Lasergestützte Zytoplasmatischen Mikroinjektions in Vieh Zygotes

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zeigt, wie zytoplasmatische Mikroinjektionen in Nutztierzygoten durchgeführt werden. Diese Technik kann verwendet werden, um jede Lösung in den einzelligen Embryo zu bringen, wie z. B. Genom-Editing-Tools zur Erzeugung von Knockout-Tieren.

Zusammenfassung

Zytoplasmatische Mikroinjektion in einzellige Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Zum Beispiel ermöglicht es die Bereitstellung von Genom-Editing-Tools, die genetische Modifikationen erzeugen können, die in jeder Zelle eines erwachsenen Organismus vorhanden sind. Es kann auch verwendet werden, um siRNAs, mRNAs oder blockierende Antikörper zu verabreichen, um die Genfunktion in Präimplantationsembryonen zu untersuchen. Die herkömmliche Technik zur Mikroinjektion von Embryonen, die bei Nagetieren verwendet wird, besteht aus einer sehr dünnen Mikropipette, die direkt in die Plasmamembran eindringt, wenn sie in den Embryo vordringt. Wenn diese Technik auf Nutztiere angewendet wird, führt sie in der Regel zu einer geringen Effizienz. Dies liegt vor allem daran, dass Rinder-, Schaf- und Schweinezygoten im Gegensatz zu Mäusen und Ratten ein sehr dunkles Zytoplasma und eine hochelastische Plasmamembran aufweisen, die eine Visualisierung während der Injektion und Penetration der Plasmamembran erschwert. In diesem Protokoll beschreiben wir eine geeignete Mikroinjektionsmethode zur Abgabe von Lösungen in das Zytoplasma von Rinderzygoten, die sich auch bei Schaf- und Schweineembryonen als erfolgreich erwiesen hat. Zuerst wird mit einem Laser ein Loch in die Zona pellucida gebohrt. Dann wird eine Mikropipette mit stumpfem Ende durch das Loch eingeführt und vorgeschoben, bis die Spitze der Nadel etwa 3/4 in den Embryo hineinreicht. Dann wird die Plasmamembran durch Aspiration des zytoplasmatischen Inhalts in der Nadel durchbrochen. Schließlich wird der aspirierte zytoplasmatische Inhalt, gefolgt von der interessierenden Lösung, wieder in das embryonale Zytoplasma injiziert. Dieses Protokoll wurde erfolgreich für die Verabreichung verschiedener Lösungen in Rinder- und Schafzygoten mit 100%iger Effizienz, minimaler Lyse und normaler Blastozystenentwicklungsrate eingesetzt.

Einleitung

Zytoplasmatischen Mikroinjektion von 1-Zelle Embryonen ist eine sehr leistungsfähige Technik. Es kann für die Bereitstellung jede Lösung in den Embryo, beispielsweise verwendet werden, Gen-Knock-outs erzeugen Genfunktion zu untersuchen oder Gen-edited Tiere zu erzeugen. Die meisten landwirtschaftlich relevanten Nutztier Zygoten haben eine sehr hohe Fettsäurezusammensetzung, die ihr Zytoplasma opak und dunkel ¹ macht. Sie haben auch eine ziemlich elastische Plasmamembran (PM). Diese Eigenschaften machen die Mikroinjektion unter Verwendung von herkömmlichen pronukleären / Zytoplasma-Injektion wie bei Nagetieren herausfordernd und oft ungenau verwendet.

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Protokoll

1. Mikropipette Produktion

1. Injection Mikro
   1. Legen Sie ein Borosilicatglas Kapillare (Außendurchmesser (OD): 1,0 mm, Innendurchmesser (ID): 0,75 mm) in einer Mikropipette Abzieher (in der Mitte der rechten und linken Kapillar-Inhaber) und verriegeln.
   2. Verwenden Sie ein geeignetes Programm, um die Glaskapillare zu ziehen, so dass es in einer dünnen Spitze mit einem langen tapper führt. (Beispiel: Wärme: 825; Ziehen: 30; Geschwindigkeit: 120; Zeit: 200; Druck: 500).
   3. Entfernen Sie vorsichtig die gezogen Pipetten aus dem Gerät und legen Sie es auf einem Mikroschmiede in einer horizontalen Position.
   4. Bringen Sie die gezogen Pi....

Ergebnisse

Laser-assisted cytoplasmatische Mikroinjektions ist ein leistungsfähiges und zuverlässiges Protokoll - Lösungen in das Zytoplasma der tierischen Zygoten zu liefern. 3 zeigt eine allgemeine Übersicht der Zygoten vor und nach der Injektion sowie die Gesamt Umriß der Technik. Dextran-Rot wird als Injektion Lösung verwendet, um Tracking-Seite von Spritzgieß- und Effizienz und Genauigkeit ermöglichen. Erfolgreiche Lieferung der Lösung ist in Figur 4 veranscha.......

Diskussion

Mikroinjektion von Zygoten ist ein gut eingeführtes Verfahren für Lösungen in Säugetierembryonen einzuführen. Mit einigen Variationen in Abhängigkeit von der Art und dem Ziel des Experiments kann diese Technik allgemein verwendet werden. Wir zeigen, wie intrazytoplasmatischer Mikroinjektions auszuführen unter Verwendung eines Lasers den Eingang eines stumpfen Enden Mikropipette zu unterstützen. Zygotes bestimmter Tierarten (wie Rinder, Schafe und Schwein) haben einen dunklen Zytoplasma, die Visualisierung der Injektions.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Mikropipettenabzieher	Sutter Instrument	P-97
Glaskapillaren	Sutter Instrumente	B100-75-10	Diese Kapillaren werden für die Herstellung von Halte- und Injektionspipetten verwendet. Es können alle dicken/standardwandigen Borosilikatschläuche ohne Filament verwendet werden.
Microforge	Narishige	MF-9	Ausgestattet mit einer Linse mit 10-facher Vergrößerung.
Mikromanipulator	Nikon/ Narishige	NT88-V3
Inverses Mikroskop	Nikon	TE2000-U	Ausgestattet mit 4X, 20X Objektiven und mit einem Lasersystem.
Laser	Research Instruments	7-47-500	Saturn 5 Aktiver Laser.
Mikrodispenser	Drummond	3-000-105	Der Mikrodispenser wird verwendet, um die Embryonen zu bewegen. Es kann auch eine p10-Pipette verwendet werden, die jedoch so wenig Volumen wie möglich lädt.
100 x 15 mm Kulturschale	Falcon	351029	Verwenden Sie den Deckel der Schale, um die Injektionsplatte herzustellen, da sie niedrigere Wände haben und das Positionieren und Bewegen des Mikromanipulators erleichtern. Auch der Deckel einer 60 mm Kulturschale kann verwendet werden.
35 mm Kulturschale	Corning	430165	Diese Schalen werden für die Kultivierung der Embryonen in 50 μm verwendet. L Tropfen mit Mineralöl bedeckt. Alternativ kann auch eine 4-Well-Schale verwendet werden. Unabhängig davon, welches Gericht für die Kultivierung der Embryonen gewählt wurde, müssen sie immer mindestens 4 Stunden lang im Inkubator äquilibriert werden, bevor die Embryonen zu ihnen übertragen werden.
Inkubator	Sanyo	MCO-19AIC	Jeder Inkubator, der auf 38,5 μGrad eingestellt werden kann; C, 5% CO2 Bedingungen können verwendet werden.
Stereomikroskop	Nikon	SMZ800	Wird zur Visualisierung der Embryonen in den Kulturtropfen und während der Wäsche verwendet. Es kann jedes Stereomikroskop mit einer 10-fachen Vergrößerung verwendet werden.
Steuereinheit HT	Minitube	12055/0400	Heizsystem am Stereomikroskop angebracht.
Beheizter Mikroskoptisch	Minitube	12055/0003	Heizsystem, das am Stereomikroskop befestigt ist.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	Eine sterile 10 mg/ml Lösung verwendet.
Mineralöl	sigma	M8410	Bewahren Sie das Mineralöl bei Raumtemperatur auf und schützen Sie es mit Folienpapier vor Licht.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	Ergänzt mit 4 mg/ml BSA. KSOM-Platten für die Embryokultur sollten vor der Verwendung mindestens 4 Stunden lang in einem Inkubator äquilibriert werden.
FBS	Gemini-Bio	100-525	Verwenden Sie ein für Stammzellen qualifiziertes FBS.
Zygoten			Zygoten werden mit 17 - 20 hpf injiziert und können in-vitro- oder in-vivo-abgeleitet sein.
NaCl	Sigma	S5886	Endkonzentration: 107,7 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
KCl	Sigma	P5405	Endkonzentration: 7,16 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
KH2PO4	Sigma	P5655	Endkonzentration: 1,19 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	Endkonzentration: 0,49 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Natrium DL-Lactat	Sigma	L4263	Endkonzentration: 5,3 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
CaCl2-2H2O	Sigma	C7902	Endkonzentration: 1,71 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
D-(−)-Fruktose	Sigma	F3510	Endkonzentration: 0,5 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
HEPES	Sigma	H4034	Endkonzentration: 21 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
BME-EAA	Sigma	B6766	Endkonzentration: 1x. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
NaHCO3	Sigma	S5761	Endkonzentration: 4 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Natriumpyruvat	Sigma	P4562	Endkonzentration: 0,33 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Glutamax	Gibco	35050	Endkonzentration: 1 mM. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
BSA	Sigma	A-3311	Endkonzentration: 1 mg/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Gentamicin	Sigma	G-1397	Endkonzentration: 5 μ g/ml. Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
Wasser für den Embryotransfer	Sigma	W1503	Bestandteil des SOF-HEPES-Mediums.
SOF-HEPES-Medium	Hergestellt im Labor		pH 7,3 - 7,4, 280 ± 10 mOs. Filter sterilisiert durch einen 22 μ; M Filter kann im Kühlschrank bei 4 & Grad gelagert werden; C für 1 Monat. Warm bei 37 Grad; C Wasserbad vor Gebrauch.

Zur Injektion wird