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Transplantation in die Maus Ovarian Fat Pad

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DOI:

10.3791/54444

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7. September 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine ovarian Transplantation Assay fad Pad geeignet für die Untersuchung der normalen und transformierten Epithelien des weiblichen Fortpflanzungstraktes. Die Maus Fettpolster ermöglicht die Transplantation von großen Gewebefragmente, ist leicht zugänglich für die Chirurgie und Bildgebung und sieht die günstigste nativen Umgebung für Gewebe von Müllersche Herkunft.

Zusammenfassung

Orthotope Transplantationsassays bei Mäusen sind von unschätzbarem Wert für Studien zur Zellregeneration und neoplastischen Transformation. Gängige Ansätze für die orthotope Transplantation von Eierstockoberflächen- und Eileiterepithelien umfassen die intraperitoneale und intrabursale Verabreichung von Zellen. Zu den jeweiligen Einschränkungen dieser Verfahren gehören eine schlecht definierte Position der injizierten Zellen und ein begrenztes Raumvolumen. Darüber hinaus eignen sie sich schlecht für den langfristigen strukturellen Erhalt transplantierter Organe. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir einen alternativen Ansatz entwickelt, der auf der Einführung von Zellen und Gewebefragmenten in das Fettpolster der Maus basiert. Das Eierstockfettpolster der Maus befindet sich in unmittelbarer Nähe des Eierstocks und der Gebärmutterröhre (auch bekannt als Eileiter, Eileiter) und bietet eine vertraute Mikroumgebung für Zellen und Gewebe dieser Organe. Bei unserem Ansatz werden fluoreszenzmarkierte Maus- und humane Zellen sowie Fragmente des Uteruskanüls mit minimalen traumatischen dorsalen Schnittoperationen transplantiert. Transplantierte Zellen und ihre Auswüchse sind über 40 Tage lang leicht im Fettpolster der Eierstöcke zu finden. Die Langzeittransplantation des gesamten Uteruskanleiters ermöglicht die korrekte Konservierung aller Hauptbestandteile des Gewebes und führt nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen wie Fibrose und Entzündungen. Unser Ansatz sollte einzigartig anwendbar sein, um wichtige biologische Fragen wie Differenzierung, regeneratives und neoplastisches Potenzial spezifischer Zellpopulationen zu beantworten. Darüber hinaus sollte es für Studien von Mikroumweltfaktoren bei normaler Entwicklung und Krebs geeignet sein.

Einleitung

Transplantation Assays, die die Einführung von Zellen und Geweben in bestimmten Körperstellen bei Mäusen beinhalten, stellen einen wesentlichen Ansatz für die Untersuchung der Geweberegeneration und Karzinogenese. Orthotopische Transplantationen von Zellen, das heißt, ihre Platzierung in einem nativen Milieu, sind besonders wichtig für die Charakterisierung von adulten Stammzellen. Die Existenz von Bruststammzellen wurde zuerst durch die Transplantation von epithelialen Brustdrüse Fragmente in Drüse freien Brustfettpolster von Mäusen 1 vorgeschlagen. Engraftment Assays humanisierten Maus Fettpolster 2 wurden verwendet , um das regenerative Potenzial und eine normale Entwicklung von humanen primären Brustepithelzellen zu rekapitulieren. Außerdem serielle und Grenzverdünnung Transplantationen von phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen in das Brustfettpolster gelöscht waren entscheidend für die Selbsterneuerungsfähigkeit und multilineage Differenzierung von Bruststammzellen 3-5 zu testen. Transplantation Assays in combinatIon mit genetischen Abstammungslinie Tracing in Brust Karzinogenese 5 Nachweis der Ursprungszelle zur Verfügung gestellt. Nierenkapsel Transplantationen sind für die Prüfung Eigenschaften von mutmaßlichen Prostata - Stammzellen 6 verwendet. Orthotopische Transplantation von normalen und neoplastischen Maus und menschlichen Pankreas - Organoiden ergab Gene und 7 in der Tumorprogression verändert Wege. Die Bedeutung der nativen Umgebung wurde auch durch die Demonstration verschiedener Regeneration unterstützt nach engraftments der Schweißdrüsen in verschiedenen Orten, wie zum Beispiel Brustfettpolster, Schulterfettpolster und Rückenhaut 8.

Die Bauchhöhle und der ovarian Schleimbeutel sind in der Regel als Orte für orthotope Transplantation von Epithelzellen des weiblichen Fortpflanzungstraktes 9-12 verwendet. Beide Verfahren haben eine Anzahl von Einschränkungen. Intraperitoneale Injektion von Zellen führt zu ihrer Implantationen in verschiedenen Bereichen der Bauchhöhle, wodurch complicating Zellwachstum zu überwachen. Weiterhin können Variationen in der Mikroumgebung, wie das Ausmaß der Vaskularisierung, Innervation und Immunzell Darstellung kann in verschiedenen Bereichen der Bauchhöhle ganz erheblich sein. Die ovarian bursa hat eine sehr begrenzte Volumen, so dass die Injektion von nicht mehr als 10 & mgr; l Flüssigkeit. Dies begrenzt erheblich die Menge an Zellen, die verabreicht werden kann. Darüber hinaus können Injektionen in den ovarian bursa als recht technisch anspruchs und das Verfahren erfordert eine erhebliche Menge an Zeit.

Um diese Einschränkungen zu begegnen, haben wir den Vorteil der ovarian Fettpolster Eigenschaften genommen. Die Maus ovarian Fettpolster hat eine Größe ist, neben dem Ovar und der Eileiter, und ist leicht zugänglich durch eine Operation. Es wurde berichtet , dass equine Trophoblasten können in die Maus ovarian Fettpolsters 13 transplantiert werden. Jedoch sind die Einzelheiten dieses Verfahrens wurden nicht beschrieben. Es war auch nicht, wenn diese mir gemeldetthode kann zu adulten Zellen und Geweben verwendet werden. Hier beschreiben wir einen zuverlässigen Ansatz zur Transplantation von Maus und menschlichen Zellen des weiblichen Fortpflanzungstraktes und zeigen, dass diese Methode zur langfristigen Organtransplantation anwendbar ist.

Protokoll

Alle die in vivo-Arbeit beschrieben wird von der Cornell University Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Probenvorbereitung für Ovarian Fat Pad Assays

  1. Isolierung und Kultur von primären Tubal Epithels (TE) Zellen
    1. Euthanize Donator 6- bis 8-Wochen alten virgin β-Actin-Enhanced Green Fluorescent Protein (EFGP) oder β-Actin-Discosoma Red Fluorescent Protein (DsRed) Mäuse durch CO 2 Verabreichung durch zervikale Dislokation gefolgt. Überprüfen der erfolgreichen Euthanasie durch eine Zehe Prise.
    2. Legen Sie eine einzelne Maus auf einem saugfähigen Tuch, Bauchseite nach oben, und dann wischen Sie den Bauch mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Haut durch einen seitlichen Schnitt am Körper Mittellinie zu machen und mit den Fingerspitzen ziehen die Haut über und unter dem Schnitt in Richtung der Kopf und Schwanz der Maus.
    3. Halten Sie das Peritoneum stumpfen Pinzette und einen Schnitt mit einer feinen Schere, um die Körperhöhle zu öffnen. Schieben Sie die Spule des intestine zur Seite und die Fortpflanzungsorgane finden.
    4. Mit einer feinen Pinzette abholen ein Uterushorn und geschnitten 0,5 cm über dem Punkt, wo die Gebärmutterhörner trennen. Während das Uterushorn hält, sezieren entfernt an der Gebärmutterhorn befestigt Bindegewebe, Eileiter, Eierstock- und ovarian Fettpolster. Platzieren seziert Reproduktionstrakts in einer Schale mit 6 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Fahren Sie mit dem zweiten Reproduktionstrakt.
    5. Die Schale in einem Biosafety Schrank und waschen Sie die Gewebe 3 mal in 6 ml sterilem PBS. Fortsetzung der Arbeit unter einem Präpariermikroskop im Schrank Biosafety befindet. Besorgen Sie sich die Uterushorn mit einer feinen Pinzette und ziehen Sie das Uterushorn von der Eileiter durch an der utero-tubal Kreuzung Trennen. Schneiden Sie die ovarian Schleimbeutel die Ovar umgeben von einer 25 G Nadel.
      Hinweis: Nach der ovarian Schleimbeutel entfernt worden ist, die Präparation abgeschlossen ist und die einzelnen Eileiter verbleibt in der PBS-Lösung.
    6. Übertragen einer single Eileiters in einem 50 ul Tropfen PBS auf eine 3,5-cm-Schale und Hackfleisch in 0,1 mm Stücke mit 28 Gauge Nadeln. Transfer auf 200 & mgr; l Verdauungspuffer 1 (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) , F12 (Ham) Medium , ergänzt mit 300 Einheiten ml -1 Kollagenase und 100 Einheiten ml -1 Hyaluronidase) und bei 37 ° C in einer 5% CO 1 h inkubieren 2 Inkubator.
    7. Nach der Inkubation mit 1 ml 0,25% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und die Lösung mit Hilfe einer 1 ml-Pipettenspitze (aka blaue Spitze) 20-mal für 3 Minuten auszusetzen. 5 ml + 4 ° C DMEM / F12 (Ham) -Medium, das 2% fötales Rinderserum.
    8. Sammeln Sie Gewebe durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, Raumtemperatur (RT)) und 1 ml Verdauungspuffer 2 (DMEM F12 (Ham) Medium , das mit 7 mg ml -1 Dispase II und 10 ug ml -1 Deoxyribonuclease I ( DNase I)). Suspend Gewebepellet 20-mal mit Hilfe einer 1 ml Pipette tiSeite
    9. 5 ml Serum frei komplette Maus tubal Epithel-Wachstumsmedium (M-TE-GM, Tabelle 1).
    10. Sammle die Zellen durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT). 1 ml M-TE-GM, zu suspendieren und zählen Zellen durch Hämocytometer. Seed 1 x 10 5 Zellen in 1 ml pro Vertiefung in einer 24-Well niedrige Befestigungsplatte und bebrüten in M-TE-GM bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 4 Tage.
    11. Wechseln Sie jeden Tag das Medium.
    12. Bereiten Einzelzellsuspensionen von kultivierten primären Suspension TE - Zellen aus β-Actin-EGFP oder β-Actin-DsRed Mäusen.
      1. Sammeln Sie TE Suspensionskulturen von 24-Well-niedrige Befestigungsplatten. Zentrifuge (600 rcf, 5 min, RT) und suspendieren Zellpellets mit 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA. In einer 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
      2. Trypsin-Aktivität zu stoppen durch Zugabe von 5 ml DMEM / F12 (Ham) Medium, das 5% fötales Rinderserum. Sammeln Zellpellets durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT).
    13. Wash Zellpellets zweimal mit 4 ml kaltem PBS (4 ° C), 1 ml PBS pro Zellpellet, auszusetzen. Zählen von Zellen durch Hämocytometer und Transfer zu 1,7 ml Zentrifugenröhrchen. Arbeiten auf Eis, fügen Sie 1 x 10 5 Zellen bis 10 & mgr; l PBS, fügen Sie dann 10 ul Basalmembranmatrix. Suspend und Transport auf Eis Tierraum.
      Hinweis: Führen Sie alle Dissektion und Gewebekulturarbeit in einem Biosafety Schrank unter sterilen Bedingungen.
  2. Herstellung von immortalisierten humanen Zelllinie
    1. 90% Konfluenz auf 10 cm Geschirr bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator - Lentivirus-EGFP und -mCherry markierten menschlichen verewigte Ovarialoberfläche Epithelzelllinien lineHIO118 bis 80 separat wachsen.
    2. Geschirr spülen zweimal mit 10 ml PBS, 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA pro Schale und Inkubation für 10 min bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator. Die Reaktion durch Zugabe von 10 ml DMEM / F12 (Ham) Medium, das 5% fötales Rinderserum. SammelnZellpellets durch Zentrifugation (600 rcf, 5 min, RT).
    3. Waschzellpellets zweimal mit 10 ml kaltem PBS (4 ° C), 1 ml PBS pro Zellpellet und suspendieren. Zählen von Zellen durch Hämocytometer und Transfer zu 1,7 ml Zentrifugenröhrchen.
    4. Arbeiten auf Eis, fügen Sie 1,0 x 10 6 Lenti-mCherry markierten Zellen + 1,0 x 10 6 Lenti-EGFP - Zellen zu 10 & mgr; l PBS markiert. Fügen Sie 10 & mgr; l Basalmembran-Matrix. Suspend und Transport auf Eis Tierraum.
  3. Herstellung des Eileiters
    1. Sezieren einzelne uterine Rohre von 6 bis 8 Wochen alte virgin β-Actin-DsRed Mäuse in PBS wie in Schritten 1.1.1-1.1.5 beschrieben. Übertragen Sie einzelne Eileiter in einen 200 & mgr; l Tropfen PBS unter einem Präpariermikroskop. Sanft abrollen Eileiter mit Hilfe von Pinzetten und 28 Gauge-Nadeln durch die mesosalpinx Entfernen eines Teils des breiten Band, das die Segmente des Eileiters unterstützt. Legen Sie einzelne abgewickelte Eileiter in einem Tropfen 200 & mgr; l eiskaltem PBS, bis die ovarian Fettpolster des Empfängers wird freigelegt und vorbereitet, um die Transplantation zu erhalten.

2. Ovarian Fat Pad Transplantation

Hinweis: Desinfizieren Instrumente zwischen den einzelnen Tierchirurgie. Bereiten Sie und alle Geräte im Voraus vereinbaren. Dorsal Transplantationen nach rechts ovarian Fettpolster sind bevorzugt, da dies die Milz vermeidet. Jedoch können die Empfänger-Transplantationen in beiden ovarian Fettpolster haben.

  1. Verwenden Sie syngene Mäuse oder schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID / NCR) Mäuse als Empfänger von Primärzellen. Für menschliche Zellen, wie HIO118 Zellen, Verwendung NOD / SCID / gamma (NSG) Mäusen oder SCID-Mäusen.
  2. Empfänger-Maus mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von 2,2,2-Tribromethanol in einer Dosierung von 0,15 ml / 10 g Körpergewicht anästhesiert. Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, im Tier Haube und überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch den Verlust der Pedal Reflex (toe Prise). Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen Trockenheit zu verhindern, während dieTier unter Narkose. Spritzen Sie das Tier subkutan mit dem Analgetikum Ketoprofen in einer Dosis von 4 mg / g Körpergewicht für postoperative Schmerzen zu behandeln.
    Hinweis: Als Alternative Isofluran zur Anästhesie verwendet werden. Legen Sie das Tier in der Induktionskammer und stellen Sie den Sauerstoff-Durchflussmesser auf 0,8 bis 1,5 l / min und der Isofluran-Verdampfer auf 2-3%. Entfernen Sie die narkotisierten Tier aus der Kammer, lassen Sie es Isofluran von einer Maske atmen und stellen Sie den Sauerstoff-Durchflussmesser auf 0,4 bis 0,8 l / min und der Isofluran-Verdampfer auf 1,5%, dann die Operation beginnen.
  3. Shave den OP-Bereich mit # 40 Clippers; entfernen Haare aus einem Gebiet, 2-fache der OP-Bereich, bereiten Sie die rasierte Haut mit drei antiseptisch scheuert von PVP-Jod, um 70% Ethanol gefolgt, und die Abdeckung mit einem sterilen Tuch.
  4. Bewegen Sie das Tier unter einem Präpariermikroskop in einem Biosafety-Schrank. Setzen Sie die Fortpflanzungsorgane durch einen Einschnitt in der dorsomedial Position direkt über dem ovarian Fettpolster.
    Hinweis: Critische Schritt: Precise Hautinzision Wundheilung erleichtert, ist die Verwendung eines Skalpells in Schritt 2.4 empfohlen.
  5. Mit stumpfen feinen Pinzette ziehen Sie den ovarian Fettpolster vorsichtig durch den Schnitt in Richtung der Mittellinie, minimiert Schäden an Nerven und großen Blutgefäße.
    Critical Schritt: Wenn die Blutung auftritt, die Operation zu stoppen und prüfen, zu einem anderen Wirtstier Umpflanzen.
  6. Unter der Kontrolle des Mikroskops Dissektion mit Hilfe einer 28 Gauge Nadel eine abgeschrägte 2-4 mm tiefen Einschnitts in das Fettpolster ovarian machen, 3-4 mm oberhalb des Ovars.
    Kritischer Schritt: Stellen Sie sicher, dass der Schnitt nur durch die Hälfte des Fettpolsters geht; den ganzen Weg durch Punktierung auf der Unterseite führt zu Leckagen. Seien Sie schnell und gehen unverzüglich nach diesem Schritt.
  7. Für Zelltransplantationen, eine Spritze (30-Gauge-Nadel) mit 10-20 ul der Zell-Basalmembranmatrix-Mischung füllen und in die Fettpolster Einschnitt injizieren. Für Eileiters Transplantation, die Eileiter wit abholenh feinen Pinzette und in 10 - 20 & mgr; l Basalmembranmatrix auf Eis gehalten. Mit Hilfe eines 0,1-10 / 20 ul XL Verlaufsfilter Spitze (verkürzt von 3 mm), um das Gewebe und Basalmembranmatrix Suspension aufzunehmen und die Freisetzung in die Fettpolster Einschnitt.
  8. 5 Minuten warten für die Basalmembranmatrix zu verfestigen und legen Sie den Reproduktionstrakt zurück in das Peritoneum. Schließen Sie die Muskeln mit 2 Stichen von chirurgischem Naht und die Haut mit zwei kleinen Wundklammern oder chirurgische Naht.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 2,4-2,8 eine PBS-Basalmembranmatrix-Gemisch in den kontralateralen Fettpolster des Tieres zu verpflanzen, die als Kontrolle dienen.
    Critical Schritt: Nach der Operation stellen das Tier auf einem Heizkissen, weil der Wärmeverlust rasch in narkotisierten Mäusen ist.
  10. Lassen Tier auf einem Heizkissen in der nativen Käfig erholen und das Tier beobachten aus der Narkose bis zum vollständigen Aufwachen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten sterna wiedergewonnen hatl recumbence. Nicht ein Tier zurück, die Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
  11. Legen Sie eine Hand voll vorbefeuchtenden Futterpellets in den Käfig zusätzlich Nahrung auf dem Käfig nach der Operation, um zu trocknen. Bewerben postoperativen Analgetika, wenn für die nächsten paar Tage benötigt und die Wunde täglich untersuchen. Bewerben Antibiotika gemäß dem genehmigten Tier-Protokoll, wenn Wundinfektion auftritt. Entfernen Wundklammern 10 Tage nach der Operation, wenn die Wunde vollständig geschlossen ist.

3. Histologie und Image Acquisition

  1. Graft Sammlung und Erhaltung
    1. Herstellung von 4% Paraformaldehyd - Lösung durch Mischen von 26 ml ddH 2 O mit 4 ml 10x PBS und 10 ml 16% Paraformaldehyd - Lösung.
    2. Präparieren in einem Block, der transplantierten ovarian Fettpolster, Ovar, Eileiter, 0,5 cm Uterus wie in den Schritten 1.1.1-1.1.4. Unmittelbar danach ist in 2 ml 4% Paraformaldehyd und fixieren 2 h bei RT. Aus dem gleichen Tier, sezieren die nicht-transplantiertenkontralaterale ovarian System Fettpolster transplantiert mit PBS-Basalmembranmatrix Mischung als Kontrolle (siehe Schritt 2.9). Fix und Verfahren in der gleichen Weise.
    3. Nach der Fixierung Wasch Geweben dreimal mit PBS für 5 Minuten und über Nacht in PBS bei 4 ° C inkubiert.
    4. Für das Gesamtmontage Abbildung des ovarian Fettpolster gehen 3.2.1 Schritt.
      Anmerkung: Nachdem die Bildaufnahme Gewebe eingefroren werden kann (3.3.1) oder für Paraffineinbettung verarbeitet werden (3.3.2). Inkubation über Nacht in 30% Saccharose in PBS bei 4 ° C verbessert die Qualität von gefrorenem Gewebe.
  2. image Acquisition
    1. Legen Sie ganzes Montage ovarian Fettpolster Systeme in PBS gefüllten Schalen und Bild ein umgekehrtes Mikroskop ausgestattet mit Epi-Fluoreszenz-Befestigung und High-Definition-Farbkamera mit 4, 10x Zielen und einem Stereomikroskop mit einem Fluoreszenzaufsatz ausgestattet, Farbkamera und Plan Apo 1xWD70, ED-Plan 1.5xWD45 Ziele.
  3. Histologie
    1. folgendeganze-mount Bildaufnahme (3.2.1) legen Sie ein 200-500 ul Tropfen Medium für gefrorene Gewebeproben auf einem 2 x 1 cm großes Stück Laborfolie und mit einer Pinzette zum Einbetten, übertragen das Gewebe auf den Rückgang. Nehmen Sie den Film an einer Kante und übertragen die Gewebe-Medium Tropfen zu einem 1,8 ml Kryo-Fläschchen. Schließen Sie das Fläschchen und tauchen Sie ein in flüssigem Stickstoff. Lagern Sie gefrorene Gewebe bei -80 ° C.
    2. Alternativ fahren Sie mit dem Standard-Paraffineinbettung. Verwenden 20-40 Volumina Gewebevolumen für jeden Schritt.
      1. Tauchen Sie einmal Gewebe in 65% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln.
      2. Tauchen Sie einmal Gewebe in 70% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln. In diesem Stadium können die Proben für Monate bei RT gelagert werden.
      3. Tauchen Sie einmal Gewebe in 90% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln.
      4. Tauchen Sie einmal Gewebe in 95% Ethanol für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln.
      5. Tauchen Gewebe zweimal in absolutem Ethanol (200 Proof) für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln.
      6. Tauchen zweimal Gewebe in Chloroform für 30 Minuten, sanft bei RT schütteln.
      7. Tauchen Sie einmal Gewebe in Paraffin für 30 min unter leichtem Schütteln bei 58 ° C.
      8. Tauchen Sie einmal Gewebe in Paraffin für 12 Stunden unter leichtem Schütteln bei 58 ° C.
      9. Eintauchen, wenn Gewebe in Paraffin für 3 h bei 58 ° C.
      10. Legen Sie Gewebe in Metall Histologie Formen und füllen Formen mit 58 ° C Paraffin. Fügen Sie eine Kunststoff-Histologie Kassette auf dem Paraffin und abkühlen Paraffin bis +4 ° C. Extrahieren Paraffin-Gewebeblock und lagern bei RT.
        Hinweis: Paraffin Temperatur nicht 58 ° C für eine optimale Konservierung von Gewebe für immunohistochemische Färbung geeigneten überschreiten sollte.
    3. Alternativ Bereiten Sie für die Paraffinausgießstation mit der Probenverarbeitung Gel.
      1. Saugen Sie das PBS und übertragen ganze-mount Gewebe zu 70% Ethanol. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Std. In einem Wasserbad, Verarbeitung vorheizen Probe Gel bis 60 ° C.
      2. pipette 200 ul der Probenverarbeitung Gel auf einem Labor Film ausgekleideten Petrischale. Mit feinen Sezierung einer Pinzette übertragen die gesamte Montage Gewebesystem zur Probenverarbeitung Gel Tropfen.
      3. Lassen Sie die Probenverarbeitung Gelpfropfen bei Raumtemperatur zu verfestigen oder erstarren den Stecker für 10 min bei 4 ° C.
      4. Platzieren Sie die Probenverarbeitung Gel eingebetteten Gewebekassetten Histologie Gewebe zwischen Biopsie Schaumstoffkissen eingeklemmt. Einbetten in Paraffin wie in den Schritten 3.3.2-3.3.2.10.
        Hinweis: Probenverarbeitung Gel Einbettung verhindert den Verlust und ermöglicht die Erhaltung von kleinen zerbrechlichen Gewebeproben.
        Hinweis: Die Gewebe durch Gefrieren haltbar gemacht oder Paraffineinbettung zur immunhistochemischen Färbung von 14,15 geeignet sind.

Ergebnisse

Experimentelle Zellen und Gewebe genau in die ovarian Fettpolster unter einem Präpariermikroskop (Abbildung 1) transplantiert werden. Die Beispiele umfassen primäre Mauszellen Eileiter Epithel von Mäusen abgeleitet ubiquitär EGFP exprimieren (2A) oder DsRed (2B) und menschlichen Eierstock Oberfläche Epithelzellen verewigt HIO118 16,17 Zellen mit mCherry und EGFP Lentiviren (2C - F) bezeichnet. Der Ansatz ist auch für die langfristige Transplantation von Organen, wie der Maus Eileiters (Abbildung 3). Nach immunhistochemischer Färbung sowohl bewimpert (FOXJ1 positive 14) und sekretorische (PAX8 positive 15) Zellen werden in dem Eileiter Epithel von transplantierten Geweben (3D und E) erhalten.

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Abb . 1: Ovarian Fat Pad Transplantation (A) exponierten Bereich der Transplantation (Pfeil). (B) Ein Schnitt wird durch eine 28 G - Nadel (Pfeil). (C) UT / Basalmembranmatrix Mischung Verpflanzung von Pipettenspitze (Pfeil). (D) UT engrafted (Pfeil, leuchtend rot, UT von β-Actin-DsRed - Mäuse). FP, Fettpolster; Ov, Ovar; UT, Eileiters. Maßstabsbalken = 2 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2:. Der Nachweis von transplantierten Maus Primäre Tubal Epithelzellen und Menschen Immortalized Ovarian Deckepithel Zellen (A, B) Out Wucherungen von primären Maus Eileiter - Epithelzellen (Pfeile) von β-Actin-EGFP - Mäuse (A, grün) und β-Actin-DsRed (B, rot) 8 Tage nach der Transplantation in einem syngenen Maus. (C, D) Engraftments gemischter HIO118 Zellen (Pfeile) , markiert mit entweder Lenti-EGFP (grün) oder Lenti-mCherry (rot) 10 Tage nach der Transplantation in Mäusen NSG. (D) Vergrößerungsbereich von (C, Pfeil). (E, F) Graft entwickelten 43 Tage nach der Transplantation der gleichen Zellen wie in C, D an SCID - Maus (Pfeile). AD, F, Fluoreszenz; E, Hellfeld, FP, Fettpolster; Ov, Ovar; UT, Eileiters. (A, B, DF) Maßstabsbalken = 500 & mgr; m; (C) Maßstabsbalken = 1600 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Charakterisierung von Eileiters Transplantation. (A) Komplette Eileiters (Pfeil) von β-Actin-DsRed Maus 6 Tage nach der Transplantation in das ovarian Fettpolster (Pfeil, leuchtend rot). (B) Fluoreszenz gefrorenen Abschnitt des Fettpolsters mit Transplantation in (A) gezeigt. Rot, DsRed; Blau, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Kern Gegenfärbelösung. (C) Eileiters Transplantats (Pfeil) 40 Tage nach der Transplantation in NSG Empfängermaus (Pfeil). Paraffinschnitt. Hinweis korrekte Erhaltung aller Prinzip uterine Rohrkomponenten, und der Mangel an Transplantations-assoziierten Fibrose und Entzündung. Hämatoxylin und Eosin-Färbung. (D, E) Nachweis von tubal Epithel Marker Gepaart-Box - Gen 8 (PAX8) und Forkhead Feld J1 (FOXJ1, braun Kern Farbe, Pfeilspitzen) in den Zellen der Graft (Pfeile) , die in ( C). Immunoperoxidase-System. Die Gegen mit Methylgrün. FP, Fettpolster; Ov, Ovar; UT, Eileiters. (A) Maßstabsbalken = 1000 & mgr; m; (B) Maßstabsbalken = 200 & mgr; m; (CE) Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Komponente 1x DMEM F12 (Ham) Medium
L-Glutamin 2 mM
Sodium pruvate 1 mM
Epidermalen Wachstumsfaktor 10 ng ml -1
Basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2 10 ng ml -1
Hydrocortison 500 ng ml -1
Insulin 5 ug ml -1
Transferrin 5 ug ml -1
Natriumselenit 5 ng ml -1
Rinderalbumin 0,10%
Penicillin / Streptomycin 100 Einheiten ml -1 / 100 & mgr; g ml -1
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) nicht-essentielle Aminosäuren 0,1 mM
Beta-mercaptoethanol 10 -4 M

Tabelle 1:. Maus Tubal Epithelim Wachstumsmedium (M-TE-GM) Komponenten in der linken Spalte aufgeführt sind in 1x DMEM F12 (Ham) Medium in den angegebenen Konzentrationen, rechte Spalte gelöst. Die endgültige Zusammensetzung des Mediums ist frei Serum.

Diskussion

Wir haben ein ovarian Fettpolster Transplantation Assay etabliert, die für die genaue Lieferung und den Nachweis von epithelialen Zellen und Geweben ermöglicht. Die ovarian Assay Transplantation Fettpolster ist technisch weniger anspruchsvoll als intrabursalen Injektion 10-12 und ermöglicht eine gleichmäßige und präzise Ortung von transplantierten Zellen im Vergleich zu intraperitoneale Injektion 9. Es ist auch gut geeignet für die Langzeit Transplantation eines gesamten Organs, wie beispielsweise die Eileiter.

Wichtig ist, stellt die ovarian Fettpolster eine vertraute Mikroumgebung für Epithelien des weiblichen Fortpflanzungssystems. Es sollte für die Untersuchung der molekularen und zellulären Eigenschaften von Mensch und Maus Eierstock- und Eileiter Epithelzellen während der Regeneration und der malignen Transformation besonders geeignet sein. Im Unterschied zu anderen Organen haben sich auf der Identifizierung und Charakterisierung von Stammzellen in den Epithelien des weiblichen r wenige Studien fokussierteproductive - Darm - Trakt 18,19. Solche Studien sind von besonderer Bedeutung , weil viele Krebsarten aus adulten Stammzellen 20 zu stammen , werden angenommen. Doch zellulären Ursprung der epithelialen Ovarialkarzinomen bleiben höchst umstritten 18. Epithelial Konto Ovarialkarzinome für die Mehrheit der Ovarialkarzinome und ist auf dem 5. Platz unter allen Krebs Todesfälle im Zusammenhang mit der Frauen in den USA 21. Somit Entwicklung eines orthotopischen Assays mit mehreren Vorteilen gegenüber den bestehenden Transplantationstechniken 9-12 sollte stark Studien in diesem Bereich zu erleichtern.

In Anbetracht der oberflächlichen Lage des ovarian Fettpolster können die Kleintierbildgebung Systemen verwendet werden auf Follow-up engraftments mit starken fluoreszierenden oder Biolumineszenz Reporter markiert. Es sollte auch möglich sein , minimal - invasive hochauflösende Live - Bildgebung Assays, wie nichtlineare Mikroskopie 22 zu etablieren. Die ovarian Fettpolster kann auch in Organkulturen gehalten werden, dadurch zu ermöglichen,ing dreidimensionale Kultur von normalen und neoplastischen Epithelien unter Bedingungen eng an die Organisation von Zellen und die extrazelluläre Matrix zu rekapitulieren. Zukünftige Studien sollten diese vielversprechenden Möglichkeiten befassen.

Mehrere kritische Schritte berücksichtigt werden. Die Bereitstellung einer Heizkissen und Nagetiere warm während der Operation zu halten verbessert die Überlebensrate. Sterility von Instrumenten, die Fettpolster sorgt für Handhabung, dass die transplantierten Systeme steril gehalten werden. Nach unserer Erfahrung signifikante Blutung führt zu Wachstumsstörungen von Transplantaten. Wichtig ist, dass die Fettpolster Schnitt gerade weil Abreißen des Fettpolsters gemacht werden oder es durch Ursachen Punktierung Blutungen. Flockungsmittel sollte die Blutung zu stoppen, wie notwendig verwendet werden. Wenn engraftments entwickeln sich nicht, eine höhere Konzentration von injizierten Zellen sollten in Betracht gezogen werden. Die ersten erfolgreichen Auswüchsen kann bereits eine Woche nach der Transplantation beobachtet werden und die meisten engraftments sollte sichtbar seinMonat nach dem Eingriff. Für die Transplantation, Nadeln mit größerem Durchmesser (23-25 ​​G) können Scherung von großen Zellen verwendet werden (über 10 & mgr; m im Durchmesser) zu verhindern. Jedoch können solche Nadeln sein, traumatischer auf das Fettpolster und ihre Verwendung sollte im Voraus überprüft werden. Für unseren Experimenten haben wir 6 bis 8 Wochen alten Spender und Empfänger-Mäuse verwendet. Für beide Zwecke jüngere oder ältere Mäuse können verwendet werden. Jedoch müssen die Anzahl der injizierten Zellen angepasst werden. Die kleinere Größe der ovarian Fettpolster bei jüngeren Spendern werden ebenfalls berücksichtigt werden müssen.

Wie bei jedem Verfahren gibt es einige Einschränkungen der Maus ovarian Fettpolsters Transplantationstest. Obwohl syngenen immunkompetenten Mäusen für Maus primären Zellen / Gewebe verwendet werden, unsere Technik erfordert NSG oder SCID-Mäuse für die Transplantation von menschlichem Material. Es ist wahrscheinlich möglich, das Fettpolster zu humanisieren das Wachstum von menschlichen Epithelzellen zu unterstützen. Allerdings haben wir diesen Ansatz noch nicht getestet. Die Verwendung von jüngeren feMänner können zu einer geringeren Zuchtkosten zu führen; jedoch reife Jungfrau weibliche Mäuse (Alter 8 bis 10 Wochen) einen größeren Fettpolster, wodurch Transplantation größerer Proben ermöglicht. Schließlich sollte das Laborpersonal in der Tierchirurgie geschult werden, rechtzeitige und erfolgreiche Durchführung des Verfahrens zu gewährleisten.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir möchten Dr. Andrew K. Godwin, University of Kansas Medical Center zu danken, für die menschlichen Zellen HIO118 bereitstellt. (; T028095 NYSTEM) und National Institutes of Health / National Institute of Child Health und Human Development (P50HD076210) zu AFN, und durch die Zuwendungen aus NYSTEM (C028125, C024174 und Diese Studien wurden durch die Zuwendungen aus der New York Stem Cell-Programm unterstützt T028095), National Institutes of Health / National Cancer Institute (CA182413) und Ovarian Cancer Research Fund (327516) zu AYN.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
25-Gauge-NadelBD Becton Dickinson305122
28-Gauge-Nadel (Injektionsspritze mit aufgesetzter Nadel)Kendall30339Teilenummer: 8881500014
basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor-2Sigma-AldrichF9786
Basalmembran-Matrix (Geltrex)InvitrogenA1413202
β-Aktin-DsRed-MäuseDas Jackson Laboratory6051B6. Cg-Tg(CAG-DsRed*MST)1Nagy/J
β-Aktin-EGFP-MäuseThe Jackson Laboratory3291C57BL/6-Tg(CAG-eGFP)1Osb/J
β-MercaptoethanolSigma-AldrichM7522
RinderalbuminSigma-AldrichA3311
ChloroformVWREM-CX1058-1
Kollagenase/Hyaluronidase-Stammzelle Technologies7912
KryofläschchenThermo Scientific Nunc377267
Dispase IIWorthingtonNPRO2
DMEM F12 (HAM's)Corning10-092-CV
DNaseI (Desoxyribonuklease I)Stem Cell Technologies7900
Einbettmedium für gefrorene Gewebeproben (O. C. T.)Sakura Finetek 4583
epidermaler WachstumsfaktorSigma-AldrichE4127
Ethanol 200 proofKoptecV1001zur Herstellung von 70% 
fötales RinderserumSigmaF4135
Filterspitze 0,1-10/20 µ l XL USA Scientific1120-3810
FOXJ1 AntikörpereBioscienceE10109-1632verwendet in einer Konzentration von 1:1.000 (keine Demaskierung)
HydrocortisonSigmaH0135
KetoprofenZoetis4396H
Laborfilm (Parafilm M)American National CanPM-999
L-GlutaminCorning25-005-Cl
Insulin-Transferin-NatriumselenitSigma-AldrichI884
Isofluran, 250 mlSanta Cruz Animal Healthsc-363629Rx
niedrige Anhaftungsplatte 24-wellCostar3473
MEM nicht-essentielle AminosäurenCorning25-025-Cl
Histologie-Formen aus MetallElektronenmikroskopie Wissenschaften62527-22
Mikroskop, invertiertesNikonEclipse TS 100
Mikroskop, StereoNikonSMZ800
Nod/SCID/Gamma (NSG) MäuseThe Jackson Laboratory05557NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ
Paraformaldehyd 16%ige LösungElektronenmikroskopie Sciences15710
Paraffin (Paraplast, X-TRA)Fisher Thermo Scientific23-021-401
PAX8 AntikörperProteintech10336-1-APbei einer Konzentration von 1:1.000 (keine Demaskierung)
PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)Corning  21-030-CV
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-Cl
schwere kombinierte Immundefizienz-Mäuse (SCID/NCr), BALB/C-Hintergrund)NCI-Frederick Animal Production Program01S11
NatriumpyruvatCorning25-000-Cl
Probenverarbeitungsgel (HISTOGEL)Richard-Allan ScientificHG-4000-012
SaccharoseSigma-AldrichS0389
Trypsin-EDTA, 25%Corning25-053-Cl

Referenzen

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