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Methodenartikel

Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

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DOI:

10.3791/54465

⸱

5. Oktober 2016

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie zytoplasmatische Mikroinjektionen in Nutztierzygoten durchgeführt werden. Diese Technik kann verwendet werden, um jede Lösung in den einzelligen Embryo zu bringen, wie z. B. Genom-Editing-Tools zur Erzeugung von Knockout-Tieren.

Zusammenfassung

Zytoplasmatische Mikroinjektion in einzellige Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Zum Beispiel ermöglicht es die Bereitstellung von Genom-Editing-Tools, die genetische Modifikationen erzeugen können, die in jeder Zelle eines erwachsenen Organismus vorhanden sind. Es kann auch verwendet werden, um siRNAs, mRNAs oder blockierende Antikörper zu verabreichen, um die Genfunktion in Präimplantationsembryonen zu untersuchen. Die herkömmliche Technik zur Mikroinjektion von Embryonen, die bei Nagetieren verwendet wird, besteht aus einer sehr dünnen Mikropipette, die direkt in die Plasmamembran eindringt, wenn sie in den Embryo vordringt. Wenn diese Technik auf Nutztiere angewendet wird, führt sie in der Regel zu einer geringen Effizienz. Dies liegt vor allem daran, dass Rinder-, Schaf- und Schweinezygoten im Gegensatz zu Mäusen und Ratten ein sehr dunkles Zytoplasma und eine hochelastische Plasmamembran aufweisen, die eine Visualisierung während der Injektion und Penetration der Plasmamembran erschwert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine geeignete Mikroinjektionsmethode zur Abgabe von Lösungen in das Zytoplasma von Rinderzygoten, die sich auch bei Schaf- und Schweineembryonen als erfolgreich erwiesen hat. Zuerst wird mit einem Laser ein Loch in die Zona pellucida gebohrt. Dann wird eine Mikropipette mit stumpfem Ende durch das Loch eingeführt und vorgeschoben, bis die Spitze der Nadel etwa 3/4 in den Embryo hineinreicht. Dann wird die Plasmamembran durch Aspiration des zytoplasmatischen Inhalts in der Nadel durchbrochen. Schließlich wird der aspirierte zytoplasmatische Inhalt, gefolgt von der interessierenden Lösung, wieder in das embryonale Zytoplasma injiziert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die Verabreichung verschiedener Lösungen in Rinder- und Schafzygoten mit 100%iger Effizienz, minimaler Lyse und normaler Blastozystenentwicklungsrate eingesetzt.

Einleitung

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel 1 macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet.

Zytoplasmatischen Mikroinjektions hat Vorteile gegenüber pronukleären Mikroinjektions da es einfacher ist , durchzuführen und verursacht auch weniger Schaden an den injizierten Embryos, in höheren Lebensfähigkeit resultierende 2. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine erfolgreiche Methode für die Bereitstellung von Lösungen in das Zytoplasma von landwirtschaftlichen Nutztieren Zygoten zu demonstrieren. Zu können auszuführenzytoplasmatischen Mikroinjektions mit hoher Effizienz auf Nutztieren Embryonen wird ein Laser zur Erzeugung eines Lochs in der Zona pellucida (ZP) und dann eine blunt-end Glasnadel für die Mikroinjektion verwendet. Diese Strategie zielt darauf ab, die mechanische Schäden am Embryo während der Injektion eingeprägt zu reduzieren. Dann Aspiration von zytoplasmatischen Inhalten in der Injektionsnadel erlaubt, effizient und sicher ein Bruch des PM zu gewährleisten, dass die Lösung in das Cytoplasma des Embryos geliefert wird.

Diese Technik wurde in Rinderembryonen zu liefern siRNA in die zygotic Zytoplasma 3,4 und erzeugen Mutationen mit Hilfe der Cluster regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen (CRISPR) / CRISPR zugehörige System 9 (Cas9) System 5 bereits erfolgreich eingesetzt. Es ist auch geeignet (mit geringfügigen Modifikationen) bovine Cumulus-umschlossenen Oozyten 6 einzuspritzen. Hier haben wir unsere Injektionsprotokoll liefert einen Farbstoff beschreiben kann, dass anwendbar sein, jede des zu injizierendenired Lösung in die Zygote, und zeigen, dass diese Technik unter Verwendung minimaler Lyse verursacht und beeinflusst nicht die frühe Embryoentwicklung.

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Protokoll

1. Mikropipette Produktion

  1. Injection Mikro
    1. Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln.
    2. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500).
    3. Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position.
    4. Bringen Sie die gezogen Pipette und die Mikroschmiede Heizwendel mit seiner Glasperle in den Fokus. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die gewünschte Dicke und bewegen Sie die Pipette horizontal, bis die Heizwendel das Ziel erreicht Innendurchmesser (5 & mgr; m) zu messen.
    5. Stellen Sie die Hitze auf etwa 45% und vorsichtig auf die Pipette bringen, so dass es den Faden berührt. Aktivieren Sie kurz die Heizung. Dies wkrank schmelzen leicht die Pipette, so dass es auf den Faden und beim Abkühlen haftet, wird die Pipette an der Kontaktstelle brechen einen geraden Schnitt zu erzeugen.
      Hinweis: Die entsprechende Temperatureinstellung in diesem Schritt Schlüssel ist , da die Temperaturen zu hoch wird die Pipette Biegung machen und damit ein gerader Schnitt wird nicht möglich sein und die Temperaturen zu niedrig wird nicht ausreichen , um die Pipette (1A) zu schmelzen.
    6. Machen Sie einen ungefähren Winkel von 30 ° in der Nähe der Pipettenspitze durch etwa 10 & mgr; m entfernt von der Heizwendel zu positionieren. Stellen Sie die Temperatur auf 60%, und aktivieren Sie die Heizung.
      Hinweis: Dies wird die Pipette über das Filament biegen. Dieser Winkel ist erwünscht , so dass die Spitze der Nadel an der Oberfläche der Einspritzplatte ist parallel , wenn in den Injektor (1B) montiert ist .
    7. Griff Mikroinjektionspipette mit Vorsicht , da sie extrem scharf und zerbrechlich sind.
  2. Halten Mikro
    1. Legen Sie eine borosilicaß Glaskapillare (OD: 1,0 mm, ID: 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und sperren.
    2. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es mit einem langen, selbst in einer dünnen Spitze führt verjüngen und parallele Wände (Beispiel: Wärme: 815; Ziehen: 20; Geschwindigkeit: 140; Zeit: 175; Druck: 200).
    3. die gezogener Pipette aus dem Abzieher Gerät und legen Sie es auf der Mikroschmiede Halter in horizontaler Lage vorsichtig entfernen. Stellen Sie den Fokus auf die Heizwendel und Pipette.
    4. Verwenden Sie die Okularstrichplatte die Pipette Durchmesser und bewegen Sie die Pipette bis zu seinem Durchmesser über dem Glühfaden erreicht 180 & mgr; m zu messen.
    5. Bei der angegebenen Größe, markieren Sie die Glaskapillare mit einer Diamantspitze Stift und drücken Sie dann vorsichtig an der Spitze zog das Glas zu brechen. Dies sollte in einem geraden Schnitt (1C) zur Folge haben .
    6. Bewegen der Pipette in eine vertikale Position mit ihrer Spitze nahe des Filaments. Stellen Sie die Temperatur der Mikroschmiede bis 60%.
    7. Feuerpolitur der Spitze der Pipette mit Standardtechniken 7 , bis sie eine ID von 40 & mgr; m erreicht. Verwenden Sie das Okularstrichplatte die ID (1D) zu überprüfen.
    8. Stellen Sie sich einen Winkel auf der Pipette.
      1. Bringen der Pipette zurück in eine horizontale Position etwa 10 & mgr; m entfernt von dem Filament und 5 mm von seiner Spitze. Stellen Sie die Temperatur auf etwa 60% und aktivieren Sie die Heizung, um die Pipette über den Faden zu biegen. Weiterhin Erhitzen , bis ein gewünschter Winkel (von etwa 30 o) erreicht wird. Überprüfen Sie den Winkel visuell (Abbildung 1E).
        Hinweis: Die Pipette ist gewöhnlich angebracht an den Mikroinjektor bei einem ungefähren Winkel von 60 o gegenüber dem Boden des Einspritzschale. Die Spitze der Pipette gebogen ist, so dass es an den Boden der Schale parallel ist, die für die korrekte Einspritzung des Embryos in seinem mittleren Ebene notwendig ist.
le "> 2. Setup-Mikromanipulator

  1. Überprüfen Sie, ob die Mikroinjektoren voll mit Öl beladen sind und dass es keine Luftblasen im System (Blasen im Mikroinjektors verhindern feine Steuerung der Einspritzung).
  2. Überprüfen Sie, ob die Mikromanipulatoren in der Mittelstellung sind. Dies wird für eine breite Palette von Bewegung der Pipetten ermöglichen.
  3. Legen Sie die Haltepipette in den linken Mikromanipulator Halter und den Injektionspipette in die richtige Mikromanipulationshalter.
  4. Lassen Sie das Öl in die Pipetten durch Kapillarität eingeben und prüfen, ob das System richtig, indem Öl nach oben und unten in der Pipette arbeitet die Mikroinjektors Kontrollen verwenden.
    Hinweis: Wenn es keine Bewegung von Öl in den Nadeln ist, könnte es eine Verstopfung sein. In diesem Fall verwenden Sie eine neue Nadel.
  5. Verwenden Sie die Mikromanipulator steuert die Pipetten in die Mitte des Mikroskops Blickfeld zu bringen. Mit 4-fache Vergrößerung, überprüfen Sie, dass die Mikropipettenspitzen im richtigen Winkel sind (S.arallel an den Boden der Schale).
    Hinweis: Eine korrekte Einstellung der Nadeln für eine erfolgreiche Injektion Schlüssel ist, und für die Ergebnisse Konsistenz.
  6. Kalibrieren Sie das Lasersystem im Anschluss an die Kalibrierung Handbuch des Herstellers.

3. Herstellung von Injektions Dish (Abbildung 2)

  1. Ein 50 & mgr; l Tropfen erwärmt (37 ° C) SOF-HEPES (Zusammensetzung detailliert in dem Abschnitt Materialien), ergänzt mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) auf der Mitte des Deckels einer 100 mm Petrischale. Legen Sie 1 - 2 ul Tropfen der Lösung auf die Injektion Tropfen injiziert nahe zu sein. Stellen Sie sicher, dass die Embryonen kühlen nicht unter RT unten.
    Hinweis: In diesem Protokoll werden wir die Dextran-Red-Farbstoff in die Injektionslösung hinzufügen zu können, die Stelle der Injektion zu visualisieren und sie verfolgen später.
  2. Decken die Tropfen in der Einspritzplatte mit etwa 10 ml Mineralöl.
  3. Setzen Sie die Injektion Schale auf der Bühne des inversen Mikroskop und bringen die pipettes in die Injektions Tropfens. Überprüfen Sie, ob die Nadeln innerhalb des Tropfens im Fokus sind. Passen Sie ihre Höhe der Mikromanipulator Kontrollen nach Bedarf verwenden.
  4. Verwendung eines Mikrodispenser laden etwa 20 - 30 Zygoten (17-20 Stunden nach der Befruchtung (hpf)) in der oberen Seite des Injektions Tropfens. Führen Injektion bei Raumtemperatur, so dass die Anzahl von Embryonen in der Injektionsabfall durch die Geschwindigkeit bestimmt, bei der die Person, die sie zu injizieren. Nicht mehr Embryonen als die Last, die in 30 Minuten injiziert werden kann.
    1. Um die Embryonen in die Mikrodispenser laden, drücken Sie den Kolben vollständig und tauchen Sie die Spitze in die Lösung, um die Embryonen enthalten. Berühren Sie die Embryonen werden mit der Spitze der Glaskapillare (einer zu der Zeit) aufgenommen und langsam loslassen der Kolben, so dass jeder Embryo in die Kapillare gelangt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Embryonen aufgenommen oder der Mikrodispenser Kapazität voll ist.
    2. Zum Lösen der geladenen Embryonen, drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis das gesamte Volumen containing die Embryonen aus der Kapillare freigesetzt.

4. Mikroinjektions

  1. Mit dem 4X Ziel, laden Sie die Lösung in die Injektionspipette injiziert werden durch Unterdruck Anwendung (Absaugen). Laden ausreichende Lösung einzuspritzen 2 - 3 Zygoten. Gehen Sie dann auf die Injektion Tropfen.
  2. Innerhalb der Injektion Tropfen, bewegen Sie die Haltepipette so die Spitze zu einer Zygote nahe kommt. Bewerben Unterdruck (absaugen) mit dem Halte Mikroinjektors so die Zygote in die Haltepipette und Wechsel zu einem 20x-Objektiv befestigt wird.
  3. Sobald der Zygote an die Haltepipette befestigt ist, überprüfen Sie die Qualität der Injektion Pipette vorsichtig auf die Embryo bewegen, ohne sie zu lösen. Eine gute Qualität Zygote sollten die beiden Polkörper (wenn auch manchmal nur einer zu sehen ist) und ein homogenes Zytoplasma. Nicht abnormal Zygoten (3A) zu injizieren.
  4. Falls notwendig, die Position des Embryos für eine korrekte EinspritzungLage. Eine gute Positionierung wäre, dass in der es etwas Platz zwischen dem ZP und dem PM, so dass die PM nicht durch den Laser beschädigt werden.
  5. Überprüfen Sie, ob die Injektionspipette auf den Embryo Mittelebene angeordnet ist, indem Sie an der Zygote an der Injektionsstelle zu berühren. Wenn es nicht auf seine Mittelebene ist, wird die Nadel dazu neigen, den Embryo zu machen, anstatt Einstich drehen. Stellen Sie die Höhe der Injektionspipette nach Bedarf.
  6. Machen Sie ein Loch in der ZP mit einem Laser (3B).
    1. Mit Hilfe der Software statt des Lasers die Laser Absehen in der ZP, wo das Loch wird (auf der gegenüberliegenden Seite, wo der Embryo in die Haltepipette angebracht ist) hergestellt werden. Mit dem Laser-Steuerungsfenster klicken Sie auf den Feuerknopf. Stellen Sie sicher, dass die Größe des Lochs groß genug ist, um eine Öffnung in der ZP für die Nadel zu schaffen passieren, ohne die Uhr zu beschädigen (Beispiel: 0,662 ms Pulsbreite / 6,9 um Lochgröße).
  7. Übergeben Sie die Injektionsnadeldurch das Loch in dem ZP und kontaktieren den PM. Weiter die Pipette nach vorne schieben , bis die Nadel ¾ der Weg in den Embryo (3C) ist.
  8. Beobachten der Position des Meniskus an der lösungs Öl Interphase, wie dies konsequent verwendet wird, um Injektionsvolumens steuern.
  9. Bewerben Unterdruck (absaugen) an der Injektionspipette, die in PM und dem Zytoplasma in die Injektionsnadel abgesaugt führen wird. Fortfahren, bis die Bewegung des Zytoplasma in die Nadel beschleunigt oder wenn Zytoplasma Inhalt mit Injektionslösung vermischen gesehen werden kann. Dies zeigt an Bruch des PM (Figur 3D).
  10. Injizieren Sie die Cytoplasma-Gehalt durch die Lösung in das Zytoplasma der Zygote durch Anlegen positiver Druck (Injektion), bis der Meniskus an der Lösung Öl Interphase folgte wieder ein Durchmesser von Zygote Äquivalent hinter dem Ausgangspunkt fortgeschritten ist.
    Hinweis: Unter unseren Bedingungen, diese Vertresentiert etwa 7 pl der injizierten Lösung (Abbildung 3E).
  11. Wechseln Sie in ein 4X Ziel und bewegen Sie den injizierten Embryo / s an der unteren Seite des Injektions Tropfens. Lassen Sie den Embryo durch Anlegen positiver Druck auf die Halte Mikroinjektors. Halten Sie die nicht injizierten Embryonen auf der Oberseite und die injizierten, die auf der unteren Seite des Tropfens zu helfen, den Überblick über die injizierten / nicht injizierten Embryonen und effizienter zu arbeiten.

5. Embryo Recovery and Injection Ergebnisse

  1. Machen Sie 3 Tropfen von ca. 200 & mgr; l in einer neuen Schale mit vorgewärmten SOF-HEPES. Sammeln Sie die injizierten Embryonen mit dem Mikrodispenser (wie oben beschrieben). Waschen Sie die injizierten Embryonen, indem sie durch die 3 SOF-HEPES bewegenden Tropfen.
  2. Zählen Sie die Embryonen während der Mikroinjektions lysiert und verwerfen sie.
    Hinweis: Ein lysiert Zygote von einem intakten ein leicht unterschieden werden kann, da die erste durchscheinend erscheint, die ganze ZP ausfüllen, und es hat in der Regel zytoplasmatischeGehalt an der Außenseite des Embryos undicht.
  3. Überprüfen Sie optional die Mikroinjektionseffizienz eines Fluoreszenzmikroskop. Beachten Sie, dass UV-Licht Exposition Embryo Schäden hervorrufen kann, die weitere Entwicklung auswirken können.
  4. Kulturgruppen von 25 injizierten Embryonen in 50 ul Tropfen Kalium simplex Optimierungsmedium (KSOM) , ergänzt mit 4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) unter Mineralöl bei 38,5 ° C, 5% CO 2 in Luft und Feuchtigkeit bis zur Sättigung.
  5. Ergänzen Sie die Kulturmedien mit 5% FBS zwei Tage nach der Injektion.
  6. Prüfen Blastozyste (BL) Raten von 7 Tagen nach der Injektion. Berechnen BL Raten als Gesamtzahl der Blastozyste Embryonen / Gesamtzahl der Embryonen kultiviert in diesem Tropfen.

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Ergebnisse

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 veranscha...

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Diskussion

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der Injektions...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Arbeiten im Zusammenhang mit dieser Technik werden von NIH/NICHD RO1 HD070044 und USDA/NIFA Hatch-Projekten W-3171 und W-2112 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MikropipettenabzieherSutter InstrumentP-97
GlaskapillarenSutter InstrumenteB100-75-10Diese Kapillaren werden für die Herstellung von Halte- und Injektionspipetten verwendet. Es können alle dicken/standardwandigen Borosilikatschläuche ohne Filament verwendet werden.
MicroforgeNarishigeMF-9Ausgestattet mit einer Linse mit 10-facher Vergrößerung.
MikromanipulatorNikon/ NarishigeNT88-V3
Inverses MikroskopNikonTE2000-UAusgestattet mit 4X, 20X Objektiven und mit einem Lasersystem.
LaserResearch Instruments7-47-500Saturn 5 Aktiver Laser.
MikrodispenserDrummond3-000-105Der Mikrodispenser wird verwendet, um die Embryonen zu bewegen. Es kann auch eine p10-Pipette verwendet werden, die jedoch so wenig Volumen wie möglich lädt.
100 x 15 mm KulturschaleFalcon351029Verwenden Sie den Deckel der Schale, um die Injektionsplatte herzustellen, da sie niedrigere Wände haben und das Positionieren und Bewegen des Mikromanipulators erleichtern. Auch der Deckel einer 60 mm Kulturschale kann verwendet werden.
35 mm KulturschaleCorning430165Diese Schalen werden für die Kultivierung der Embryonen in 50 μm verwendet. L Tropfen mit Mineralöl bedeckt. Alternativ kann auch eine 4-Well-Schale verwendet werden. Unabhängig davon, welches Gericht für die Kultivierung der Embryonen gewählt wurde, müssen sie immer mindestens 4 Stunden lang im Inkubator äquilibriert werden, bevor die Embryonen zu ihnen übertragen werden.
InkubatorSanyoMCO-19AICJeder Inkubator, der auf 38,5 μGrad eingestellt werden kann; C, 5% CO2 Bedingungen können verwendet werden.
StereomikroskopNikonSMZ800Wird zur Visualisierung der Embryonen in den Kulturtropfen und während der Wäsche verwendet. Es kann jedes Stereomikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung verwendet werden.
Steuereinheit HTMinitube12055/0400Heizsystem am Stereomikroskop angebracht.
Beheizter MikroskoptischMinitube12055/0003Heizsystem, das am Stereomikroskop befestigt ist.
Dextran-RedThermo ScientificD1828Eine sterile 10 mg/ml Lösung verwendet.
MineralölsigmaM8410Bewahren Sie das Mineralöl bei Raumtemperatur auf und schützen Sie es mit Folienpapier vor Licht.
KSOMaa Evolve BovineZenitZEBV-100Ergänzt mit 4 mg/ml BSA. KSOM-Platten für die Embryokultur sollten vor der Verwendung mindestens 4 Stunden lang in einem Inkubator äquilibriert werden.
FBSGemini-Bio100-525Verwenden Sie ein für Stammzellen qualifiziertes FBS.
ZygotenZygoten werden mit 17 - 20 hpf injiziert und können in-vitro- oder in-vivo-abgeleitet sein.
NaClSigmaS5886Endkonzentration: 107,7 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
KClSigmaP5405Endkonzentration: 7,16 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
KH2PO4SigmaP5655Endkonzentration: 1,19 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
MgCl2 6H2OSigmaM2393Endkonzentration: 0,49 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Natrium DL-LactatSigmaL4263Endkonzentration: 5,3 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
CaCl2-2H2O SigmaC7902Endkonzentration: 1,71 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
D-(−)-Fruktose SigmaF3510Endkonzentration: 0,5 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
HEPES SigmaH4034Endkonzentration: 21 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
MEM-NEAASigmaM7145Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
BME-EAASigmaB6766Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
NaHCO3SigmaS5761Endkonzentration: 4 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
NatriumpyruvatSigmaP4562Endkonzentration: 0,33 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
GlutamaxGibco35050Endkonzentration: 1 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
BSASigmaA-3311Endkonzentration: 1 mg/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
GentamicinSigmaG-1397Endkonzentration: 5 μ g/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Wasser für den EmbryotransferSigmaW1503Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
SOF-HEPES-MediumHergestellt im LaborpH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilisiert durch einen 22 μ; M Filter kann im Kühlschrank bei 4 & Grad gelagert werden; C für 1 Monat. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.
Zur Injektion wird

Referenzen

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  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).

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Nachdrucke und Genehmigungen

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