House Ear Institute-Organ of Corti 1 (HEI-OC1) ist eine der wenigen Maus-Hörzelllinien, die derzeit für Forschungszwecke verfügbar sind. Dieses Protokoll beschreibt, wie mit HEI-OC1-Zellen gearbeitet werden kann, um die zytotoxischen Wirkungen von pharmakologischen Arzneimitteln sowie die funktionellen Eigenschaften von Innenohrproteinen zu untersuchen.
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Methodenartikel
Arbeiten mit Auditory HEI-OC1-Zellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
HEI-OC1 ist eine der wenigen Maus-Hörzelllinien, die für Forschungszwecke zur Verfügung stehen. Ursprünglich als In-vitro-System für das Screening ototoxischer Arzneimittel vorgeschlagen, wurden diese Zellen verwendet, um arzneimittelaktivierte apoptotische Signalwege, Autophagie, Seneszenz, den Mechanismus des Zellschutzes, Entzündungsreaktionen, Zelldifferenzierung, genetische und epigenetische Wirkungen pharmakologischer Arzneimittel, Wirkungen von Hypoxie, oxidativen und endoplasmatischen Retikulumstress und die Expression molekularer Kanäle und Rezeptoren zu untersuchen. Neben anderen wichtigen Markern der Cochlea-Haarzellen exprimieren HEI-OC1-Zellen endogen Prestin, das paradigmatische Motorprotein der äußeren Haarzellen. Daher können sie sehr nützlich sein, um neue funktionelle Aspekte dieses wichtigen auditorischen Proteins aufzuklären. HEI-OC1-Zellen sind sehr robust, und ihre Kultur weist in der Regel keine großen Komplikationen auf. Sie erfordern jedoch einige besondere Bedingungen, wie z. B. die Vermeidung der Verwendung gängiger antibakterieller Cocktails, die Streptomycin oder andere Antibiotika enthalten, sowie die Inkubation bei 33 °C, um die Zellproliferation zu stimulieren, und die Inkubation bei 39 °C, um die Zelldifferenzierung auszulösen. Hier beschreiben wir, wie HEI-OC1-Zellen kultiviert und in einigen typischen Assays verwendet werden, wie z. B. Zellproliferation, Lebensfähigkeit, Tod, Autophagie und Seneszenz, sowie wie Patch-Clamp- und nichtlineare Kapazitätsmessungen durchgeführt werden.
Einleitung
House Ear Institute-Corti - Organ 1 (HEI-OC1) Zellen werden aus dem Hörorgan einer transgenen Maus 1,2 abgeleitet. Inkubation einer beliebigen Zelle aus dieser transgenen Maus , bei 33 ° C / 10% CO 2 (permissive Bedingungen) induziert die Expression eines Gens , das Immortalisieren Entdifferenzierung und beschleunigter Proliferation auslöst; Bewegen der Zellen auf 39 ° C / 5% CO 2 (nicht-permissive Bedingungen) führen zu einer verminderten Proliferation, Differenzierung und zumindest im Fall von HEI-OC1, Zelltod 2,3.
HEI-OC1-Zellen wurden in unserem Labor vor über einem Jahrzehnt kloniert und ch....
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Protokoll
1. Zellkultur
Hinweis: Alle Zellkulturprotokolle müssen unter Verwendung geeigneter Zellkulturtechniken durchgeführt werden (als Referenz siehe die ersten drei Kapitel der Zellbiologie: A Laboratory Handbook, Band I 10). HEI-OC1-Zellen benötigen keine zusätzliche Beschichtung oder Behandlung der Zellkulturschalen für eine ordnungsgemäße Anhaftung und Wachstum. Sehr wichtig: Verwenden Sie keine Glaswaren Geschirr für die Zellkultur Zwecke; der Phänotyp und biologische Reaktion der Zellen auf pharmakologische Wirkstoffe ändert (G Kalinec & F Kalinec, nicht veröffentlicht); herkömmlichen Kunststoff-Zellkulturschalen (siehe Tabelle d....
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Ergebnisse
In ein paar jüngsten Veröffentlichungen berichteten wir eine umfassende Reihe von Studien zur Bewertung der Reaktion von dem Ziel HEI-OC1 - Zellen auf mehrere häufig verwendete pharmakologische Wirkstoffe sowie die Untersuchung prestin Funktion 8,9. In diesen Studien haben wir die Verwendung aller Protokolle in den vorhergehenden Abschnitten beschrieben.
Eines der Ergebnisse dieser früheren Studien war , dass HEI-OC.......
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Diskussion
In diesem Bericht beschreiben wir, wie sie zur Kultur HEI-OC1-Zellen und verwenden Mechanismen der medikamenteninduzierten Zytotoxizität zu bewerten und funktionellen Eigenschaften von Prestin, der molekulare Motor der Cochlea-OHC zu untersuchen. Die technischen Verfahren sind jedoch allgemein genug, um leicht an verschiedene Studien anzupassen.
Alle Protokolle hier beschrieben sind, erfordern die korrekte Verwendung von gut etablierten Zellkulturtechniken 10. Genau wie bei jedem .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein bestehender oder potenzieller Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R01-DC010146 und R01-DC010397 unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health dar.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HEI-OC1-Zellen | ALLE ASSAY-KITS, AUSRÜSTUNGEN | ||
| Klasse II Biologische Sicherheitswerkbank | Die Baker Company | Sterilgard III | UND DIE IN DER |
| Kühlzentrifuge | Eppendorf | 5810R | VORHERIGEN 2 SÄULEN ANGEGEBENEN UNTERNEHMEN SIND NUR |
| Inverses Mikroskop | Zeiss | Axiovert 25 | BEISPIELE, UND JEDES ANDERE ÄHNLICHE |
| WASSERBAD | Stovall | HWB115 | PRODUKT KÖNNTE VERWENDET WERDEN. |
| Zellzähler | Nexcelom | Cellometer Auto T4 | |
| Zwei (2) Zellinkubatoren, einer bei 33 > C/10% CO2 und andere bei 39 ° C/5% CO2 | Forma Scientific | 3110 | |
| Zellkulturschalen, PS, 100 mm x 20 mm mit Belüftungsöffnungen | Greinier Bio-One | 664-160 | |
| Zellkulturschalen, PS, 60 mm x 15 mm mit Belüftungsöffnungen | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Cellstar Gewebekulturflaschen 250 ml | Greiner Bio-One | 658-175 | |
| nbsp | |||
| ; 6 Well Zellkulturplatte, mit Deckel-Cellstar | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Microtest Gewebekulturplatte, 96 Well, flacher Boden mit Deckel | Becton Dickinson | 353072 | |
| Micro-Assay-Plate, Chimmey, 96 Well weiß, klarer Boden | Greiner Bio-One | 655098 | |
| 50 ml Polypropylen konisches Röhrchen mit Kappe Cellstars | Becton Dickinson | 352070 | |
| 15 ml konische Gefäße aus Polypropylen mit Verschluss-Cellstars | Greiner Bio-One | 188-271 | |
| PBS pH 7,4 (1x) | Life Technologies | 10010-023 | |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Hyclone | SH10073.1 | |
| Leibovitz's L-15 Medium, kein Phenolrot | Gibco/Invitrogen | 21083-027 | |
| Trypsin, 0,25% | Life Technologies | 25200-056 | |
| TACS MTT Zellproliferations-Assay-Kit | Trevigen | 4890-25-K | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Kit | Promega | G8091 | |
| BrdU-Zellproliferations-Assay-Kit | Zell-Signalweg | 6813 | |
| Nicht-enzymatische Zelldissoziationslösung | Sigma-Aldrich | C5789 | |
| Cell-Tox Green Zytotoxizitäts-Assay-Kit | Promega | Nr. G8741 | |
| FACSAriaIII Instrument | BD Biowissenschaften | FACSAriaIII | mit 488 nm Anregung (blauer Laser) |
| Digital Blot Scanner | LI-COR | C-DiGit | |
| Elektrophorese und Blotting Unit | Hoefer | SE300 miniVE | |
| Spectra Max 5 Plate Reader mit Soft Max Pro 5.2 Software | Molecular Devices | SpectraMax 5 | |
| Patch-Clamp Verstärker | HEKA | EPC-10 | |
| Puller zur Vorbereitung Patch-Elektroden | Sutter Instruments | P-97 |
Referenzen
- Jat, P. S., et al. Direct derivation of conditionally immortall cell lines from an H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 5096-5100 (1991).
- Kalinec, G. M., Webster, P., Lim, D. J., Kalinec, F. A cochlear cell li....
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Nachdrucke und Genehmigungen
