Ein Protokoll , ein Poly (N iso-propylacrylamid) (PIPAAm) beschichtet Mikro für effektive Erfassung und thermoresponsive Freisetzung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) präsentiert zu nutzen. Diese Methode ermöglicht Erfassung von CTC aus dem Blut des Patienten und die anschließende Freisetzung von lebensfähigen CTC für Downstream-Off-Chip-Kultur, Analysen und Charakterisierung.
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Methodenartikel
Erfassung und Veröffentlichung durchführbare zirkulierender Tumorzellen aus Blut
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir zeigen ein Verfahren zur Größe basierte Erfassung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus Vollblut, zusammen mit der Freisetzung dieser Zellen aus Chip für Downstream-Analyse und / oder Kultur. Die Strategie setzt die Verwendung eines Porenmikro neuartigen Parylene C Membran Schlitz zu erfassen CTC und eine Beschichtung aus Poly (N -iso-propylacrylamid) (PIPAAm) für thermoresponsiven tragfähige Freisetzung des eingefangenen CTC. Das Einfangen von lebenden Zellen wird durch die Nutzung der Gestaltung eines Schlitzes Porengeometrie mit spezifischen Abmessungen ermöglichte die Scherspannung zu verringern, die typischerweise mit den Filtrationsprozess verbunden. Während die Filter nicht mit einer hohen Abscheidegrad aufweist, ist die Freisetzung dieser Zellen nicht trivial. Typischerweise sind nur ein kleiner Prozentsatz der Zellen freigesetzt wird, wenn Techniken wie Umkehrströmung oder Zell Schaben verwendet werden. Die starke Haftung dieser epithelialen Krebszellen auf die Parylene C-Membran ist auf unspezifische elektrostatische Wechselwirkung. Entgegenzuwirken thEffekt ist, verwendet wir die Verwendung von PIPAAm Beschichtung und ihre Wärme ansprechenden Grenzflächeneigenschaften ausgenutzt, die Zellen von dem Filter zu lösen. Blut wird zuerst bei Raumtemperatur filtriert. Unter 32 ° C, ist PIPAAm hydrophil. Danach wird der Filter entweder in Kultur platziert Medien oder einem Puffer bei 37 ° C gehalten wird, die in der PIPAAm führt hydrophoben Drehen und anschließend die elektrostatisch gebundenen Zellen freigesetzt wird.
Einleitung
Metastasierten Erkrankung ist verantwortlich für die meisten Todesfälle durch Krebs. Die Entwicklung prognostischen und diagnostischen Begleit Biomarker für die Metastasierung ist in der Krebs Management und Behandlung von entscheidender Bedeutung. Zirkulierende Tumorzellen (CTC) spielen eine zentrale Rolle bei der Tumorausbreitung und Metastasierung. Des Weiteren als "flüssige Biopsie Biomarker leicht zugänglich zu sein, CTC bei Krebspatienten Tummelplatz" für Krebs Biomarker-Forschung 'peripheren Blut wurde als gestiegen ". 3 - CTC wurden als prognostischer Biomarker bei verschiedenen Krebserkrankungen, einschließlich Brust-, Prostata- und Darmkrebs 1 gut validiert. Jüngsten Fortschritte in der CTC - Feld hat jedoch darauf hingewiesen , dass die bloße Aufzählung dieser seltenen Zellen klinischen Nutzen beschränkt hat, als 4 in der interventionellen klinischen Studien gezeigt. Somit gibt es eine wachsende Nachfrage nach Technologien, die für die molekulare und funktionelle Charakterisierung von CTC ermöglichen. Derzeit sind nur wenige Technologien existieren, mit denen for Nicht-Antigen voreingenommen, durchführbare Erfassung und Freigabe von CTC und ermöglicht robuste nachgeschalteten molekularen und funktionellen Analyse 5,6. Mehrzahl dieser mikrofabrizierten Geräte an mikrofluidischen Plattformen gekoppelt und damit einen begrenzenden Faktor in der Menge von Blut, die die verarbeitet werden können, die von 2 bis 4 ml 7 reicht - 10. CTC sind seltene Ereignisse in einem einzigen Rohr aus Blutentnahme (7,5 ml), daher weiter die Menge an Blut zu reduzieren, die verarbeitet werden können, stark behindert die Chancen für die Erfassung und diese Zellen von Interesse zu isolieren.
Wir haben für die Erfassung von CTC zwei Arten von Parylene C Membranmikro Geräte entwickelt , die die Größenunterschiede zwischen größeren Tumorzellen und den kleineren normalen Blutzellen 11,12 auszunutzen. Wir haben zuvor auf dem runden Poren Enumeration Filter berichtet und verglichen sie mit einer FDA-zugelassenen Plattform, wo die Mikro in CTC - Capture - Effizienz überlegen gezeigt wurde ,für Krebspatienten Blutproben 13,14. Jedoch eine Begrenzung des Rundfilters ist die Notwendigkeit, eine Formaldehydbasis Fixiermittel vor der Filtration zu verwenden. Dieser Prozess bewahrt die Zellen Morphologie, während es ihnen ermöglicht, die Scherspannung und Druck während des Filtrationsprozesses zu widerstehen. Während Aufzählung und molekulare Untersuchungen können auf dem Chip 13 durchgeführt werden, beeinträchtigt die Fixiermittel die Fähigkeit , funktionelle Charakterisierung durchzuführen. Um diese Einschränkung zu begegnen, entwickelten wir einen Schlitz Porenfilter, der die Notwendigkeit negiert zu fixieren Zellen vor der Filtration (Abbildung 1). Die Schlitzporengeometrie (6 & mgr; m Breite x 40 & mgr; m Länge Schlitzporen) ermöglicht es den Tumorzellen, während nur teilweise eine Pore und somit noch ermöglicht einen freien Durchgang für andere Blutzellen und die Linderung der Druckanstieg Okkludieren erfasst werden, die zu Zellschäden führen würde und schließlich Platzen 15,16 der Schlitz Poren Kartusche besteht aus zwei Acrylstücke , die Sandwichder Schlitz Porenfilter , der zwischen dem oberen und unteren Teil mit Polydimethylsiloxan (PDMS) , die als eine Dichtung , die eine lecksichere Dichtung 14,15 (Figur 1) zu liefern.
Während die Abscheidungseffizienz des Schlitzes Porenfilter ist hoch, (Tabelle 1), werden die erfassten CTC an die Membran gebunden Parylene C durch starke unspezifische elektrostatische Wechselwirkungen statt extrazellulären Matrix (ECM) 15 vermittelte Adhäsion. Verfahren wie Umkehrströmung oder die Verwendung von Zell-Schaber versagen die Zellen von dem Filter effektiv zu lösen, oder in Zellschädigung und Zelltod führen. Wir erkundeten einen unkonventionellen Einsatz von PIPAAm Release - Strategie 15 zu formulieren. PIPAAm ist ein Polymer , das bei einer Lösungstemperatur von 32 ° C 17 eine reversible untere kritische Lösungstemperatur (LCST) Phasenübergang erfährt. Traditionell ist diese Eigenschaft von PIPAAm für Tissue-Engineering-Anwendungen weit erforscht. Typischerweise werden Zellenkultiviert auf PIPAAm bei 37 ° C beschichteten Oberflächen wenn PIPAAm hydrophob ist. Die Zellen können dann als Folie abgenommen werden , wenn die Kulturtemperatur auf unter 32 ° C verschoben wird, wo die beschichtete Oberfläche PIPAAm hydratisierten 17,18 wird. Wir nutzten diese thermische Eigenschaft durch das Filtrationsverfahren bei Raumtemperatur durchführt (unter 32 ° C) und dann ermöglicht Zellfreisetzung durch den Filter in Kulturmedien platziert bei 37 ° C gehalten. Bei dieser Temperatur wird die PIPAAm Polymerschicht hydrophob ist , wodurch die Freigabe der elektrostatisch gebundenen Zellen 15 (Abbildung 1).
Obwohl die Temperatur ansprechende Methode sowie andere Methoden haben tragfähige CTC - Capture zu erreichen erfolgreich umgesetzt und Release 19-21, ein Schlüssel durch diese Technologien gemeinsam genutzt möglicher Nachteil berichtet, dass sie alle eine Antigen-abhängige Prinzip für CTC - Capture verwenden. Antigen basierte CTC-Capture, wie gezeigt previously, führen zu verzerrten CTC - Analyse 11,14. Zum Beispiel verwenden viele Affinität-basierten Technologien Antikörper, der EpCAM für CTC-Capture bindet. Allerdings CTC wurde verschiedenen Ebenen von EpCAM, was zu einer Auslassung von EpCAM niedrig und EpCAM negativen CTC durch diese Technologien zum Ausdruck gezeigt. Auch können Einschränkungen auftreten, wenn CTC aus nicht-epithelialen Ursprungs von Interesse ist, wie CTC in Melanom und Sarkom-Einstellungen. Somit ist eine Technologie, die ohne Potentialvorspannung für tragfähige CTC Erfassung und Freigabe ermöglicht durch Antigen-basierende Datenerfassung eingeführt ist höchst wünschenswert.
Wichtig ist, dass der Mikrofilter-Aufnahmegerät rein bemessen basiert und die Trennstrategie unabhängig auf das Vorhandensein von bestimmten Oberflächenmarker. Wir glauben, dass der Einsatz der Mikro PIPAAm beschichtet wird dazu beitragen, unser Verständnis des metastatischen Prozesses zu erweitern, durch die Möglichkeit bietet, effektiv und effizient zu erfassen und zu lösen CTC für Downstream-Analysen. Dies kann potentaussetzen mathematisch neue Moleküle, für die neuartige gezielte systemische Therapien als auch gerichtet werden könnten als Biomarker zur Verfügung stellen, die einfach und Hilfe bei der Krebspatientenmanagement überwacht werden kann.
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Protokoll
Ethikerklärung: Um die Rechte der menschlichen Probanden zu schützen, wurden Blutproben unter den von der University of Miami Institutional Review Boards unter IRB 20150020 genehmigten Protokollen nach einer informierten Zustimmung erhalten.
HINWEIS: Blut für CTC-Capture gefiltert werden soll verhindern Koagulation in einem EDTA-Röhrchen gesammelt werden.
1. Beschichtung der Mikrofilter mit Poly (N-iso-Propylacrylamid) (PIPAAm)
- Wiegen PIPAAm aus 10% w / v Lösung in Butanol herzustellen. Mischen mit einem Vortex, bis die Lösung klar ist.
- Cut Kunststoff-Objektträger in etwa 12 mm x 12 mm Quadrate entweder mit einer Schere oder scharfe Klinge. Als Alternative kann eine Guillotine.
HINWEIS: Diese Quadrate als Halterung für den Filter während des Spin-Coating-Verfahren dienen wird. - Mit einem scharfen Paar gerader Kante Schere, schneiden Sie den Schlitz Porenmikro Wafer in 8 mm x 8 mm Quadrate.
- Unter Verwendung eines Polyimid-Folie Klebeband, um die Cut-Filter auf die Kunststoff squa sichernres geschnitten zuvor in Schritt 1.3. Übernehmen der Film nur an den Rand und der Ecke des Filters, so dass mindestens 7 mm x 7 mm Filterfläche durch das Band unbedeckt ist.
Abbildung 2:. Repräsentative Darstellung des Mikrofilter - Set-up für PIPAAm Beschichtung 8 mm x 8 mm Mikro auf die 12 mm positioniert x 12 mm Kunststoff quadratisch geschnitten aus einem Kunststoff - Objektträger. Polyimide Band wird verwendet , um die Mikro an Ort und Stelle zu sichern Mantel zu spinnen die PIPAAm.Reproduced mit Genehmigung aus Lit. 15. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
- Setzen Sie den Mikrofilter, die auf dem Kunststoff-Platz, auf dem Vakuumspannfutter der Schleuder befestigt ist.
- Programmieren Sie die Spin-Coater auf das folgende Rezept: Start, 500 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden, 6000 rpm für 60 Sekunden bei 500 Umdrehungen pro Minute für 10 Sekunden, Stopp.
- Dispense genug 10% w / v PIPAAm Lösung (hergestellt in 1.1) vollständig die Mikro Oberfläche mit einem Standard-Kunststoff Transferpipette abdecken und die Spin Coater starten.
- Entfernen Sie die PIPAAm beschichteten Mikrofilter vom Spin-Coater, nachdem der Beschichtungsprozess abgeschlossen ist. Lassen Sie die mit dem Kunststoff Platz angebracht Filter während der Lagerung.
HINWEIS: Die beschichtete-Filter kann für bis zu 3 Monate bei Raumtemperatur gelagert werden.
2. Montage der Filtrationskassette mit PIPAAm Beschichtete Mikrofilter
- Rehydrate PIPAAm beschichtete Mikro bei Raumtemperatur durch die Mikro Platzierung noch auf dem Kunststoff-Quadrat in eine Petrischale gesichert. In 1x PBS, bis die Mikro vollständig untergetaucht ist und lassen Sie sich für 5 Minuten stehen.
- Nach dem Hydratisierungsschritts, lassen Sie den Filter aus dem Kunststoff Quadrat durch die Polyimid-Filmband mit einem Paar Scherenschnitt.
HINWEIS: Achten Sie auf welcher Seite des Filtersdie PIPAAm Beschichtung. - Montieren Sie den Mikrofilter in die Filterkassette, gebildet, indem die Mikro zwischen dem oberen und unteren Acryl Stück zusammen mit den 2 Polydimethylsiloxane (PDMS) Stücke als Dichtung / Dichtung wirkt. Klemmen Sie die Acryl-Kassette mit Clips den Filter und bieten eine gute Abdichtung zu sichern.
HINWEIS: Die PIPAAm Beschichtung nach oben zeigen sollte, um die Probe durch filtriert, werden die Zellen auf PIPAAm beschichtete Oberfläche des Filters (1) erfasst werden.
3. Filtration von Blut-Probe mit Capture und Freisetzung von CTC aus dem Mikrofilter
- Da jede Spritzenpumpe Marke eine eigene Benutzeroberfläche hat, beziehen sich auf die Bedienungsanleitung der Pumpe und programmieren Sie die Spritzenpumpe mit einer Rate von 75 ml / h zu fließen und das Volumen auf 20 ml eingestellt.
- Warm 3 ml McCoys (im Handel erhältlich) Zellkulturmedium (hergestellt durch Zugabe von in 10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin und Streptomycin) bis 37 ° C.
Hinweis:. Wird die Medienwahl auf den Krebstyp des Patienten beruhen oder aber, ob dies ein Modellsystem Experiment ist, wo kultivierten Zellen sind gespickt in gesunde Spenderblut werden, die Medien nutzen die Zellen in der Regel kultiviert Wenn Sie unsicher sind, lesen Sie bitte zur Kultivierung Führung / Verfahren von der Firma die Zellen aus gekauft wurden. - 7.5 ml von im Handel erhältlichem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) zu der 7,5 ml der Blutprobe anzusaugen und dieses verdünnte Blut in eine 25 ml Spritze.
HINWEIS: Stellen Sie die Lautstärke von HBSS , so dass die Blutprobe mit dem gleichen Volumen von 1: 1 verdünnt wird mit HBSS Wenn zB 10 ml Blut verwendet wird, dann mit dem gleichen Volumen von 10 ml HBSS mischen 1 zu erzielen. 1 Verdünnung. - Aktivieren Sie die Filterkassette mit der Spritze und setzen Sie sie in die Spritzenpumpe. Legen Sie eine 50-ml-Röhrchen im Grunde die Strömung durch und starten Sie die Pumpe zu sammeln.
HINWEIS: Die Filtration sollte etwa 10- 12 min dauern. Alle Filtrationsschritte ausgeführt werdenout bei normaler Raumtemperatur (20-25 ° C), einschließlich Schritt 3.8 - Nach der Filtration abgeschlossen ist, lösen die Filtrationskassette Kenntnis nehmend, welche Seite die Spitze, die die Zellen auf der PIPAAm beschichtete Oberfläche gefangen hat. Aspirat 1 ml der warmen Kulturmedien in eine neue Spritze.
- Re-Eingriff mit der Filtrationskassette mit der Spritze, die die Medien enthält, aber zu diesem Zeitpunkt das untere Ende der Kassette eingreifen, so dass die PIPAAm beschichtete Oberfläche des Filters abgewandten von der Spritze.
Hinweis: Dies wird alle Zellen freizusetzen, die sanfte Rückfluss durch die Anwendung in die Schlitz Poren eingebettet werden kann. - Legen Sie die Spritze wieder auf die Spritzenpumpe und halten eine kleine Petrischale oder 6-Well-Platte direkt unter der Filtrationskassette. Stellen Sie die Durchflussrate auf 100 ml / h und die Pumpe starten.
- Führen Sie alle Medien durch den Filter und sammeln die Durchströmung in der Petrischale. Warten Sie alle Medien durchlaufen und dann die Pumpe zu stoppen und die Spritze ein entfernennd Filtrationskassette von der Pumpe.
- Lösen Sie die Filterkassette aus der Spritze und öffnen Sie den Filter aus der Kassette abzurufen. Setzen Sie den Filter mit der PIPAAm Oberfläche in der gleichen Petrischale nach unten verwendet, um den Rückfluss zu sammeln, wenn die Zellen aus den Poren freigesetzt wird. Fügen Sie den Rest der warmen Medien und legen Sie die Petrischale in eine Kulturbrutschrank bei 37 ° C eingestellt.
- Nach 30 min werden die Zellen alle vom Filter gelöst werden. Allerdings lassen Filter in der Petrischale für bis zu 24 Stunden alle Zellen, um sicherzustellen, lösen.
HINWEIS: Alternativ können die freigesetzten Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt werden weiter stromabwärts Analyse durchzuführen, wie beispielsweise PCR, ELISA, Western Blot, ein paar Beispiele zu nennen. - Nach 24 Stunden in Kultur, entfernen Sie vorsichtig die Mikro Pinzette.
HINWEIS: Der Filter kann zu dieser Zeit verworfen werden, da die Zellen daraus freigesetzt wurden. - Pipette vorsichtig das Kulturmedium nach oben und unten ein 1000 & # verwenden181; l-Pipette, um erneut zu suspendieren, die Erythrozyten und Pbmc (PBMC), die mit dem CTC auf dem Filter und freigegeben in die Platte eingeklemmt werden. Führen Sie diese Aktion sorgfältig und vorsichtig lose befestigt Krebszellen Ablösen zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die resuspendierten Erythrozyten und PBMC während Verlassen hinter den beigefügten Krebszellen und Ersatz mit frischem Medium vorgewärmt auf 37 ° C, um das gesamte Medium enthält.
HINWEIS: Dieser Schritt kann einmal wiederholt werden, wenn übermäßige Erythrozyten nach einer Wäsche vorhanden sind.
4. CTC Viability Bewertung
- Bewerten kultiviert CTC Lebensfähigkeit 8 eine Live / Dead - Assay verwendet wird .
HINWEIS: Zahlreiche Live / Dead-Assays sind im Handel erhältlich. Nach dem Protokoll des Herstellers wird dringend empfohlen. Bitte beachten Sie die Materialien / Reagenzien Liste für die im Handel erhältlichen Test-Kit für dieses Experiment verwendet.
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Ergebnisse
Mit gesunden Spendern Blut (erhalten unter einem Protokoll, das von der University of Miami IRB 20.150.020 im Anschluss an eine informierte Zustimmung genehmigt) gespickt mit kultivierten Krebszellen, die thermoresponsive Technik zur Freisetzung von lebenden zirkulierenden Tumorzellen (CTC) erzielte Erfassung, Freigabe und Wieder Effizienz von 94% ± 9%, 82% ± 5% und 77% ± 5% (Tabelle 1) 15. Im Vergleich dazu waren die Freisetzung und Wiedergewinnungseffizienz ...
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Diskussion
Der Prozess der Erfassung tragfähige CTC aus Vollblut und aus dem Mikrofilter Freigabe ist relativ einfach; aber ein paar kritische Punkte sind erwähnenswert. Es ist zwingend notwendig, wie bei allen Zellkultur, die eine sterile Zustand durch den gesamten Prozess aufrecht erhalten wird. Der erste Schritt des Beschichtens des Filters mit PIPAAm kritisch ist, als Grundlage für die Technik der Zellen aus der Filter Freisetzung beruht PIPAAm des auf Temperatur ansprechenden Grenzflächeneigenschaften zu nutzen. Um zu gewährl...
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Offenlegungen
Ein Teil dieser Arbeit wurde durch die vorläufige US-Patentanmeldung Nr. 62/219,808 geschützt. Siddarth Rawal ist ein Aktionär von Circulogix Inc., das die in diesem Artikel verwendeten Filter und Filterkassetten/-patronen kommerziell herstellt.
Danksagungen
Wir danken allen Patienten, die Blutproben gespendet haben, um diese Arbeit zu unterstützen. Wir danken Dr. Guiseppe Giaconne, Dr. Ritesh Parajuli und Dr. Marc E. Lippman für ihre Unterstützung bei der klinischen Probenbeschaffung sowie Dr. Carmen Gomez, Dr. Ralf Landgraf, Dr. Stephan Züchner, Toumy Guettouche und Dr. Diana Lopez für ihre aufschlussreichen Gespräche. Zheng Ao bedankt sich für die teilweise Unterstützung und Hilfe durch das Sheila and David Fuente Graduate Program in Cancer Biology, Sylvester Comprehensive Cancer Center.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Schlitzfilter | Circulogix Inc. | MSF-01 | Filter in verschiedenen Größen erhältlich, basierend auf der Filtration von CTC aus Blut oder Urin (www.circulogixinc.com) |
| Poly(N-iso-propylacrylamid) (PIPAAm) | Ploysciences Inc. | 21458 | Nicht gefährlich. Bei Raumtemperatur lagern. |
| 1-Butanol | Sigma Aldrich | B7906 | Verwendung in gut belüfteten Bereichen |
| Kunststoff-Objektträger | Cole-Parmer | 48510-30 | Alle Kunststoffobjektträger oder alternativ jede Art von Quadrat (Metall, Acryl usw.) können verwendet werden, wenn es sich um einen Ballen handelt, um das 8mmx8mm Filterquadrat zu halten |
| Spin Coater | Spezialbeschichtungssysteme | SCS G3 Spin Coater | Instrument |
| Polyimid Band | Uline | S-7595 | Polyimid ist der generische Name für Kapton Tape, das von mehreren Anbietern (Amazon, Kaptontape.com) erworben werden |
| kann.HBSS- Hank's Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Falcon Petrischalen 35 x 10 mm | VWR | 25373-041 | |
| Mikrofilterkassette | Circulogix Inc. | FC-01 | Custom Catridges sind auf der Grundlage einer Filtration für CTC aus Blut oder Urin erhältlich. |
| Spritze 20 ml | BD Scientific | 302830 | |
| Spritzenpumpe | KD scientific | 78-0100V | Jede Spritzenpumpe, die eine 25-ml-Spritze aufnehmen kann, kann verwendet werden |
| Cellstar 50 ml Zentrifugenröhrchen | VWR | 82050-322 | |
| Greiner Bio One 6-Well-Platte | VWR | 89131-688 | Marke kann verwendet werden, solange die Oberfläche für die Zelladesion verträglich und nicht abstoßend ist |
| SKBR3-Zellen | ATCC | HTB-30 | |
| Live Dead Assay | Life Technologies | L3224 | Jeder Assay, der eine vernünftige Analyse zur Bewertung lebender Zellen liefern kann, funktioniert |
| Zellkultur-Inkubator | VWR | 98000-368 | Jeder Inkubator, der für die Zellkultur verwendet werden kann, ist ausreichend |
Referenzen
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