Artbestimmung und Quantifizierung in Mischungen Mit MRM-Massenspektrometrie von Peptiden, der Fleisch-Authentifizierung

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung der Komponenten in Mischungen von Spezies, die ähnliche Proteine besitzen. Die Massenspektrometrie detektiert Peptide zur Identifizierung und liefert eine relative Quantifizierung durch Verhältnisse der Peakflächen. Als Werkzeugfutter zur Betrugserkennung kann die Methode 1 % Pferd im Rind nachweisen.

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll zur Identifizierung und Quantifizierung der beiden Komponenten in binären Mischungen von Arten, die ein oder mehrere ähnliche Proteine besitzen. Im Mittelpunkt der Methode steht die Identifizierung von "korrespondierenden Proteinen" in der interessierenden Spezies, d.h. Proteinen, die nominell gleich sind, aber speziesspezifische Sequenzunterschiede aufweisen. Bei der Proteolyse entstehen aus entsprechenden Proteinen einige Peptide, die ebenfalls ähnlich sind, aber artspezifische Varianten aufweisen. Dabei handelt es sich um "korrespondierende Peptide". Speziesspezifische Peptide können als Marker für die Speziesbestimmung verwendet werden, während Paare korrespondierender Peptide die relative Quantifizierung von zwei Spezies in einem Gemisch ermöglichen. Der Nachweis der Peptide erfolgt mittels Multi-Reaction-Monitoring (MRM)-Massenspektrometrie, einer hochspezifischen Technik, die eine peptidbasierte Speziesbestimmung auch in komplexen Systemen ermöglicht. Darüber hinaus unterstützt das Verhältnis der MRM-Peakflächen, die von entsprechenden Peptiden abgeleitet sind, die relative Quantifizierung. Da sich entsprechende Proteine und Peptide sowohl bei der Verarbeitung als auch bei der experimentellen Extraktion und Probenvorbereitung im Wesentlichen ähnlich verhalten, sollte die relative Quantifizierung vergleichsweise robust bleiben. Darüber hinaus benötigt dieser Ansatz nicht die Standards und Kalibrierungen, die für absolute Quantifizierungsmethoden erforderlich sind. Das Protokoll wird im Zusammenhang mit rotem Fleisch beschrieben, das zweckmäßige entsprechende Proteine in Form ihrer jeweiligen Myoglobine aufweist. Diese Anwendung ist für die Aufdeckung von Lebensmittelbetrug relevant: Das Verfahren kann 1 % des Gewichts von Pferdefleisch in Rindfleisch nachweisen. Die relative Quantifizierung des entsprechenden Proteins, des entsprechenden Peptids (CPCP) unter Verwendung des MRM-Peakflächenverhältnisses liefert gute Schätzungen des Gewichts für die Gewichtszusammensetzung einer Pferde-Rindfleisch-Mischung.

Einleitung

Der europäische Pferdefleischskandal von 2013, bei dem nicht deklariertes Pferdefleisch in einer Reihe von Rindfleischprodukten aus Supermärkten gefunden wurde¹, unterstreicht den Bedarf an Testmethoden, die in der Lage sind, Lebensmittelbetrug bei Fleisch aufzudecken und zu messen. Es wurden mehrere Technologien erforscht, insbesondere der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) und DNA-basierte Methoden². Ein alternativer Weg, der auf Massenspektrometrie basiert, zielt auf speziesspezifische Peptide ab, die wiederum aus speziesspezifischen Proteinen entstehen. Hier skizzieren wir einen solchen peptidbasierten Ansatz, der sowohl die Identifizierung als auch die relative Quantifizierung der Verfälschungsmittelspezies in einer Fleischmischung ermöglicht³.

Das Protokoll steht im Zusammenhang mit rotem Fleisch und dem Wunsch, das Vorhandensein von einem in einem anderen auf einem Niveau von 1 Gew.-% zu bestimmen, dem Niveau, das von einigen als betrügerische Lebensmittelverfälschung im Gegensatz zu Kontamination angesehen wird⁴. Die Methode beruht in erster Linie auf der Identifizierung eines Proteins, das nominell in allen Zielfleischsorten "gleich" ist. Myoglobin, das Protein, das für die rote Farbe von Fleisch verantwortlich ist, ist ein guter Kandidat, da es reichlich vorhanden ist, relativ hitzetolerant und wasserlöslich ist und zuvor zur Speziesbestimmung von Fleisch verwendet wurde^5,6. Die Myoglobine für Rind (Bos taurus), Schweinefleisch (Sus scrofa), Pferd (Equus caballus) und Lamm (Ovis aries⁾³ sind z. B. nominell die gleichen, wie es erforderlich ist, aber ihre Sequenzen sind nicht identisch. Solche Gruppen von "ähnlichen, aber unterschiedlichen" Proteinen, wie diese vier Myoglobine, können bequem als "korrespondierende Proteine" bezeichnet werden. Die Sequenzunterschiede in diesen vier Myoglobinen sind speziesspezifisch: So umfassen beispielsweise die vollständigen Myoglobinproteine für Rind und Pferd, P02192 bzw. P68082, jeweils 154 Aminosäuren mit 18 Sequenzunterschieden zwischen den beiden. Einer Proteolyse mit Trypsin unterworfen, produzieren diese Proteine zwei Sätze von Peptiden, von denen einige identisch sind und andere einen oder mehrere speziesspezifische Aminosäureunterschiede aufweisen: Entsprechende Proteine führen also zu entsprechenden Peptiden.

Der CPCP-Ansatz versucht daher, zunächst Proteine von zwei oder mehr Spezies zu identifizieren, bei denen diese Proteine begrenzte speziesspezifische Sequenzvarianten aufweisen. Dabei handelt es sich um entsprechende Proteine. Nach der Proteolyse entstehen aus entsprechenden Proteinen Peptide, die zum Teil ebenfalls speziesspezifische Sequenzvarianten aufweisen, die vom Ausgangsprotein geerbt wurden. Dabei handelt es sich um entsprechende Peptide. Der CPCP-Ansatz kann verwendet werden, um die Konzentrationen zweier korrespondierender Proteine in einer gemischten Speziesprobe zu vergleichen, indem die Konzentrationen der entsprechenden Peptide überwacht werden.

Die natürliche Technologie zum Nachweis bekannter Peptide ist die Massenspektrometrie zur Mehrfachreaktionsüberwachung, oder MRM-MS⁷. Speziesspezifische Peptide ergeben Vorläuferionen, die zusammen mit ihren massenspektrometrischen Fragmentionen im Voraus mit Softwaretools leicht aufgelistet werden können. Diese Listen werden dann verwendet, um das Massenspektrometer anzuweisen, nur bestimmte Vorläufer-Fragment-Ionenpaare aufzuzeichnen, die als Übergänge bezeichnet werden. Ein bestimmtes Zielpeptid wird daher nicht nur durch seine Retentionszeit in der Chromatographie vor dem Massenspektrometer identifiziert, sondern auch durch eine Reihe von Übergängen, die sich ein gemeinsames Vorläuferion teilen. Dies ist ein hochselektives Mittel zum Nachweis bekannter Peptide, das die Ressource des Massenspektrometers effizient nutzt.

Andere Autoren haben Massenspektrometrie verwendet, um auf Fleischverfälschung über Peptidmarker zu testen, jedoch von unterschiedlichen Proteinen^8-14. Unter Verwendung der entsprechenden Proteine können jedoch mit dem CPCP-Schema (Corresponding Peptides) die experimentellen Bedingungen optimiert werden, was die Identifizierung der Spezies in der Mischung aus bekannten speziesspezifischen Übergängen erleichtert. Darüber hinaus verhalten sich entsprechende Proteine und Peptide in der Extraktions-, Proteolyse- und Nachweisphase in der Regel ähnlich. Da Übergangspeakbereiche quantitativ und reproduzierbar sind, liefern Verhältnisse von Peakflächen, die sich aus Paaren entsprechender Peptide verschiedener Spezies ergeben, eine direkte Schätzung der relativen Mengen von zwei Fleischsorten in einer Mischung. Im Gegensatz dazu nutzen traditionellere Quantifizierungswege Kalibrierungen auf der Grundlage von Referenzmaterialien, um eine absolute Quantifizierung zu ermitteln^14,15.

Obwohl das Protokoll im Zusammenhang mit Myoglobin und Fleisch skizziert wird, könnten andere Proteine als Myoglobin zur Identifizierung und relativen Quantifizierung über die CPCP-Strategie in Fleischmischungen verwendet werden, wenn auch möglicherweise mit Änderungen am Protokoll. Darüber hinaus ist die Strategie auch auf binäre Mischungen anderer Spezies anwendbar, die ein oder mehrere entsprechende Proteine teilen.

Ausgangspunkt für das Protokoll ist gereinigtes 'Referenz'-Myoglobin, das für einige Spezies gekauft werden kann, für andere jedoch durch konventionelle Größenausschlusschromatographie hergestellt werden muss. Das Verfahren zur Herstellung von Referenzmyoglobin ist nicht im Protokoll enthalten, wird aber an anderer Stelle beschrieben³. Softwarewerkzeuge¹⁶ werden verwendet, um Kandidatenpeptide und Übergänge aufzulisten, die von interessierenden Myoglobinen ausgehen. Jedes Referenzmyoglobin wird einer Proteolyse unterzogen und die resultierenden Peptide werden mittels Flüssigchromatographie und Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS) analysiert, um herauszufinden, welche der Kandidatenvorläuferionen und -übergänge am nützlichsten sind, und um die passenden Peptidretentionszeiten zu bestimmen. Das Ergebnis dieser Phase ist eine überarbeitete Liste von Zielpeptiden mit ihren Übergängen, die für die Speziesbestimmung geeignet sind, und eine Liste von CPCP-Paaren, die für die relative Quantifizierung geeignet sind. Um echtes Fleisch zu testen, werden Probenextraktionen vorbereitet und dann einer Proteolyse unterzogen, um Peptide sowohl aus Myoglobin als auch aus anderen Fremdproteinen zu erzeugen. Die Myoglobin-basierten Peptide werden dann anhand ihrer aufgelisteten Übergänge mittels LC-ESI-MS/MS überwacht. Die in einer Mischung vorhandenen Spezies werden durch die Übergangspeaks identifiziert, die mit Markerpeptiden assoziiert sind. Schätzungen der relativen Mengen von zwei Fleischsorten in einer binären Mischung werden unter Verwendung von Verhältnissen der Übergangspeakbereiche berechnet. Mit einem Satz von Testmischungen von Fleischpaaren kann das Verhältnis der Peakflächen für ein bestimmtes Übergangspaar überprüft und mit den tatsächlichen Mischungen verglichen werden.

Protokoll

1. Die Proteolyse und Analyse von Referenz Myoglobins

1. Proteolyse von Referenz Myoglobinen
   1. Bereiten Sie Lösungen der gereinigten Referenz Myoglobinen (Bereich 0,2 bis 0,5 mg / ml in 25 mM Ammoniumbicarbonat) ^3.
   2. 1 ml-Aliquots von jeder Probe zu 2 ml-Zentrifugenröhrchen.
   3. Thermisch denaturiert, das die extrahierten Proteine ​​durch die Probe in einem heißen Block Erhitzen bei 95 ° C für 30 min. Die Probe wird für etwa 15 Minuten, bis es Zimmertemperatur erreicht. In 30 mg Harnstoff (Endkonzentration 0,5 M), um die Verdauung zu verbessern, dann mischen.
2. Tryptic Proteolyse
   1. Bereiten Sie eine 1 mg / ml-Lösung von Trypsin in 25 mM Ammoniumbicarbonat und lagern auf Eis nach Bedarf. Um ein ausreichendes Volumen an Trypsin , so dass das endgültige Enzymaktivität 420 BAEE ist (N- Benzoyl-L-Arginin - Ethylester - Hydrochlorid) Einheiten / mg Protein extrahiert, dann mischen durch vorsichtiges Vortexen und lassen über Nacht bei 3 bis proteolyze7 ° C.
   2. Durchführung Natriumdodecylsulfat - Polyacrylamid - Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ¹⁷ , um die Vollständigkeit der Proteolyse zu demonstrieren.
3. Die Entsalzung der Post-Proteolyse Probe
   1. Verdünnen Sie die Probe 1: 2 v: v mit Wasser.
   2. Aktivieren eines polymeren Reversed-Phase (RP) Patrone mit 30 mg RP-Material durch Zugabe von 1 ml Methanol gefüllt, äquilibrieren dann die Kassette durch Zugabe von 1 ml 1% Ameisensäure.
   3. Legen Sie die Probe auf die Patrone unter der Schwerkraft.
   4. Waschen mit 1 ml von 5% Methanol / 1% Ameisensäure unter Schwerkraft.
   5. Eluieren die Peptide mit 1 ml Acetonitril / Wasser (90:10 v: v; 0,1% Ameisensäure) unter Schwerkraft in 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen vorbefüllt mit 5 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO).
   6. Entferne das Lösungsmittel unter Vakuum bei 50 ° C unter Verwendung eines Zentrifugal-Verdampfer für 120 min, dann abgeblasen, und der Rückstand in 250 ul Acetonitril / Wasser (3:97 v: v; 0,1% Ameisensäure).
   7. Übertragungdie Lösung auf ein kleines Volumen Autosampler Fläschchen.
      Anmerkung: Die Proben können bei 4 ° C, bis sie bereit für die Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC / MS) Analyse gespeichert werden.
4. Die Erzeugung von Übergangs-Listen für MRM
   1. Suchen Sie die Myoglobin-Sequenzen für die verschiedenen Fleischsorten aus der UniProt Datenbank.
   2. Geben Sie die Myoglobin - Sequenzen in das "Ziel" Feld des Peptids und des Übergangs Vorhersagesoftware (zB Skyline). Falls erforderlich, schweben ein Peptid seine Fragmentliste zu offenbaren über.
   3. Klicken Sie auf "Einstellungen" und wählen Sie "Peptid-Einstellungen". Geben Sie die Einstellungen für die Verdauung (dh Trypsin) und die Anzahl der verpassten cleavages (0). Geben Sie die gewünschte Auswahl für weitere Parameter, insbesondere die Peptidlänge (6 - 25), N-terminale Ausschlüsse (0) und angenommen Aminosäuremodifikationen (keine).
   4. Klicken Sie auf "Einstellungen" und wählen Sie "Transition Settings '. Wählen Sie die Einstellungen fürden Gerätetyp für die LC / MS-Analyse verwendet.
   5. Klicken Sie auf "Export" und wählen Sie "Transition List 'eine Tabelle zu erstellen, um die erzeugten MRM-Übergänge und Parameter enthält.
5. Analyse durch LC / MS
   1. Legen Sie ein System von binären Gradienten bis (Wasser (A) und Acetonitril (B), die jeweils mit 0,1% Ameisensäure v: v) Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Autosampler, C18 Kern-Schale-HPLC-Säule (10 cm x 2,1 mm verbunden, 2,6 um Partikelgröße) in positive Elektrosprühmodus mit MRM Erkennung betrieben mit einem triple-Quadrupol-Massenspektrometer.
   2. In der Datenerfassungs - Software (zB Analyst), wählen Sie "Datei" und "Neu" und klicken Sie auf "Acquisition Method" im Pop-up - Fenster und klicken Sie auf "OK".
      Hinweis: Es öffnet sich das Instrument Method Editor, der eine Liste der angeschlossenen Geräte enthält, die den Aufbau einer neuen LC / MS-Methode ermöglicht.
   3. Klicken Sie auf "Binary Pump 'und input die Strömungsratenwert (300 & mgr; l / min) und die Gradienten-mal in der Tabelle, um ein binäres Gradientenprofil von 3% B bis 30% B über 22 min und steigt bis auf 100% B bei 23 min für 5 min Einstellung auszuwaschen bevor sie für weitere 6 min zu Anfangsbedingungen und Reäquilibrierung zurückkehrt.
   4. Klicken Sie auf "Autosampler" und legen Sie das Injektionsvolumen (5 ul). Aktivieren Sie die "Needle Wash-Zyklus 'und geben Sie den" Wash Time' (30 sec) und wählen Sie "Flush Port '.
   5. Klicken Sie auf "Säulenthermostat Controller 'und in' Säulenofen Eigenschaften 'setzen Sie die" Linke Temperatur "und" Rechts Temperatur' (40 ° C).
   6. Klicken Sie auf 'Mass Spectrometer' und dann auf 'Parameter bearbeiten' die Quellgasbedingungen einzugeben. Wählen Sie die "Scan-Typ" als "MRM (MRM)" und die "Polarität" als "positiv". Gehen Sie zu 'Periode Zusammenfassung "und geben Sie die' Dauer Time ', die Gesamtzeit für die LC-Analyse eind Äquilibrierung (35 min).
   7. In der Tabelle rechts klicken und wählen Sie "Teilentclusterung Potential (DP)" und "Kollisionsenergie (CP)", um diese Spalten der Tabelle hinzuzufügen. Geben Sie die Q1, Q3, Zeit (msec), ID, DP und CE-Werte für alle Übergänge, für eine einzelne Fleischarten, in der Übergangsliste erstellt (siehe Schritt 1.4.5).
      Hinweis: Zeit (msec) bezieht sich auf die Verweilzeit, die Zeit, das Massenspektrometer Abtasten jeder Übergang verbringt, die Summe von denen sollte nicht mehr als 3 Sek.
   8. Speichern Sie die Acquisition Method-Datei (Dateierweiterung .dam).
      Hinweis: Die Schritte 1.5.2 - 1.5.8 müssen für jede Fleischarten wiederholt werden. Dies wird eine einzige Methode Datei für jeden Fleischarten im Bildmodus in Vorbereitung auf die Analyse unten erstellen.
   9. In der Datenerfassungs-Software, klicken Sie auf "Acquire" und wählen "Äquilibrieren '. In dem Feld, das, wählen Sie die gewünschte Erwerbsmethode zu beginnen, das Instrument Ausgleich öffnet.
   10. Setzen Sie die Probengefäße in arack im Autosampler.
   11. Klicken Sie auf "Datei" und wählen Sie "Neu" und dann "Acquisition Batch". In der 'Sample' wählen Sie die Registerkarte "Add Set" und dann "Add Samples '. Legen Sie die Anzahl der analysierten Proben und klicken Sie auf "OK" werden. In der "Erwerb" Box wählen Sie die Methode Datei, die für die Analyse aus dem Drop-Down-Menü verwendet wird.
   12. In der Tabelle wählen 'Teller-Code "und die entsprechende Fachkonfiguration aus dem Dropdown-Menü auswählen. Linksklick in die Spaltenüberschrift 'Teller-Code' dann mit der rechten Maustaste und wählen "Fill Down '. In 'Vial Position' geben Sie die Position jeder Probe im Autosampler in den Zeilen.
   13. In "Data File" geben Sie den Dateinamen für den Erwerb, dann klicken Sie links im Spaltenkopf durch einen Rechtsklick gefolgt und wählen Sie "Fill Down '. In 'Sample Name' legen Sie die Identität eines jeden der zu analysierenden Proben. Speichern als Akquisitions Batch-Datei (extension .dab).
   14. Klicken Sie auf den "Senden" und dann auf das die Proben markieren, die auf dem LC / MS analysiert werden müssen. Klicken Sie auf "Senden". Klicken Sie auf "Acquire 'und' Start Sample 'um die Analyse zu beginnen.
       Hinweis: Jeder Erwerbsmethode für die MRM-Übergänge über die gesamte Länge des Chromatographen für einen einzelnen Fleischarten zu scannen. Massenspektrometer-Einstellungen für eine MRM Erwerb je nach Gerätetyp und Peptid.
   15. Sehen Sie sich die generierten Daten-Dateien mit Datenanzeigesoftware. Klicken Sie auf XIC (extrahierten Ionen) und in der Dropdown-Liste alle Fragmente markieren (Q3-Werte) für einen einzelnen Vorläufer (Q1). Ein neues Fenster wird geöffnet, dass nur die ausgewählten Übergänge zeigt.
   16. Aufzeichnen der Retentionszeit (R _t) von Gruppen von gleichzeitigen Übergängen , da diese zu einem einzelnen Peptid entsprechen.
   17. Wiederholen der beiden vorhergehenden Schritte für jeden Satz von Übergängen, um die Spitzen zu ihren jeweiligen Peptide für jede zuzuweisender Fleischarten.
   18. Notieren Sie die Marker - Peptide , die für die Bereitstellung von Artbestimmung geeignet sind (zB Peptid HPGDFGADAQGAMTK, Vorläufer m / z = 752, R _t = 12,0 min, für Pferd), zusammen mit ihrer Retentionszeiten, und beachten Sie, welche Paare geeignet für die relative Quantifizierung entsprechenden Form .
       Hinweis: Zum Beispiel kann das Pferd Markerpeptid (Vorstufe m / z = 752) eine entsprechende beef Peptid, HPSDFGADAQAAMSK (Vorstufe m / z = 767, R _t = 13,2 min).
   19. Um ein einzelnes dynamisches Verfahren implementiert, das alle Fleischarten, in der Datenanzeigesoftware, für jede Fleischarten wiederum öffnen die XIC Übergang Daten für jeden Vorläufer (übertragen auf ein bestimmtes Peptid in 1.5.8) zu erstellen.
   20. Zoom auf dem Spitzencluster bei der gewählten Verweilzeit durch Linksklick und Ziehen Sie den Cursor unterhalb des Clusters. Identifizieren Sie die intensivsten Übergänge (mit der rechten Maustaste auf das Spitzenlabel).
   21. notieren Sie manuell die Übergängeund Retentionszeiten in einer Tabelle.
   22. Um die Parameter als neue dynamische Methode auf dem LC / MS-Software einzugeben, klicken Sie auf 'Mass Spectrometer' und dann auf 'Parameter bearbeiten' die Quellgasbedingungen einzugeben. Wählen Sie die "Scan-Typ" als "MRM (MRM)" und die "Polarität" als "positiv".
   23. Gehen Sie zu 'Periode Zusammenfassung "und geben Sie die Zeitdauer (gesetzt als die Gesamtzeit für die LC-Analyse und Ausgleich). In der Tabelle rechts klicken und wählen Sie "Teilentclusterung Potential (DP)" und "Kollisionsenergie (CP)", um diese Spalten der Tabelle hinzuzufügen.
       Hinweis: Die jetzt 'Time' Spalte auf die erwartete Retentionszeit bezieht sich (min) für jeden Übergang.
   24. In dem Abschnitt "Parameter bearbeiten" der LC / MS-Datenerfassungs-Software, überprüfen Sie die "Geplante MRM" Box. Geben Sie den Q1, Q3, Zeit (min), ID, DP und CE-Werte für die Übergänge in der Tabelle erstellt (1.5.21) und speichern Sie die Erwerbsmethode (file Erweiterung .dam).
       Hinweis: Dieses Verfahren verringert typischerweise die Anzahl der MRM-Übergänge zu den vier intensivsten für jedes Peptid und scannt nur über die Retentionszeitfenster für jedes Peptid Spitze, eine verbesserte Empfindlichkeit und Qualität der Daten zu geben. Ein "dynamisches" Verfahren ist ein "geführt Retentionszeit Fensterung" Methode, manchmal Scheduling bezeichnet.

2. Herstellung und Analyse von Kalibrierproben

1. Gewinnung von Fleischmischungen
   1. Verwendung Fleisch eingefroren zuvor dann zu einem Pulver gemahlen, bereiten eine Reihe von Fleischmischungen durch Wiegen jeweiligen Mengen von Fleisch (Gesamtmasse von etwa 300 mg) in 15 ml Plastikzentrifugenröhrchen.
   2. 4 ml Extraktionspuffer (0,15 M Kaliumchlorid + 0,15 M Phosphatpuffer bei pH 6,5). Vortex für 30 Sekunden. Extrakt auf einen Laborschüttler bei Raumtemperatur für 2 h bei 250 Zyklen / min.
      Hinweis: Zyklen / min auf eine oszillierende Bewegung bezieht.
   3. Übertragen Sie 2 ml derExtrahieren in ein 2 ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 4 ° C bei 17.000 x g.
   4. Transfer 200 ul Aliquots des Überstandes (eine kleine Menge für Protein-Assay zu reservieren, siehe 2.2) in 2 ml Zentrifugenröhrchen und trocken eine zentrifugale Verdampfer (voreingestellten Programm: 50 ° C, ohne Entlüftung und 120 min Dauer).
2. Protein-Assay
   1. Transfer 7 & mgr; l Aliquots des reservierten Überstand (siehe 2.1.4) in dreifacher Ausführung in die Wells einer 96-Well-Platte.
   2. Transfer 7 & mgr; l Aliquots einer Reihe von Protein-Standards in dreifacher Ausführung, Bereich 0 - 1,0 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA), auf den gleichen 96-Well-Platte.
   3. Mit 200 & mgr; l Coomassie Plus Protein Assay Reagenz in jedes Well.
   4. Optisch vergleichen die Farbe der Probenbehälter mit den Protein-Standards die Proben im Bereich der Kalibrierungsstandards zu überprüfen. Falls erforderlich, wiederholen mit verdünnter Probe, so dass es in Reichweite wird.
   5. Lassen Sie die Platte zu stund für 3 min.
   6. Burst keine Blasen, die mit einer Injektionsnadel gebildet haben.
   7. Analysieren Sie die Platte auf den Leser Platte mit einem Standard-Endpunkt-Protokoll bei einer Wellenlänge von 595 nm verwendet wird.
   8. Bestimmung der Proteinkonzentration der Proben Kalibrierungsdaten aus der Proteinstandards.
      Anmerkung: Dies ist für die Berechnung der Menge an Trypsin in dem tryptischen Verdaus verwendet erforderlich ist.
3. Proteolyse von Fleischmischungen
   1. Abgeblasen, und der getrocknete Rückstand aus Schritt 2.1.4 in 1 ml 25 mM Ammoniumbicarbonat-Lösung. Gut mischen auf einem rotamixer.
   2. Folgen Sie dem Protokoll von Schritt 1.1.3 bis 1.3.7.
4. Analyse durch LC / MS
   1. Richten Sie die LC / MS wie zuvor (Schritt 1.5.1).
   2. Erstellen Sie eine neue Akquisition Batch wie zuvor skizziert (Schritte 1.5.9 - 1.5.14), die Auswahl der Erwerbsmethode bei Schritt bei 1.5.24 erstellt, die eine dynamische LC / MS-Methode verwendet alle Fleischarten kombiniert, und erfassen die Daten für die Digested Fleischproben.
   3. Rufen Sie das vollständige Chromatogramm in der Datenanzeigesoftware. Zeigen Sie den XIC für jeden Übergang wiederum gesetzt. Visuell bestätigen jeder Cluster die erforderliche Anzahl von glockenförmigen Spitzen bei der erwarteten Retentionszeit enthält, um dadurch die Existenz des ausgewählten Peptids bestätigt.
   4. Führen Sie die Quantifizierung der Daten Betrachtungssoftware mit Peakflächen für jeden der Übergänge von Interesse durch einen Doppelklick auf 'Build Quantifizierungsverfahren "in der Navigationsleiste zu integrieren.
   5. Im 'Select Sample' Fenster wählen Sie die "Data File" und die "Sample 'analysiert werden, um eine" Analyte "Tabelle zu generieren.
   6. Klicken Sie auf die Registerkarte "Integration" der erste der Übergänge (Analyte) zum Anzeigen integriert werden.
   7. Klicken Sie auf "Analyte" Feld der Drop angezeigt Down-Liste der Übergänge. Wählen Sie jeden Übergang wiederum, um es anzuzeigen und visuell zu bestätigen, die richtige Spitze für die Integration ausgewählt ist. Um modify oder die Integration der linken Maustaste drücken und den Cursor über den Soll-Spitzen ziehen (dies wird in grün markiert). Klicken Sie auf das 'Select Peak' Taste und klicken Sie auf "Übernehmen".
   8. Speichern Sie die Arbeitsbereich als Methodendatei (.qmf).
      Hinweis: Dies ist ein Quantifizierungsverfahren Datei Peakflächen für die spätere Berechnung der Probe erzeugt.
   9. Doppelklicken Sie auf 'Quantifizierung Wizard "in der Navigationsleiste. Im Fenster 'Select Samples' 'Quantifizierung Set' erstellen, indem Sie einen einzelnen 'Data File' auswählen und dann ein oder mehrere 'Verfügbar Samples'. Wählen Sie 'Weiter' 'Wählen Sie Einstellungen und Query' Feld anzuzeigen. Lassen Sie mit Standardeinstellungen, wählen Sie 'Weiter' 'Select-Methode "anzuzeigen. Wählen Sie im Dropdown "Methode" Feld der "Integrationsmethode" Datei in Schritt 2.4.8 erstellt wählen, wählen Sie dann "Fertig stellen".
      Hinweis: Dies erzeugt eine "Ergebnistabelle", einschließlich Übergang Peakflächen von Fleischmischungen entstehen.
   10. Speichern Sie die "Ergebnistabelle '(Dateierweiterung .rdb), Export als Textdatei (.txt) und in Tabellenkalkulations öffnen, um die Daten überprüfen.
   11. Plot Diagramme des Prozentsatzes (durch Übergangspeakfläche) eines Fleisch in einem anderen Vergleich der gemessenen Prozentsatz (w / w) der zwei Fleisch für den ausgewählten MRM für ausgewählte Übergänge von Peptiden entsprechen, über die Fälle konzentriert, in denen die beiden Fragmente die enthalten gleiche Anzahl von Aminosäuren von der C-terminalen Ende gezählt.
       Hinweis: Identische Fragmente mit identischen Fragmentierungsstellen optimale Ergebnisse.
   12. Untersuchen Sie die Plots von 2.4.11 oben. Entweder visuell oder eine Trendlinie Werkzeug im Plotten Paket verwenden, identifizieren eine Gruppe von Grundstücken, die sowohl linear sind und von ähnlichen Gradienten. Verwenden Sie eine oder mehrere dieser CPCP Plus Fragment Kombinationen für die Kalibrierung in Echtfleischproben.
       Hinweis: Eine Darstellung, die eine ungewöhnliche Steigung zeigen, können entweder Peptid oder Fragment Unterdrückung mit einer daraus folgenden Verringerung der Signal stre zeigennge. Nicht-lineare Plots schlechte Spitzenerfassung oder andere Probleme hinweisen.

3. Fleischproben

1. Extraktion von Proteinen aus Zielfleischproben
   1. Gegebenenfalls Verbrauchfremd Nicht-Fleisch-Material aus der Probe mit einem Spatel. Zum Beispiel abkratzen Soße und Nudeln aus einem gekühlten Lasagne.
   2. Wiegen 20 g des Fleisches in einen Metallbecher.
   3. 100 ml 0,15 M Kaliumchlorid / 0,15 M Kaliummonophosphat-Puffer bei pH 6,5.
   4. Extrahieren Sie die Proteine, die durch das Fleisch in einem Hochgeschwindigkeits-Homogenisator Mischen für 1 min.
   5. Folgen Sie dem Protokoll von Schritt 2.1.4 - 2.3.2.
2. Analyse der Proben durch LC / MS
   1. Wiederholen Sie Schritt 2.4.2 zu erfassen Daten, die die dynamische LC / MS-Methode.
   2. Identifizieren Sie die Peptide, die von jedem Fleisch Myoglobin, wie in Schritt 2.4.3 durchgeführt.
   3. Zur Quantifizierung, Quantifizierungssoftware verwenden, um die Spitzenbereiche für jeden Übergang von Interesse zu integrieren,wie es in Schritt 2.4.9 beschrieben.
   4. Für die Identifizierung von Spezies in einem Gemisch, diejenigen Markerpeptide erfüllt vereinbarten Kriterien für Zahlen von Übergängen aufgezeichnet und für die Übergänge zu Signalrauschen.
   5. Zur Quantifizierung verwenden integrierte Übergangspeakflächen wie aus Schritt vereinbarten 2.4.12 und Prozentsatz unter Verwendung von Übergangspeakfläche, die Berechnung der Prozentsatz von Myoglobin aus den beiden Spezies in der Mischung.
   6. Verwenden Vorwissen aus der Literatur ¹⁸ wahrscheinlich Myoglobin Ebenen in das Fleisch , die relativen w / w Mengen von zwei Fleisch in der Probe vorhandenen zu schätzen.

Ergebnisse

In einem einzigen Experiment MRM dynamic-Modus jeder programmierte Übergang wird separat aufgezeichnet (als Detektor Zählungen pro Sekunde, cps) über ein Retentionszeitfenster angegeben. Daher von allen in einem Experiment gesammelten Daten, die Spitzenintensität für jeden Übergang können einzeln entnommen werden. Dann ist die einzige endliche Signal ist für die Retentionszeitfenster für diesen Übergang festgelegt. Außerhalb des Fensters, das Signal Null ist per Definition. Das Signal für einem Übergang zum Beispiel 752 → 1269 von Pferd (Peptid monoisotopisch Masse 1,501.66 Dalton, Vorläufer - Ionen m / z 751,84 Dalton, state = 2, Fragment - Ion y ¹³ aufzuladen) hat typischerweise nur Rauschen mit der Messung zu konkurrieren und nicht von anderen Übergangsspitzen, die vielleicht von anderen Spezies sein könnten. Der Ausgang ist daher eine Reihe von sauberen Spitzen, eine pro Übergang zu einer gemeinsamen Verweilzeit für die Übergänge eine gemeinsame Vorläuferionen zu teilen.

Abbildung 1 zeigt die Ausgabe für den Satz von vier Übergänge 752 → (1269, 706, 248, 1366) für eine Mischung von 1% w / w Pferd in Rindfleisch. Da die vier angezeigten Übergänge mit Pferd verbunden sind, und in Proben von reinem Rindfleisch, Lamm oder Schwein fehlen, bedeuten diese Spitzen die Anwesenheit von Pferd. Je nach Robustheit Kriterien, einen Satz von zwei oder mehr Übergänge von mehr als jeweils eine spezifizierte Signal-Rausch-Pegel Identifikation herstellt. Diese Zahl stellt daher das Vorhandensein von Pferd in der Mischung von 1% w / w Pferd in Rindfleisch.

Gelegentlich wird ein einzelner isolierter Übergang erkannt. Dies zeigt eine Möglichkeit Spiel von Vorläuferionen und einem einzelnen Fragment, möglicherweise von einem Fremdprotein, mit denen aus dem System erwartet und in das Massenspektrometer programmiert. Die einzigartige Natur des Peaks und dessen Auftreten bei einem unerwarteten Retentionszeit ist die signature eines zufälligen Übergang, der ignoriert werden kann.

Die Fläche unter jedem Übergang Spitze kann individuell berechnet werden. Basierend auf einem geeigneten Fragment, das Verhältnis von Pferd beef Übergang Peakflächen, beispielsweise 752 → 1269 (Pferd) bis 767 → 1299 (Rind), werden in der Mischung mit dem Verhältnis der tatsächlichen Fleisch proportional sein. Figur 2 a zeigt , von Peakfläche Grundstück Prozentsatz für diese beiden Übergänge gegenüber dem Prozentsatz bei gleichem Gewicht des Pferdes in einer Mischung aus Pferd mit Rindfleisch. Wenn der Prozentsatz Übergang Spitzenbereiche der Prozentsatz bei gleichem Gewicht von Fleisch passen dann ist die Steigung 1. Die Steigung in diesem Plot 1,03 ist, was darauf hinweist, dass für diese Übergänge und CPCP Paar, die Übergangspeakflächen ein verlässliches Maß für den relativen Mengen geben der beiden Fleisch in dem Gemisch. Wenn das Pferdefleisch in der Probe war doppelt so reich an Myoglobin als Rindfleisch dann, zusammen mit anderen Faktoren unverändert, die Steigung der Linie wäre größer als eins ist.

Abbildung 1. MRM Übergang Intensitäten im Vergleich zu Retentionszeit für 1% w / w Pferd in Rindfleisch. Die Übergänge sind 752 → (1269, 706, 248, 1366), in orange dargestellt, schwarz, blau und grün sind. Die Markerpeptid ist HPGDFGADAQGAMTK. Die vier Übergangsfragmente können y ^13, y ^7, y ² und y ¹⁴ jeweils bezeichnet werden, wobei y ⁿ Zählen in Ende n Aminosäuren vom Peptid C-terminal bezeichnet. Das Signal-Rausch variiert von 23 bis 53 auf die vier Übergänge. Eine zusätzliche rote Linie zeigt die 752 → 1269 Übergang für 0% Pferd, 100% Rindfleisch für den Vergleich. Nur die Nicht-Null-Bereich der Retentionszeit wird angezeigt. Diese Zahl wurde von Watson verändert et al. ^3.es / ftp_upload / 54420 / 54420fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Plot des Pferdes in Rindfleisch, als Prozent bei gleichem Gewicht, im Vergleich zu Pferd in Rindfleisch als Prozent Übergang Peakfläche. Das Grundstück , das Paar von Peptiden Rindfleisch verwendet (767) und Pferd (752) und der y - ¹³ Fragment - Ion für beide. Wenn ein Peak - Fläche bezeichnet , dann ist die Ordinate 100 A _H / (A + A _{H B).} Die Steigung der Best - Fit - Linie (R ² = 0,99) ist 1,03. Diese Zahl wurde von Watson verändert et al. ^3. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Die Auswahl eines geeigneten Zielproteins ist wichtig. Ein gutes Zielprotein muss entsprechende Formen in Spezies von Interesse, ausreichend artspezifische Sequenzvariation, Artenspezifizität und existieren in zugänglichen Mengen innerhalb der Organismen haben. Zur Beurteilung der Mischungen, die verarbeitet worden sind (beispielsweise Wärmebehandlung), ein Protein mit einer Sequenz relativ immun gegenüber diesem Verarbeitung aufweist, ist wünschenswert. Myoglobin ist ein guter Kandidat für rotes Fleisch, einschließlich gekocht rotem Fleisch, ist aber nicht die einzige Möglichkeit. Sobald das Zielprotein entschieden wird, ist der kritischste Teil des Protokolls das Protein Proteolyse. Ein Protein unterscheidet sich von Myoglobin kann auch ein alternatives Proteolyse Protokoll verlangen.

Das Protokoll enthält basierend auf Referenz gereinigtes Protein ein Segment beschrieben. Diese zielt darauf ab, Retentionszeitfenster und geeignete Vorstufe und Fragmentionen entdecken. Dieses Segment ist sehr hilfreich, aber nicht unbedingt erforderlich.

Obwohl entsprechenden Peptidpaare von zwei Spezies von Interesse auch ohne Experiment aufgeführt werden können, ist es manchmal der Fall, dass eine Sequenzunterschied dramatische Auswirkungen auf die Verdauungsprofil aufweist. Zum Beispiel kann das Peptid Paar VLGFHG (Rind) und ELGFQG (Pferd) geben eine anomale Quantifizierung Ergebnis (Manifest als Steigung weniger als ein in Abbildung 2). Dies ist, weil das letztere Peptid aus einem relativ unterdrückt KE Spaltung entsteht, in dem Gemisch eine Unterschätzung des Pegels des Pferdes verursacht. Entsprechende Peptide mit verschiedenen Aminosäuren beginnen, werden deshalb am besten vermieden werden. Oft werden die Fragmente aus zwei entsprechenden Peptide haben identische Aminosäuresequenzen und sind gut erzogene, aber dies ist nicht immer der Fall und muss während der Verfahrensentwicklung überprüft werden. Spezies Identifizierung ist viel weniger empfindlich auf diese Fragen als relativen Quantifizierung.

Das Protokoll wurde für vier rotes Fleisch nachgewiesens ^3. Zusätzliche Fleischarten können eingeschlossen werden, obwohl die Qualität des Übergangs Peakform verschlechtern kann, wenn zu viele Markerpeptide koeluieren, effektiv die Verweilzeit reduziert und schließlich relativen Quantifizierung Schätzungen zu verschlechtern. Verbesserte Instrumentierung, bereits vorhanden, wird dies zu verbessern. Ein ähnliches Problem ist, dass nicht alle Fleisch unterschiedliche Myoglobinen haben. Zum Beispiel, Pferd, Esel und Zebra Myoglobinen identisch sind und somit das Verfahren streng genommen ist nur in der Lage Pferd oder Esel oder Zebras in Rindfleisch zu erkennen. In einigen Fällen, obwohl Myoglobine nicht identisch sind, können einige der wichtigsten Peptide sein. Zum Beispiel werden einige Lamm Myoglobin-derived Markerpeptide auch in Ziege.

Eine Komplikation mit Blick auf diese und andere Protein-basierte Quantifizierungsmethode ist, dass die Protein-Ebene in allen Spezies konstant angenommen werden muss, wenn das Protein oder Peptidspiegel trivialer auf ein Niveau von Fleisch in einer Mischung gleichzusetzen sind. Für Myoglobin und die vier roten misst nicht überall der Fall ist. Die Ebenen sind in der Regel Spezies abhängig, mit Schweinefleisch der untersten Ebene der vier zeigt. Darüber hinaus variiert die Myoglobin-Ebene mit Fleisch schneiden und Alter der Tiere. So obwohl Verhältnisse des Übergangs Peakflächen Karte zuverlässig Verhältnisse von Myoglobin, ist die Zuordnung zu Verhältnis der tatsächlichen Fleisch eine Schätzung Zeichnung auf Annahmen in Bezug auf wahrscheinlichen Quellen des Fleisches in der Mischung.

Der Ansatz in dieser Arbeit skizziert unterscheidet sich in mehrfacher Hinsicht von anderen veröffentlichten Beiträge. Eine typischere Route ist proteomic Methoden verwenden verschiedene unterschiedliche Arten abhängigen Markerpeptide zu identifizieren, wobei die Markierungen für die verschiedenen Arten keine besondere Beziehung besitzen miteinander ^8-12,14,19. Im Gegensatz dazu haben wir Proteine ​​, die für alle Arten von Interesse ausgewählt von bis zu artspezifischen Sequenz ³ Varianten. Abgesehen davon, dass im Mittelpunkt unserer relativen Quantifizierung Strategie, hat dies den Vorteil, dass die ProbeVorbereitungsstrategien optimiert werden. Darüber hinaus könnte eine solche entsprechenden Proteine ​​in ähnlicher Weise beispielsweise zu verhalten erwartet werden, in Extraktions- oder in der kommerziellen Verarbeitung von Proben, wie beispielsweise Kochen oder canning. Artbestimmung geht dann normalerweise über den Nachweis von unterschiedlichen Markerpeptide, während in den CPCP Ansatz zur Bestimmung von Arten Erlöse über den Nachweis von eng verwandten Peptide typischerweise ein oder zwei Sequenzunterschiede aufweisen. Schließlich Quantifizierung von Proteinen , die Gewichtsprozent von einer Spezies in eine andere zu schätzen konventionell über absolute Quantifizierung jedes Protein separat auf bekannte Standards gehen könnte ^7,14,15. Jedoch mit der CPCP Verfahren keine Notwendigkeit für Kalibrierverfahren besteht. Stattdessen werden relativen Pegel durch den Vergleich Signalstärken von zwei entsprechenden Peptide, die aus den beiden Arten geschätzt, insgesamt die absolute Messstufe zu umgehen. Da das Endziel ist ein Gewichtsanteil von einer Spezies in another, eine relative Quantifizierung, ist die CPCP sowohl direkter und einfacher als zwei absolute Quantifizierungsmessungen verglichen wird. Diese Funktionen übersetzen in kurzen experimentellen Zeiten, erwartet etwa zwei Stunden unter Verwendung von raffiniertem Protokolle zu sein, so dass die Technik nützlich als schnelle Überwachungs-Tool im Bereich der Lebensmittelbetrugserkennung.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Uniprot database	www.uniprot.org		Frei zugängliche Datenbank von Proteinsequenzen
Skyline Software	www.skyline.gs.washington.edu		Kostenlose Software zum Download, die die Erstellung gezielter Methoden für proteomische Studien, Peptide und Fragmente ermöglicht Prognose
Ammoniumbicarbonat	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Großbritannien www.sigmaaldrich.com	O9830
Methanol, HPLC-Qualität	Fisher Scientific, Loughoborough, Großbritannien www. fisher.co.uk	10674922
Acetonitril, HPLC-Qualität	Fisher Scientific, Loughoborough, Großbritannien www. fisher.co.uk	10010010
Urea	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Großbritannien www.sigmaaldrich.com	U5378
Trypsin (aus Rinderpankreas, behandelt mit TPCK)	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Vereinigtes Königreich www.sigmaaldrich.com	T1426
Ameisensäure	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Großbritannien www.sigmaaldrich.com	F0507
Coomassie Plus Protein Assay Reagenz	Thermo Fisher Scientific www.thermofisher.com	1856210
Protein Standard	Sigma-Aldrich Co Ltd, Gillingham, Großbritannien www.sigmaaldrich.com	P0914
Ultra Turrax Homogenisator T25	Fisher Scientific, Loughoborough, UK www. fisher.co.uk	13190693
Edmund and Buhler KS10 Laborschüttler
Heraeus Fresco 17 Zentrifuge	Thermo Fisher Scientific www.thermoscientific.com	75002420
Vakuumzentrifuge RC 1022	Jouan
Plate Reader
Strata-X 33u polymere Umkehrphasenkartuschen 60 mg/3 ml Röhrchen	Phenomenex, Macclesfield, UK	8B-S100-UBJ
4000 QTrap Dreifach-Quadrupol-Massenspektrometer	AB Sciex, Warrington, UK www.sciex.com
1200 LC-System mit schneller Auflösung	Agilent, Stockport, UK
XB C18 Umkehrphasen-Kapillarsäule (100 mm x 2,1 mm, 2,6 & Mikro; m Partikelgröße)	Phenomenex, Macclesfield, Großbritannien www.phenomenex.com
Analyst 1.6.2 Software	AB Sciex, Warrington, Großbritannien www.sciex.com		QTrap-Datenerfassung und -analyse, einschließlich Peak-Area-Integration
Autosampler-Fläschchen