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Methodenartikel

Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse

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DOI:

10.3791/54440

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19. September 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, University of Zaragoza

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier die Methodik, die zum Vergleich der schützenden Wirksamkeit und der Immunantwort der Lunge, die durch intranasale und subkutane Immunisierung mit BCG im Mausmodell induziert wird. Unsere Ergebnisse zeigen die Vorteile der Lungenimpfung und deuten auf eine Rolle der IL17-vermittelten Reaktion beim impfinduzierten Schutz hin.

Zusammenfassung

Trotz der weltweiten Abdeckung der intradermalen BCG-Impfung bleibt Tuberkulose eine der am weitesten verbreiteten Infektionskrankheiten der Welt. Präklinische Daten haben Lungentuberkulose-Impfstoffe als vielversprechende Strategie zur Vorbeugung von Lungenerkrankungen empfohlen, die für die Übertragung verantwortlich sind. In dieser Arbeit beschreiben wir die Methodik, mit der im Mausmodell die Vorteile der intranasalen BCG-Impfung im Vergleich zur subkutanen Impfung demonstriert werden. Unsere Daten zeigten eine größere schützende Wirksamkeit nach intranasaler BCG-Verabreichung. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Lungenimpfung eine höhere Immunantwort in der Lunge auslöst, einschließlich Th1- und Th17-Antworten, sowie einen Anstieg der Immunglobulin-A-Konzentration (IgA) in den Atemwegen. Unsere Daten zeigen eine Korrelation zwischen der schützenden Wirksamkeit und dem Vorhandensein von IL17-produzierenden Zellen in der Lunge nach der Provokation durch Mycobacterium tuberculosis, was auf eine Rolle dieses Zytokins bei der schützenden Reaktion durch die Lungenimpfung hindeutet. Schließlich beschreiben wir den globalen Arbeitsablauf, den wir entwickelt haben, um die Atemwegsimpfung im Mausmodell zu untersuchen, der auf andere Tuberkulose-Impfstoffe extrapoliert werden könnte, abgesehen von BCG, und zwar auf die Schleimhautreaktion oder andere pulmonale Verabreichungswege wie Intratracheal- oder Aerosolverabreichungswege.

Einleitung

Tuberkulose (TB) ist einer der führenden Infektionskrankheiten verursacht mehr Todesfälle assoziiert als HIV in der Welt und in Kombination mit steigenden Zunahme von multiresistenten Stämmen macht TB eine alarmierende globales Gesundheitsproblem dar 1. Neue Diagnose-Tools, effektiver und weniger toxische Medikamente und neue sichere und wirksame TB-Impfstoffe sind ein dringender Bedarf, vor allem in den Entwicklungsländern.

Lebendes attenuiertes Bazillus Calmette-Guerin (BCG) ist derzeit der einzige zugelassene Impfstoff gegen Tuberkulose, die seit den 1970er Jahren weltweit intradermal bei der Geburt verabreicht wurde. BCG als wirksam bei der Verhinderung von schweren Formen der Erkrankung (Meningitis und miliary TB) bei Kindern, hat aber inkonsistent Wirksamkeit gegen Lungentuberkulose verantwortlich für die Übertragung von Krankheiten 2 gezeigt.

Pulmonale Impfung, die natürliche Weg der TB-Infektion nachahmt, stellt ein attraktiver Ansatz für die lokale Immunantwort des Wirts Grundierens. Folgende Lungen Immunisierung In dieser Hinsicht wurden verschiedene präklinische Arbeiten in verschiedenen relevanten Tiermodellen TB größer Impfstoff Wirksamkeit gezeigt , wie 3-6 zur subkutanen oder intradermalen Weg verglichen. Dennoch werden die Schutzmechanismen ausgelöst durch Lungen Impfung nicht gut verstanden. In den letzten Jahren haben mehrere Werke IL17-vermittelte Reaktion als ein wichtiger Faktor der TB-spezifische Schleimhautimmunantwort, wie sie in Mausmodellen defizienten für IL17 Schleimhaut - Impfstoff-induzierte Schutzwirkung zeigte auf 7,8 wird beeinträchtigt.

Vor kurzem haben wir gezeigt , zum ersten Mal , die BCG - Administration intranasale DBA / 2 - Mäuse geschützt, eine Belastung der Maus durch den Mangel an Schutz nach subkutaner BCG Impfung 9 gekennzeichnet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Atemwege TB-Impfung könnte effektiver sein Rate von TB in Endemiegebieten bei der Verringerung, wo intradermale BCG ist unwirksam gegen Pulmon betrachtetary TB.

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Protokoll

Alle Mäuse wurden unter kontrollierten Bedingungen gehalten und auf Anzeichen von Krankheit beobachtet. Experimentelle Arbeiten wurde in Übereinstimmung mit den europäischen und nationalen Richtlinien für den Schutz von Versuchstieren und mit der Zustimmung der zuständigen lokalen Ethikausschüsse durchgeführt.

1. Herstellung von Quantifizierte Glycerol Stocks von BCG dänischen und Mycobacterium tuberculosis H37Rv

HINWEIS: Alle beschriebenen Protokolle wurden unter BSL3 Bedingungen durchgeführt.

  1. Auftau gefrorenen Glycerinstammkulturen von BCG Danish oder H37Rv Stämme und 100 & mgr; l in 10 ml 7H9 - Medium 10 mit Tween-80 0,05% (v / v) und ADC (Albumin, Dextrose, Catalase) 10% (v / v) ergänzt inokulieren.
  2. Inkubiere unter statischen Bedingungen für eine Woche bei 37 ° C, bis die Kultur in log-Phasenwachstum ist.
  3. Scale-up Bakterienkultur durch die Übertragung der 10-ml-Kultur zu 200 ml frischem Medium. Inkubieren für 20 weitereTagen unter statischen Bedingungen.
  4. Transfer in 50-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 15 Minuten bei 2500 x g.
  5. Entsorgen Sie Stände und Bakterienpellet im Restvolumen resuspendieren. In jedes Röhrchen sterile 3 mm Durchmesser Glasperlen (10 bis 15 pro Röhrchen).
  6. Vortex kräftig während 1 min, um Bakterienklumpen zu distanzieren. Resuspendieren jedes Pellet in 10 ml PBS mit Tween-80 0,05% (v / v).
  7. Lassen Sie Rohre für 10 Minuten erlaubt die größten Bakterien Aggregate und Glasperlen zu beruhigen.
  8. Recover 9,5 ml Überstand aus jeder der vier Röhrchen, die kleine Klumpen und einzelne Bakterien und Transfervolumina zu einem einzigen frischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen (endgültige gewonnen Volumen 38 ml). Zentrifuge für 10 min bei 400 x g.
  9. Recover 35 ml Überstand (die hauptsächlich einzelne Bakterien) in einem einzigen frischen 50-ml-Zentrifugenröhrchen und 15 ml PBS mit Glycerin 50% (v / v), eine endgültige Glycerinkonzentration von 15% zu erhalten (v / v).
  10. vorsichtig mischenund zum Einfrieren in 1-ml-Teilmengen in entsprechenden Röhrchen verteilen. Bei -80 ° C (ein Los liefert etwa 50 Aliquots Glycerolstammlösung).
  11. Um Glycerin-Stamm quantifizieren, tauen Sie den Tag mit einem Glycerin nach dem Einfrieren und führen sieben zehnfache serielle Verdünnungen in separaten 1,5-ml-Röhrchen, die 900 & mgr; l PBS.
  12. Platte 100 & mgr; l jeder Verdünnung in 7H10 Fest Agarmedium , ergänzt mit 10 ADC 10% (v / v) hergestellt , in 55-mm - Durchmesser - Petrischalen.
  13. Vorsichtig 3 mm Durchmesser Glasperlen (ca.. 10 pro Platte) und sanft Platte schütteln, um gleichermaßen Volumen über Agar-Platte verteilen. Entsorgen Sie Perlen und versiegeln Agar-Platte mit Parafilm.
  14. bei 37 ° C für 21 Tage inkubieren und koloniebildende Einheiten (CFU) in den Verdünnungen in denen Einzelkolonien genau unterschieden werden können durch Zählen von Bakterienkonzentration zu bestimmen.

2. Maus Impfung

  1. Tauen Sie eine vorher quantifiziert BCG Glycerin und verdünnen Sie es in PBS zu prepzwei Suspensionen. Endvolumen Berechnen Sie die Dosis pro Tier unter Berücksichtigung von 100 & mgr; l für die subkutane Verabreichung (10 7 KBE pro ml für die subkutane Impfung) und 40 & mgr; l für die intranasale Verabreichung (2,5 x 10 7 CFU für die intranasale Impfung).
  2. Verwenden Sie eine spezielle Anästhesiearbeitsplatz für Nager mit einer Mischung von Isofluran und Sauerstoff Mäuse zu betäuben. Verwenden Isofluran 5% Anästhesie zu induzieren und 2% der Mäuse in der Anästhesiekammer aufrechtzuerhalten. (Andere akzeptierte Anästhesie Methode kann verwendet werden).
  3. Zur subkutanen Verabreichung des Impfstoffes füllen eine 1-ml - Spritze mit einer 26 G - Nadel mit 1 ml Bakteriensuspension (10 7 KBE / ml). Luftblasen entfernen.
  4. Legen Sie eine narkotisierten Maus auf einer ebenen Fläche in Bauchlage in einer Laminar - Flow - Haube und impfen subkutan 100 & mgr; l (10 6 CFU / Dosis) des Impfstoffes in einer Flanke der Maus zurück. Bringen Sie die Maus an den Käfig und zu überwachen, um sicherzustellen, dass es Properly erholt sich von der Narkose.
  5. Ändern Sie die Spritzennadel zwischen jeder Maus Verwaltung. Luftblasen entfernt, wie oben beschrieben.
  6. Für die intranasale Verabreichung, im Inneren der Kapuze eine narkotisierten Maus in Rückenlage legen.
  7. Mit einer Mikropipette nehmen 20 ul der Suspension mit 2,5 x 10 7 CFU / ml. Legen Sie das Inokulum Drop-by-Drop zwischen den beiden Nüstern, bis das gesamte Volumen abgeschieden wurde, so dass Zeit zwischen Tropfen der Maus atmen die Lautstärke in zu ermöglichen. Hinweis: Mäuse, die von Atemnot während dieses Verfahrens leiden können, so sollten sie bleiben assimilieren jeden Tropfen, bevor der nächste administrieren es so weit wie möglich zu verhindern.
  8. Nachfüllung der Mikropipette mit einem weiteren 20 ul und den Vorgang wiederholen. Wenn die Maus aus der Narkose nach der ersten Impfung aufzuwachen beginnt, legen Sie sie in der Anästhesie Kammer vor dem zweiten. Bringen Sie die Maus an den Käfig und sicherzustellen, dass es richtig erholtaus der Narkose.

3. Maus intranasale Herausforderung mit Stamm H37Rv

  1. Tauen Sie eine vorher quantifiziert H37Rv Glycerin und verdünnen Sie es in PBS eine bakterielle Suspension von 2500 KBE pro ml herzustellen. Endvolumen Berechnen Sie die Dosis pro Tier unter Berücksichtigung beträgt 40 ul.
  2. H37Rv intranasal geimpft wie in 2.5 beschrieben - 2.7. Endgültige Herausforderung Dosis pro Maus ist 10 2 CFU / 40 & mgr; l.

4. Analyse der induzierten Immunantwort in Lungs

  1. Lung Zellsuspension
    HINWEIS: Beurteilung der Impfstoff-induzierte adaptive Immunantwort in der Lunge erfordert die Erzeugung von Einzelzellsuspension. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Gewebe Dissociator wie gentleMACS.
    1. Opfere die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen.
    2. Innerhalb einer Laminar-Flow-Haube, extrahieren Sie die lungs mit einer sterilen Schere und Pinzette und legen Sie sie auf eine saubere Oberfläche. Saubere Lungen Trachea und Bindegewebe zu entfernen, und übertragen Sie die Lungen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit PBS (halten auf Eis bis zur Verarbeitung).
    3. Zu erzeugen , eine Zellsuspension, legen Lungen in einem geeigneten Schlauch für organ Dissoziation (C-Dissociator Rohr) , das 5 ml 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 und 1,8 mM CaCl 2 Puffer.
    4. Füge 100 & mgr; l Kollagenase D 100 mg / ml (2 mg / ml Endkonzentration) und 40 & mgr; l DNAse I 20.000 IU / ml (160 IU / ml Endkonzentration.
      HINWEIS: Stammlösungen von Kollagenase D oder DNaseI werden hergestellt , lyophilisiert Auflösen Enzyme in PBS oder Glycerol 50% (v / v), 20 mM Tris-HCl , pH 7,5 , y MgCl 2 1 mM, respectively.
    5. Das Röhrchen wird in das Gewebe Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm m_lung_01 für Lungen Fragmentierung. Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C in einem Wasserbad für 30 min.
    6. Platz the Rohr im Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm m_lung_02 für die komplette Lunge Homogenisierung in einzelne Zellsuspension.
    7. Übergeben Sie die Zellsuspension durch ein 70 & mgr; m Sieb Nylon Zelle mit einem Schlauch 50-ml-Zentrifugen ausgestattet. Waschen Sie das Sieb mit 10 ml RPMI 1640-Medium.
    8. Centrifuge Zellen für 5 Minuten bei 400 · g und Überstand verwerfen.
    9. 1 ml der Erythrozyten Lysepuffer, mischen durch Vortexen und Inkubation für 1 min bei Raumtemperatur.
    10. 10 ml RPMI 1640-Medium und zentrifugieren Zellen für 5 Minuten bei 400 x g.
    11. Die Zellen in 0,5 ml komplettem Medium RPMI 1640 mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS) supplementiert, 2 mM L-Glutamin, 100 ug / ml Streptomycin, 100 IU / ml Penicillin und 50 & mgr; M 2-Mercaptoethanol.
      HINWEIS: FCS durch Inkubation für 30 Minuten bei 56 ° C inaktiviert wird.
    12. Zählen von Zellen und fügen vollständigen RPMI 1640 - Medium bis zur endgültigen Zelldichte von 10 7 Zellen / ml erreichen.
      HINWEIS: Für die Zellzahl, verwenden wir die automatische Zellzähler.
    13. Verteilen von 100 & mgr; l Zellsuspension in U-Boden - 96-Well - sterile Platte (10 6 Zellen / Vertiefung).
    14. Werden 50 & mgr; l / Vertiefung vollständigem RPMI 1640-Medium mit 15 ug / ml kommerzieller H37Rv Purified Protein Derivative (PPD) (5 ug / ml Endkonzentration).
  2. Supernatant Sammlung für Zytokin Bestimmung durch ELISA
    1. Inkubieren Platte von 4.1.14 für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. Zentrifugenplatte für 5 Minuten bei 400 · g und erholen 100 ul Überstand.
    3. Bei -80 ° C.
    4. Verdünnen Stände 1/10 und 1/2 in Testpuffer für IFNy und IL17A Bestimmung sind. Bestimmen Sie Zytokin-Konzentrationen mit im Handel erhältlichen ELISA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers (ELISA Development Kits).
  3. Intrazelluläre Färbung zur Bestimmung der Zytokin-produzierenden CD4 + Zellen mittels Durchflusszytometrie
    1. Inkubieren Platte von 4.1.14 für 18 h bei 37 ° C und 5% CO 2.
    2. In 1,5 ul Brefeldin A 1 mg / ml (Lager in DMSO gelöst) in jede Vertiefung (10 ug / ml Endkonzentration) und Inkubation für weitere sechs Stunden.
    3. Zentrifugieren Sie die Platte aus 4.3.2 für 1 min bei 3200 xg und Überstand verwerfen.
    4. Resuspendiere Zellen in 50 ul anti-Maus-CD4-FITC, verdünnt in RPMI 1640 mit 10% FCS (1/500) und bei 4 ° C für 10 min inkubieren.
    5. Zentrifugieren Sie die Platte aus 4.3.4 für 1 min bei 3200 × g Überstand verwerfen und mit 100 ul / Vertiefung Fixierungslösung. für 20 min bei 4 ° C inkubieren.
    6. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 & mgr; l / Wäsche von Permeabilisierung Lösung.
      HINWEIS: 10x konzentriert Lager wird in entionisiertem Wasser verdünnt, 1x Arbeitslösung herzustellen.
    7. Resuspendiere Zellen in 50 ul anti-Maus IFN & ggr;-APC und Anti-Maus-IL17A APC.Cy7 in permeabil verdünntisierung Lösung (1/250 beide Antikörper).
    8. Inkubieren für 1 h bei RT.
    9. Waschen Sie die Zellen zweimal mit 150 & mgr; l / Wäsche von Permeabilisierung Lösung.
    10. Die Zellen in 200 ul PBS für die Durchflusszytometrie Akquisition.

5. Analyse von Immunglobulinen in Bronchiallavage (BAL)

  1. Gewinnung von BAL - Proben
    1. Opfere die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen.
    2. Setzen Sie die Luftröhre unter Verwendung geeigneter Präzision einer sterilen Pinzette und Schere, und führen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre, so dass sicher nicht vollständig auszuschneiden. Achten Sie darauf, nicht zu Blutungen führen, die BAL Probe verunreinigen könnten.
    3. Einführung in die Trachea eine Kanüle mit einer sterilen 1-ml-Spritze mit 800 ul eiskaltem PBS.
    4. Impfen langsam die PBS in die Lungen und dann rEcover BAL Volumen der Spritze des Kolbens sehr langsam, um Zurückziehen Lungenkollaps zu vermeiden.
      HINWEIS: Wiederherstellung von 500 bis 600 & mgr; l zufriedenstellend ist.
    5. Übertragen BAL Volumen in ein 1,5-ml-Röhrchen und bestätigen BAL ungefärbt bleibt, was darauf hinweist, dass nicht mit Blut (halten auf Eis, bis die Verarbeitung) verunreinigt ist.
    6. Zentrifuge BAL-Proben für 5 min bei 400 xg und Überstand in ein neues Röhrchen.
    7. Store Überstand bei -80 ° C.
  2. Bestimmung von IgA in BAL Stände
    HINWEIS: Alle verwendeten Reagenzien bei RT sind.
    1. Coat High-Protein - Bindung Polystyrol - Flachboden - 96-Well - Platten mit 100 ul PPD verdünnt in PBS (10 ug / ml) für M. tuberculosis spezifisches IgA Bestimmung oder mit 100 ul Überstand BAL 10 - mal in PBS verdünnt , für Gesamt - IgA Bestimmung.
    2. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C.
    3. Überstand verwerfen und tippen Sie auf die Platte auf einem Papiertuch zu dry. Waschen mit 200 ul / Vertiefung PBS.
    4. Blockieren mit 200 ul / Vertiefung einer Rinderserumalbumin (BSA) 1% (w / v) in PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Blockierungspuffer).
    5. Inkubiere 1 h bei RT.
    6. Wasche einmal mit 200 ul / Vertiefung PBS-Tween-80 0,05% (v / v) (Waschpuffer).
    7. 100 l unverdünntem BAL-Überstand in den PPD-beschichteten Vertiefungen. Inkubiere zwei Stunden bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Wenn die gesamte IgA Bestimmung in parallel mit der PPD-spezifischen IgA, Gesamt-IgA lassen Vertiefungen mit 100 ul Waschpuffer während dieser Inkubation erfolgt.
    8. Waschen dreimal mit 200 ul / Vertiefung Wasch buffer.0170004
    9. Je 100 ul Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem IgA-anti-Maus verdünnt in Blockierungspuffer (1 / 10.000).
    10. Inkubiere 1 h RT.
    11. Waschen fünfmal mit 200 ul / Vertiefung Waschpuffer.
    12. 100 l / Vertiefung von 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB). Inkubiere 20 Minuten bei Raumtemperatur in ter dunkel.
    13. 100 l / Vertiefung von H 2 SO 4 0,5 N. Lesen Sie die Platte in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 450 nm.

6. Bakterienbelastung Bestimmung in der Lunge

  1. Lung Homogenisierung und Galvanisieren
    1. Vier Wochen nach der Herausforderung, opfern, um die Maus durch Genickbruch (oder andere anerkannte humane Methode) und gewährleisten Maus tot ist, den Augapfel zu berühren abwesend von Lidschlussreflexes zu bestätigen.
    2. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage fixiert auf einer flachen und desinfizierten Oberfläche innerhalb einer Laminarströmungsabzug.
    3. Einen Einschnitt und entfernen Sie die Haut von Brustbereich, um den Thoraxbereich sichtbar lassen.
    4. Schneiden Sie die Rippen und ernten die Lungen und das Herz mit einer sterilen Schere und Pinzette. Legen Organe auf eine saubere Oberfläche.
    5. Reinigen Sie die Lunge durch Entfernen des Herzens, der Trachea und Bindegewebe und übertragen Sie die Lungen in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml VE-Wasser(Auf Eis halten, bis die Verarbeitung).
    6. Verwenden einer sterilen Pinzette in die Lungen jeder Maus in eine richtige Rohr für Orgel Homogenisierung zu übertragen (M - Dissociator Rohr), 1 ml VE-Wasser enthält.
    7. Das Röhrchen wird in das Gewebe Dissociator und nutzen Sie das vordefinierte Programm RNA_1, um die Lunge zu homogenisieren.
    8. Stellen fünf zehnfache serielle Verdünnungen in 1,5-ml-Röhrchen mit 100 ul Lungenhomogenat in 900 & mgr; l verdünnt beginnen.
    9. Platten Verdünnungen wie in 1,11-1,14 beschrieben.
  2. Eine Differenzierung zwischen BCG und H37Rv durch PCR
    HINWEIS: In den Platten von 6.1.6 auf die Gruppe mit BCG durch den intranasalen Weg geimpft entsprechenden analysierten wir eine repräsentative Anzahl von Kolonien durch eine anspruchsvolle PCR zwischen BCG und H37Rv, um sicherzustellen, dass der CFU als Impfstoff-verliehenen Schutzwirkung zu beurteilen entsprach eindeutig H37Rv. Dieses PCR-Amplifikation von Zielen RD9, eine genomische Region unterschiedlich in BCG und M. tuberkulose, so dass ein Fragment von 2618 bp für H37Rv und 465 bp für BCG 11.
    1. Bereiten Sie einen Master-Mix Lager für alle Proben mit einem Volumen pro Probe, wie angegeben, und verteilen dann in PCR-Röhrchen (9 ul / Probe).
      HINWEIS: Puffer 5x: 2 & mgr; l. Forward - Primer 25 uM (GTGTAGGTCAGCCCCATCC): 0,32 & mgr; l, Reverse - Primer 25 uM (GCCCAACAGCTCGACATC): 0,32 & mgr; l, Taq - Polymerase 5 Einheiten / ul: 0,04 ul, Entionisiertes H 2 O: 6,32 ul.
    2. Tippen Sie auf eine Kolonie mit einem sterilen Zahnstocher und tauchen Sie den Zahnstocher mit der Probe in einem PCR-Röhrchen mit dem Master-Mix.
    3. Führen Sie die PCR mit dem folgenden Programm: 10 min 95 ° C (dieser Schritt ist die bakterielle Unterbrechung auszulösen), 10 min 95 ° C (dieser Schritt ist die bakterielle Unterbrechung auszulösen), 35 Zyklen (30 Sekunden bei 95 ° C, 1 min bei 58 ° C und 4 min bei 72 ° C).
    4. Laden Sie die PCR-Proben in einem 1% igen Gel mit Ethidiumbromid und Laufproben, um die Fragmente zu visualisieren.

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Ergebnisse

Diese Arbeit beschreibt den Vergleich von zwei Arten der Verabreichung von BCG: subkutane und intranasale. Subkutanem Weg ist vergleichbar mit dem intradermal, die der aktuellen klinischen Weg für BCG weltweit ist. Die intranasale Weg der Impfung zielt darauf ab , den natürlichen Weg der Infektion von M. zu imitieren tuberculosis mit dem Ziel - Immunantwort zu induzieren , direkt in die Lunge, das Hauptzielorgan dieses Erregers.

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Diskussion

Obwohl der derzeitige Impfstoff gegen Tuberkulose, BCG, der am häufigsten verabreichte Impfstoff in der Geschichte ist, ist Tuberkulose nach wie vor eine der häufigsten Todes- und Morbiditätsursachen durch Infektionskrankheiten weltweit. Dieses Paradoxon erklärt sich durch den mangelnden Schutz dieses Impfstoffs gegen Lungentuberkulose, die verantwortliche Form der Übertragung. Neue Impfansätze, die gegen pulmonale Formen der Krankheit wirksam sind, sind dringend erforderlich, da sie weltweit den größten Einfluss auf die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von "Spanisches Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit" [Fördernummer BIO2014-5258P], "Europäische Kommission" durch die H2020-Programme [Fördernummern TBVAC2020 643381].

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Middlebrook 7H9 BouillonBD271310
Middlebrook ADC AnreicherungBD211887
Tween 80ScharlauTW00800250
Glasperlen Durchmesser 3 mmScharlau038-138003
Middlebrook 7H10 AgarBD262710
1-ml-Spritze 26GA 0,45 x 10 mmBD301358
GentleMACS-DissoziatorMiltenyi Biotec130-093-235
C RöhrchenMiltenyi Biotec130-093-237
M RöhrchenMiltenyi Biotec130-093-236
Collagenase DRoche11088882001
DNaseIApplichemA3778,0100
Falcon 70 µ m Cell StrainerCorning352350
RPMI 1640SigmaR0883
Lysing Buffer für rote BlutkörperchenSigmaR7757
GlutaMAX SupplementGibco35050-061100x konzentrierte
Penicillin-Streptomycin-LösungSigmaP4333100x konzentriertes
fötales KälberserumBiologisch Branchen04-001-1A
2-MercaptoethanolSigmaM3148-25ML
Zepter 2.0 Handheld Automatisierter ZellzählerMilliporePHCC20040
Zepter Zellzählersensoren, 40 & Mikro; mMilliporePHCC40050
Mycobacterium Tuberculosis - Tuberculin PPDStatens Serum Institut (SSI)2390
Maus IFN-& gamma ELISA-Entwicklungskit Mabtech3321-1H
Maus IL17A ELISA-Entwicklungskit Mabtech3521-1H
Brefeldin ASigmaB7651
FITC Ratte Anti-Maus CD4BD553047
BD Cytofix/Cytoperm KitBD555028
APC-Cy7 Ratte Anti-Maus IL-17ABD560821
APC Maus Anti-Maus IFNgBD554413
LACHRYMAL OLIVE LUER LOCK 0,60 x 30 mm. 23G x 1 1/4"UNIMED27.134Zur Verwendung als Luftröhrenkanüle für
BAL-hochproteinbindende Polystyrolplatten mit flachem Boden und 96 Vertiefungen MAXISORPNUNC430341
Albumin, aus RinderserumSigmaA4503
Ziege Anti-Maus IgA (α-kettenspezifisch)− Peroxidase AntikörperSigmaA4789
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) SigmaT0440
MyTaq DNA-PolymeraseBiolineBIO-21107Das Kit enthält Puffer 5x

Referenzen

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Die protektive Wirksamkeit und pulmonale Immunantwort nach subkutaner und intranasale BCG Verabreichung an Mäuse
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