsceller De repræsentative data viser, at keratinocyt levedygtighed falder i tilstedeværelsen af aktive SLS toksin . GAS - induceret celledød blev vurderet i HaCaT celler i nærvær af WT, SLS-deficiente eller SAGA suppleret GAS Keratinocytter blev udsat for GAS hjælp af insert-baserede infektion systemet permeabel membran til 8-16 timer ved en MOI på 10. (. A) levedygtighed blev bedømt ved ethidiumhomodimer assay eller (B) LDH-frigivelse-assay. I begge paneler, 3 replicates midles og fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen. Betydning for hvert tidspunkt blev bestemt ved ANOVA (A) 8 t, p = 0,0241; 12 timer, p <0,0001 (B) 8 t, p = 0,0287; 12 timer, p = 0,1977; 16 timer, p = 0,0031. Dunnetts test blev udført til sammenligning af middelværdier fra hver betingelse til vildtype-infektion for den tilsvarende tidspunkt. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = ,0001-,001; ****, P <0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Flaherty et al. 2015 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Den permeable membran Indsæt-Based Infektion system giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af Host ATP niveauer ved Forebyggelse Bacterial Forurening af værtscellelysater. De repræsentative data viser SLS-afhængige tab af ATP under gruppe A streptokok-infektion. HaCaT-celler blev inficeret med gas til 8-16 timer ved anvendelse af permeable membran insert-baserede infektion system. Tekniske replikater (n = 3) fra et repræsentativt biologisk replikat (2 x 10 6 celler pr prøve) blev midlet for hver betingelse, med fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen. De samlede p-værdier blev bestemt ved ANOVA (12 timer, p <0,0001; 16 timer, p <0,0001). Dunnetts test blev udført for at sammenligne hver betingelse med vildtype-infektion for den tilsvarende tidspunkt. *, P = 0,01-0,05; **, P = 0,001-0,01; ***, P = ,0001-,001; ****, P <0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Flaherty et al. 2015 21. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Heri beskrives en metode ved hjælp af en gennemtrængelig insert-baserede infektion systemet membran til at undersøge virkningerne af den bakterielle toxin Streptolysin S på humane epiteliale keratinocytter i et in vitro-system. Denne protokol kan tilpasses til undersøgelse af andre udskilte bakterielle virulensfaktorer samt alternative vært celletyper. Dette nyligt udviklet system giver flere fordele i forhold eksperimentelle metoder, der udnytter oprensede toksiner eller filtrerede bakterielle supernatanter 1 - 3,8,18 - 20. Den permeable membran insert-baserede system giver en konstant holdes dosis af det relevante bakterielt toksin til værtsceller, som det er fremstillet, som muliggør maksimal toksin-aktivitet skal opretholdes og øger også sammenhæng mellem eksperimenter. Desuden er denne ordning mere nøje efterligner fysiologiske betingelser ved at lade udskilte faktor at ophobe sig med tiden som infektionen skrider frem, og ved elimidelse behovet for vilkårligt vælge specifikke toksin koncentrationer for at anvende til værtsceller. Endvidere ville dette system også tilvejebringe midler til forskere til at vurdere, om en bakteriel faktor af interesse leveres til værtsceller i en kontakt-afhængig måde. Kontakt-afhængighed er ofte testet ved produktion af isogene bakterielle mutanter deficiente i adhærens eller ved anvendelse af reagenser, der forhindrer vedhæftning. Den her beskrevne system vil give et simpelt alternativ til at supplere eller erstatte disse traditionelle tilgange.
Udover de testede anvendelser beskrevet i afsnit 5 i protokollen, andre programmer, som denne infektion system kan let tilpasses omfatter indsamling af prøver til cytokin arrays og ELISA assays. I begge disse tilfælde kan en lignende protokol som beskrevet for LDH frigivelse assays følges. Selv om det ikke er vist her, er dette system blevet anvendt effektivt indsamle vært celleprøver at være ennalyzed ved flowcytometri. I denne ansøgning er den permeable membran insertet fjernet efter infektionen periode, vaskes cellerne for at fjerne cellekulturmediet, og trypsin anvendes til at tillade samling af cellerne til analyse. Den fysiske adskillelse af bakterier fra værtsceller er særlig nyttig til denne anvendelse, fordi det hjælper til at forhindre dannelse af store aggregater bestående af vedhæftede bakterier og værtsceller, som ellers kan forstyrre nøjagtig celletælling af flowcytometeret.
Selvom meget konsistente værtsresponser er observeret ved sammenligning af resultaterne af den permeable membran insert-baserede infektion undersøgelser med traditionelle studier direkte infektion, har nogle bemærkelsesværdige forskelle i kinetikken for disse værtsresponser blevet observeret 21. For eksempel, ændringer i vært signalering og membran-baserede cytotoksicitet tage 30-50% længere at forekomme i den permeable membran insert-baserede infektion model end correagere direkte infektionsmodeller. Fordi den permeable membran insert-baseret system kræver medium, der skal anvendes på de øvre og nedre rum i hver brønd systemet udviklet til undersøgelserne her beskrevne krævede en stigning i den samlede medium volumen 30% per brønd i forhold til tilsvarende direkte infektionsmodeller tidligere anvendte 21. Denne forskel i total medium volumen, kombineret med den forøgede afstand mellem bakterier og værtsceller når direkte kontakt er forbudt, sandsynligvis øger den tid, det tager for SLS at diffundere gennem mediet at nå værtsceller og fremkalder de observerede virkninger. Derudover permeable membran insert-baseret system fjerner mange GAS virulensfaktorer, som sandsynligvis vil bidrage til vært cellebeskadigelse; fraværet af disse yderligere faktorer i dette system er sandsynligvis også bidrage til forsinkelsen i værtscellen død og initiering af værten signalering begivenheder sammenlignet med direkte infektion 21. Disse faktorer bør overvejesnår designe eksperimenter for at vurdere andre secernerede bakterielle komponenter.
For at identificere de mest meningsfyldte forhold til test af virkningerne af udskilte bakterielle faktorer værtsceller, teste en række tidspunkter for hver ansøgning af indsatsen-baserede infektion systemet membran anbefales. Det er vigtigt at overveje, under hvilke betingelser den specifikke virulens faktor af interesse optimalt produceres (f.eks logaritmisk fase, stationær fase, som svar på visse miljømæssige signaler, etc.) for at kunne observere dens virkninger. I forsøg med fokus på evaluering af ændringer i vært signalering proteiner, var det nødvendigt at vælge tidspunkter, der tillod tilstrækkelig tid til SLS at nå værtsceller og skal produceres i tilstrækkelige mængder til at fremkalde signalændringer 21. Samtidig, at vurdering af ændringer i vært signalering behov skal foretages før SLS-induceret membranpermeabilisering, da denne effekt complicates indsamling af værtscellelysater til analyse. Celledød fremkaldt af SLS kunne optimalt observeres i både direkte og gennemtrængelig membran insert-baserede infektion modeller flere timer efter indledningen af de rapporterede signalering begivenheder 21. Endvidere ved udvælgelse tidspunkter af interesse, er det også vigtigt at sikre, at bakterierne blive undersøgt er ude af stand til at trænge igennem porøs indsats membran under studieperioden. Produktionen af visse bakterielle komponenter over en længere periode kan forstyrre integriteten af membranen og tillade passage af bakterier til det nedre rum. For at afgøre, om dette er et potentielt problem i systemet af interesse, kan de bakteriestammer, der skal undersøges anvendes på det øverste kammer i permeable membran insert-baseret system på en afstand af tidspunkter. Ved hvert tidspunkt, kan indsatsen fjernes forsigtigt, og mediet fra bunden kammer kan opsamles og anvendes i en standard koloni counting assay (se afsnit 1.5). Hvis ingen kolonier dannes ud fra celledyrkningsmediet i det nedre rum, kan indsatsen membranen antages at være effektivt forhindrer passage af bakterier til tiden og bakteriel belastning testet.
En anden eksperimenterende design komponent, der vil sandsynligvis kræve optimering for en effektiv analyse af udskilte bakterielle faktorer er mangfoldigheden af infektion (MOI). MOI henviser til forholdet af bakterieceller pr værtscelle, og derfor påvirkes af værtscelle konfluens på tidspunktet for infektion og med antallet af bakterielle kolonidannende enheder (CFU) påført til cellerne. I disse studier blev keratinocytceller dyrket til 90% sammenflydning, hvilket tillod disse celler til dannelse af en sammenhængende monolag med intakte tætte sammenføjninger. Tankevækkende overvejelse af den fysiologiske organisering af værtscellerne, der skal undersøges, er nødvendigt at vælge en passende konfluens for infektion eksperimenter. Når en approprIATE antal værtsceller pr brønd bestemmes, kan en egnet bakteriel CFU beregnes baseret off ønskede MOI. I undersøgelserne beskrevet her, blev GAS anvendt til værtsceller ved en MOI på 10. Passende MOI vil variere med forskellige bakterier og med de ønskede opfølgende analyser. En lav begyndelse MOI er typisk mere fysiologisk relevant og giver mulighed for den bakterielle faktor af interesse at akkumulere langsomt nok til at fange subtile ændringer i værtscelle signalering før dramatiske ændringer i værtscellelevedygtighed er indlysende. Højere MOI anvendes i mange undersøgelser, der vurderer cytotoksicitet, men denne virkning kan også opnås ved at begynde med en lav MOI og tillade infektionen at gøre fremskridt i en længere periode. Det er vigtigt at fastslå en nøjagtig CFU til optisk densitet konsekvens for alle bakteriestammer, der skal testes, som isogene mutanter kan have en ændret vækstrate sammenlignet med vildtype-bakterier, og kan derfor kræve, at en højere eller lavere CFU tilsættes per brønd tilsikre en passende sammenligning af værtens respons mellem stammer. I tilfælde, hvor pattedyrværtsceller blive undersøgt er i stand til at dræbe bakterier eller inhibering af deres vækst eller hvis der er mistanke asynkrone vækst mellem bakteriestammer, kan det også være nyttigt at udføre undersøgelser for at vurdere den endelige bakterielle belastning ved udgangen af infektionen periode. Dette kunne udføres ved at indsamle indholdet af permeable insert og udføre en kolonitælling assay svarende til den beskrevet i punkt 1.5 i proceduren.
Valg af passende størrelse brønde for den ønskede assay er også vigtigt for at opnå optimale resultater. Permeable membran indsatser findes i mange forskellige størrelser, men de mest konsekvente resultater for undersøgelserne vist her blev observeret ved anvendelse af indsatse beregnet til 24 brønd og 6 brønds vævskulturplader. Disse skærstørrelser er relativt nemme at håndtere med steril pincet, og nem manipulation er kritisk i Preventing uønsket overførsel af bakterier fra den øvre kammer til det nedre rum af brønden. For forsøg med indsamling af værtscellelysater, 6 brønd skåle give et passende celleantal pr betingelse for de fleste analyser og er store nok til at rumme celle skraber til prøveindsamling. For cytotoksicitet assays, hvor værtscellerne forbliver klæbende og er mærket med en fluorescerende eller kolorimetrisk farvestof, der kan måles på en pladelæser (f.eks ethidiumhomodimer assay trypan blue udelukkelse assay), anvendelse af en plade 24 med de tilsvarende skær er anbefalede. For forsøg, hvor cellekulturmedium vil blive indsamlet og analyseret (f.eks LDH frigivelse, cytokin undersøgelser) enten 24 godt eller 6 brønde kan anvendes, selvom de mindre brønde typisk give tilstrækkelige mængder prøve for disse analyser og minimere brugen af den krævede reagenser. Samlet er fremgangsmåden meget alsidigt og kan tilpasses efter behov for at forberede samples for mange opfølgende applikationer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd-Hewitt broth | Acumedia | 7161A | Use appropriate broth for bacterial species of interest. |
| BioSpectrometer | Eppendorf | basic model | Any UV-Vis spectrophotometer is suitable. |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Other brands are suitable. |
| Agar | Sigma | A1296-1kg | Other brands are suitable. |
| HaCaT human epithelial keratinocytes | Gift from lab of Victor Nizet. | ||
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11995-073 | Use appropriate media for cell line of interest. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S162H | Use appropriate media additives for cell line of interest. |
| 10 cm tissue culture dishes | Nunc | 150350 | Other brands are suitable. |
| 6 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7506 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| 24 well tissue culture dishes | CytoOne | cc7682-7524 | Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert. |
| Glass coverslips | Fisherbrand | 12-541-B | These must be autoclaved prior to use for cell plating. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phenol Red Free DMEM | Life Technologies | 31053028 | Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay. |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030149 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Sodium pyruvate | Gibco | BP356100 | Only required to supplement cell culture media for LDH release assay. |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well) | Corning | 3540 | |
| Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well) | Corning | 3595 | |
| Forceps | Fisher | 3120018 | These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts. |
| Cell scrapers | Fisherbrand | 08-100-241 | These are only required for the collection of cell lysates. |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 04042-500 | TOXIC. This is only required for immunofluorescence imaging. |
| Bicinchoninic acid (BCA) assay kit | Pierce | 23227 | Other protein quantification assays may be used. |
| Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels | BioRad | 4561083 | Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest. |
| Electrophoresis cassette supplies | BioRad | 1658063 | Only required for Western Blotting. |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645050 | Only required for Western Blotting. |
| Western blot transfer cassette | BioRad | Only required for Western Blotting. | |
| Polyvinylidene (PVDF) Membrane | EMD Millipore | IPVH00010 | Only required for Western Blotting. |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ml | |
| Rabbit IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2030 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Mouse IgG-HRP secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc2031 | The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection. |
| Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody | Cell Signaling | 4511 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Total p38 MAPK antibody | Cell Signaling | 8690 | Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest. |
| Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488 | Molecular Probes | A-11034 | Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection. |
| LumiGLO Detection Reagent | KPL | 54-61-00 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| Detection film | Biodot | BDB57 | Only required for Western Blotting with detection on film. |
| DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope | Nikon | Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses. | |
| Normal goat serum | Thermo Scientific | 31873 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500mL | |
| DAPI nuclear stain | Cell Signaling | 4083 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Rhodamine-phalloidin actin stain | Molecular Probes | R415 | Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest. |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Only required for immunofluorescence imaging. |
| Ethidium homodimer 1 | Molecular Probes | E1169 | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Spectramax M5 Microplate Reader | Molecular Devices | Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable. | |
| Saponin | Sigma | 47036-50G-F | Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay. |
| Molecular Probes ATP Determination Kit | Life Technologies | A22066 | Other kits are likely to be suitable. |
| Cytotoxicity Detection Kit for LDH release | Roche | 11644793001 | Other kits are likely to be suitable. |
| Nonidet P40 Substitute | Sigma | 74385-1L | Other suppliers are suitable. |
| HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Thermo Scientific | 78420B | Other cocktails are likely to be suitable. |
| SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free | Sigma | S8830-2TAB | Other cocktails are likely to be suitable. |
References
- Wiles, T. J., Dhakal, B. K., Eto, D. S., Mulvey, M. A. Inactivation of host Akt/protein kinase B signaling by bacterial pore-forming toxins. Mol Biol Cell. 19 (4), 1427-1438 (2008).
- Kao, C. Y., Los, F. C. O., et al. Global functional analyses of cellular responses to pore-forming toxins. PLoS Pathog. 7 (3), e1001314 (2011).
- Ma, X., Chang, W., Zhang, C., Zhou, X., Yu, F. Staphylococcal Panton-Valentine Leukocidin Induces Pro-Inflammatory Cytokine Production and Nuclear Factor-Kappa B Activation in Neutrophils. PLoS ONE. 7 (4), e34970 (2012).
- Sumitomo, T., Nakata, M., et al. Streptolysin S contributes to group A streptococcal translocation across an epithelial barrier. J Biol Chem. 286 (4), 2750-2761 (2011).
- Miyoshi-Akiyama, T., Takamatsu, D., Koyanagi, M., Zhao, J., Imanishi, K., Uchiyama, T. Cytocidal effect of Streptococcus pyogenes on mouse neutrophils in vivo and the critical role of streptolysin S. J Infect Dis. 192 (1), 107-116 (2005).
- Goldmann, O., Sastalla, I., Wos-oxley, M., Rohde, M., Medina, E. Streptococcus pyogenes induces oncosis in macrophages through the activation of an inflammatory programmed cell death pathway. Cell Microbiol. 11 (1), 138-155 (2009).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Ratner, A. J., Hippe, K. R., Aguilar, J. L., Bender, M. H., Nelson, A. L., Weiser, J. N. Epithelial cells are sensitive detectors of bacterial pore-forming toxins. J Biol Chem. 281 (18), 12994-12998 (2006).
- Stassen, M., Müller, C., et al. The streptococcal exotoxin streptolysin O activates mast cells to produce tumor necrosis factor alpha by p38 mitogen-activated protein kinase- and protein kinase C-dependent pathways. Infect Immun. 71 (11), 6171-6177 (2003).
- Porta, H., Cancino-Rodezno, A., Soberón, M., Bravo, A. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides. 32 (3), 601-606 (2011).
- Walker, M. J., Barnett, T. C., et al. Disease manifestations and pathogenic mechanisms of group a Streptococcus. Clin Microbiol Rev. 27 (2), 264-301 (2014).
- Carapetis, J. R., Steer, A. C., Mulholland, E. K., Weber, M. The global burden of group A streptococcal diseases. Lancet Infect Dis. 5 (11), 685-694 (2005).
- Cunningham, M. W. Pathogenesis of group A streptococcal infections. Clin Microbiol Rev. 13 (3), 470-511 (2000).
- Molloy, E. M., Cotter, P. D., Hill, C., Mitchell, D. A., Ross, R. P. Streptolysin S-like virulence factors: the continuing sagA. Nature Rev Microbiol. 9 (9), 670-681 (2011).
- Datta, V., Myskowski, S. M., et al. Mutational analysis of the group A streptococcal operon encoding streptolysin S and its virulence role in invasive infection. Mol Microbiol. 56 (3), 681-695 (2005).
- Lee, S. W., Mitchell, D. A., et al. Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (15), 5879-5884 (2008).
- Mitchell, D. A., Lee, S. W., et al. Structural and functional dissection of the heterocyclic peptide cytotoxin streptolysin S. J Biol Chem. 284 (19), 13004-13012 (2009).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., et al. Characterization of Clostridium perfringens TpeL Toxin Gene Carriage Production, Cytotoxic Contributions, and Trypsin Sensitivity. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (6), 2369-2381 (2015).
- Bárcena-Uribarri, I., Benz, R., Winterhalter, M., Zakharian, E., Balashova, N. Pore forming activity of the potent RTX-toxin produced by pediatric pathogen Kingella kingae: Characterization and comparison to other RTX-family members. Biochim Biophys Acta Biomem. 1848 (7), 1536-1544 (2015).
- Carr, A., Sledjeski, D. D., Podbielski, A., Boyle, M. D., Kreikemeyer, B. Similarities between complement-mediated and streptolysin S-mediated hemolysis. J Biol Chem. 276 (45), 41790-41796 (2001).
- Flaherty, R. A., Puricelli, J. M., Higashi, D. L., Park, C. J., Lee, S. W. Streptolysin S Promotes Programmed Cell Death and Enhances Inflammatory Signaling in Epithelial Keratinocytes during Group A Streptococcus Infection. Infect Immun. 83 (10), 4118-4133 (2015).
- Guedon, J. T., Luo, K., Zhang, H., Markham, R. B. Monoclonal and Single Domain Antibodies Targeting β-Integrin Subunits Block Sexual Transmission of HIV-1 in In Vitro and In Vivo Model Systems. J Acquir Immune Defic Syndr. 69 (3), 278-285 (2015).
- Hu, D., Zhou, J., Wang, F., Shi, H., Li, Y., Li, B. HPV-16 E6/E7 promotes cell migration and invasion in cervical cancer via regulating cadherin switch in vitro and in vivo. Arch Gynecol Obstet. 292 (6), 1345-1354 (2015).
- Gangl, K., Waltl, E. E., et al. Infection with Rhinovirus Facilitates Allergen Penetration Across a Respiratory Epithelial Cell Layer. Int Arch Allergy Immunol. 166 (4), 291-296 (2015).
- Peng, X., Zhang, Q., Zeng, Y., Li, J., Wang, L., Ai, P. Evodiamine inhibits the migration and invasion of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro via repressing MMP-2 expression. Cancer Chemother Pharmacol. 76 (6), 1173-1184 (2015).
- Zheng, Y., Guo, J., et al. FoxM1 transactivates PTTG1 and promotes colorectal cancer cell migration and invasion. BMC Med Genomics. 8, 49 (2015).
- Losa, D., Köhler, T., et al. Airway Epithelial Cell Integrity Protects from Cytotoxicity of Pseudomonas aeruginosa Quorum-Sensing Signals. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (2), 265-275 (2015).
- Cook, K. W., Letley, D. P., et al. CCL20/CCR6-mediated migration of regulatory T cells to the Helicobacter pylori-infected human gastric mucosa. Gut. 63 (10), 1550-1559 (2014).
- Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).
- Krieg, R. C., Dong, Y., Schwamborn, K., Knuechel, R. Protein quantification and its tolerance for different interfering reagents using the BCA-method with regard to 2D SDS PAGE. J Biochem Biophys Methods. 65 (1), 13-19 (2005).
- Brunelle, J. L., Green, R. One-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (1D SDS-PAGE). Methods Enzymol. 541, 151-159 (2014).
