Introduction
De corto alcance (tándem) splicing alternativo, donde aceptores o donantes sitios alternos están en estrecha proximidad entre sí, es común en los mamíferos, invertebrados 1 2 y 3 plantas. Se estima que 20% de los genes de mamíferos contienen sitios de empalme alternativos 2-12 nucleótidos aparte 4. Muchos de estos sitios son 3 nucleótidos aparte y el resultado en la inclusión o exclusión de un solo codón. Existe un debate acerca de la naturaleza de la regulación de empalme en estos sitios 5,6 y algunos sostienen que las diferencias de empalme con motivos son tan sutiles que la selección es estocástico 7, mientras que otros infieren regulación basada en la especificidad tisular 8.
Tándem selección del sitio de empalme se ha analizado de forma semicuantitativa mediante electroforesis capilar modificada 7, y electroforesis en gel de alta resolución 8. RNA-Seq (secuenciación de RNA) lee puede ser usado para cuantificar los coeficientes de empalme en cada empalmesitio. De esta manera, los datos de RNA-Seq ha proporcionado información sobre la regulación de los sitios de empalme 9 tándem. También ha permitido la predicción de los coeficientes de la variante de empalme esperados en base a motivos de nucleótidos 10. La mayor parte del énfasis en el empalme que incluye o excluye un solo codón ha estado en los sitios de empalme aceptor tándem que ocurren más comúnmente, conocidos como NAGNAGs (donde N = cualquier nucleótido).
Tandem donantes sitios de empalme alternativo inclusión o exclusión de un solo codón (motivo de reconocimiento GYNGYN, donde Y = pirimidina) son menos comunes que los aceptantes en tándem. Transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) es un gen clave de someterse donante tándem splicing alternativo 1,11. Los sitios de empalme de donantes tándem unirse a los exones 21 y 22 y dan lugar a la inclusión o exclusión del codón para serina-701 (S o Delta S, respectivamente) 1,11. sitios aceptores alternativos aguas abajo (40 nucleótidos de distancia entre sí) que unen los exones 22 y23a / b resultado en la inclusión de cualquiera de los 55 residuos de terminal del dominio de transactivación (α) o un dominio de transactivación truncado con 7 residuos C-terminales únicos (ß) 11. Por lo tanto, cuatro variantes de empalme son posibles.
Proteína STAT3 es un factor de transcripción y importante integrador de señal en numerosos tipos de células 12 y cuando mutado su activación constitutiva contribuye a varios fenotipos de cáncer (revisado en referencia 13). El síndrome de Job, un trastorno de inmunodeficiencia caracterizada por altos niveles de IgE, también es causada por mutaciones en STAT3 (revisado en la referencia 14). Papeles distintos para α STAT3 y proteínas variantes de corte y empalme β han sido descritas previamente 15. Inicialmente, se pensó que STAT3 β para actuar de una manera dominante negativo 16, antagonizar la actividad transcripcional STAT3 de α, pero el trabajo posterior sugerido que tiene genes diana independientes 17 18), pero un estudio reciente sugiere que STAT3 S y Delta S variantes de empalme son necesarias para la viabilidad de STAT3-adicto difuso B grandes Linfoma de células (DLBLCL) 19 células. La relevancia biológica que queda por explorar. Dado que la composición de la variante de empalme podría influir en la función, hemos tratado de descubrir si la relación fue perturbado por la estimulación de citoquinas en los eosinófilos.
Se intentó inicialmente para explorar la relación entre los dos eventos de empalme mediante el uso de PCR específico para α STAT3 y variantes de corte y empalme β, seguido de la escisión de productos con una enzima de restricción específica para las variantes de corte y empalme, S AfeI. Densitometría de productos indicado inclusión de Ser701 fue de rtornillos y las tuercas diez veces más común que su omisión (Delta S) en ambos α STAT3 y β (datos no mostrados). Sin embargo, este enfoque semi-cuantitativa no era suficientemente reproducible, y no podría ser usado efectivamente para medir las cuatro variantes de empalme de forma simultánea. Para el análisis de proporciones de cada uno de las cuatro variantes de corte y empalme, era necesario establecer un protocolo de PCR cuantitativa (qPCR) que produjo apretados (varios ensayos de una muestra dada) técnicas replica.
QPCR relativa se basa en la comparación de un gen de interés a un gen estándar o de limpieza sabe que se expresa en un nivel 20 en particular y es apropiado cuando el gen de interés y limpieza de genes se amplifican con una eficacia similar. A (ds) colorante fluorescente (cianina) de doble hebra de unión al ADN se une a amplicones de PCR 21, y después de un cierto número de ciclos, se ha producido la amplificación de fluorescencia suficiente para ser detectable. Cuanto mayor sea el nivel inicialde la transcripción, menor es el ciclo umbral valor (Ct). Puesto que la concentración de las preparaciones de ADNc se diferencia, hay que comparar la concentración de la transcripción con la concentración de una transcripción sabe que se expresa a un nivel constante en todas las muestras, como glucuronidasa-β (GUSB) en eosinófilos 22.
qPCR relativa no es factible para secuencias muy similares, como se ve en las variantes de empalme que resultan del corte y empalme tándem. Las condiciones rigurosas requeridas para amplificar específicamente las variantes de corte y empalme resultan en una menor eficiencia. En su lugar, la cuantificación absoluta debe ser utilizado 23. Esto implica la preparación de una curva estándar con concentraciones conocidas de la transcripción empalmados de interés, y que garanticen condiciones de PCR optimizar la especificidad 24. Como se ha descrito, los datos absolutos y relativos qPCR para un gen en particular se pueden combinar para informar a la comprensión de la expresión del gen en un tipo de célula particular, eneste caso STAT3 en los eosinófilos estimuladas diversamente 25.
En este documento, STAT3 variante de empalme cuantificación se describe con la expectativa de que el método se puede adaptar a estudios específicos de otros eventos tándem de empalme. Optimización era un largo proceso, donde se probaron varios pares de cebadores a diversas concentraciones y numerosas iteraciones de parámetros de ciclación en el transcurso de unos pocos meses. Las características principales del protocolo son la validación primer especificidad y cuantificación en base a las curvas de calibración con concentraciones conocidas de las variantes de empalme. qPCR relativa en conjunción demostró ser útil para nuestra aplicación, pero no es necesario.
Protocol
NOTA: Se recibieron los eosinófilos de sangre periférica sin identificar la información de acuerdo con un protocolo aprobado (# 2013-1570) por la Universidad de Wisconsin-Madison Centro de Ciencias de la Junta de Revisión Institucional de la Salud. Se obtuvo el consentimiento informado firmado por el donante para el uso de cada muestra en la investigación.
1. Creación de los plásmidos como las Normas de plantilla
- Crear cebadores para una amplificación que abarca tanto a los sitios de empalme STAT3, con 5 'sitios de restricción KpnI y NheI (y 5'-extensions) según la Tabla 1a.
NOTA: los sitios KpnI y NheI se eligieron para permitir inserciones que se ligó en un vector pET-28a modificado con resistencia a la kanamicina 25,26 sitio KpnI se había añadido en el sitio de clonación múltiple.. - El uso de eosinófilos recién donados, preparar muestras duplicadas de 2,5 x 10 6 células / ml en medio de cultivo celular (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640). Se incuba durante 1 hora a 37 ° C en 5% de CO2 y 10% de humedad.
- Preparar ADN (c) complementaria a partir de muestras (por lo menos 1 x 10 6 células por preparación) según las instrucciones del fabricante usando la extracción de RNA y kits de síntesis de ADNc.
- A partir de ADNc molde preparado en la etapa 1.2.1, amplificar empalme STAT3 variantes usando amplificación por PCR según la Tabla 2a.
- Resolver los amplicones en gel de agarosa al 2% Tris-acetato-etilendiaminotetraacetato (TAE) 27. bandas sobre el consumo del gel y se purifican de acuerdo con las instrucciones del kit de gel de escisión.
- Amplicones de corte y plásmido con enzimas de restricción apropiadas (resumen de la restricción en la referencia 27), utilizando volúmenes, tiempos y temperaturas de incubación recomendados por el proveedor de la enzima; y purificar como en el paso 1.4. Ligar amplicones restringidas en el plásmido en condiciones de proveedor-recomendado.
- Preparar un cont negativorol (restringido ADN de plásmido sin inserto pero con ligasa) y un control positivo (plásmido sin restricciones con resistencia a la kanamicina). Realizar transformaciones de plásmidos estándar de E. competente coli DH5a 28 utilizando mezclas de unión 27.
- Incubar transformado E. coli en 1 ml de caldo Luria-(LB) (preparado como se indica 27) con agitación durante 1 hora a 37 ° C. transformantes extendieron sobre placas LB que contenían 50 mg / ml de kanamicina y se incuba a 37 ° C durante la noche.
- Recoger varias colonias de las placas α STAT3 y STAT3 beta usando palillos de dientes estériles 27. Transferir cada a 2 ml LB. Los cultivos deben mantenerse durante toda la noche a 37 ° C en una incubadora con agitación.
- Purificar plásmidos a partir de cultivos bacterianos, siguiendo las instrucciones proporcionadas en un kit de purificación de ADN. plásmidos almacenar a -20 o -80 ° C.
- plásmidos secuencia a partir de varias colonias mediante la preparación de 20 reacciones de secuenciación mu l. 3 pipetal de tampón de reacción de secuenciación, 2 l de mezcla de reacción de secuenciación, 12 l de agua ultrapura, 1 l de plásmido como plantilla y 2 l cebador de secuenciación.
NOTA: Si está usando vectores pET-28a, utilizar cebador de secuenciación 5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGG-3 '.- Evaluar electroforetogramas de plásmidos que codifican cada variante: Sα, Sß, ΔSα y ΔSβ 25.
- la concentración medida de ADN plásmido puro en ng / l. Si la lectura de la absorbancia a 260 nm utilizando un espectrofotómetro, el cálculo de la concentración de ADN utilizando la ley de Beer-Lambert 29:
Donde c = concentración, A = absorbancia, ε (coeficiente de extinción) = 0,02 (g / ml) -1 cm -1 para el ADN y L = longitud del trayecto de doble cadena de la luz (por lo general de 1 cm). - El uso de los pesos moleculares de STAT3 empalme variante cDNA amplicons y el vector, calcular el número de copias por l.
NOTA: El peso molecular por par de bases (pb) se estima como 650 Da.
2. Analizar Primer especificidad para Absolute qPCR
- Preparar 1 en 10 series de dilución de los plásmidos STAT3, con ~ 10 8 10 3 copias por l (20 l) con agua ultrapura. La concentración medida de mayor concentración (~ 10 8 copias por l, véase la etapa 1.11).
- Utilizar plásmidos diluidas para preparar cuatro mezclas "no objetivo" (es decir., Control negativo STAT3 ΔSβ que contiene concentraciones iguales de STAT3 Sα, ΔSα, Sß pero sin ΔSβ) a los 10 6 copias por cada l. Preparar una mezcla de "destino" con concentraciones iguales de las cuatro plantillas de cada una a 10 copias por 6 l.
- Preparar la solución par de cebadoress para cada variante de empalme (véase la Tabla 1b y la Figura 1) al hacer ~ 60 l de cebadores cada uno a una concentración de 7 mM (concentración final en la muestra será 560 nM).
- Diluir la ADN polimerasa / unión dsDNA mezcla colorante 7: 5 con pura H 2 O.
- Se dispone el ensayo 1 en una placa de 96 pocillos PCR como se muestra en la plantilla (Tabla 3).
- Añadir 21 l diluyó la mezcla de tinte de ADN polimerasa / dsDNA vinculante, a continuación, 2 l de mezcla de cebadores y 2 l de plantilla (según la Tabla 2b). En lugar de plantilla, añadir 2 l filtrados H2O con el control sin plantilla (NTC) también. Creados reacciones por duplicado para evaluar la repetibilidad 30.
- La placa del sello qPCR con cubierta adhesiva y centrifugar durante 5 minutos a 1.200 xg a 12ºC.
- Si el uso de software que aparece en Materiales, configurar el experimento tal como se describe.
- Encienda la máquina qPCR y el inserto de placa de sellado qPCR. Haga clic en Archivo y# 62; Nueva> Siguiente> Seleccione "Nuevo detector", elegir reportero, extintor y proporcionar nombre. Establecer un "nuevo detector" para cada variante de empalme.
- Seleccione Siguiente y establecer normas cuando se le indique en la página Configuración de placa de la muestra, asegurando cantidades se introducen en la mesa y detectores adecuados se seleccionan. Haga clic en Finalizar.
- Configurar el ciclismo según la Tabla 2b. Asegúrese de que la lectura de fluorescencia (para determinar Ct) se produce durante la etapa de 72 ° C de cada ciclo. Seleccione Ejecutar.
- Cuando carrera se ha completado, haga clic en el> pestaña pestaña Resultados gráfico de amplificación. Evaluar gráfico de amplificación de salida para evaluar la calidad de los datos (busque una trama exponencial, como en la Figura 2).
NOTA: Asegúrese de gráficas de amplificación exponencial son en su mayoría y que el ciclo umbral se puede fijar en la parte exponencial de la trama. Asegurar las preocupaciones no comerciales no se amplifican y otros puntos estándar demuestran un bajo valor de Ct con una alta ΔRn. - a expORT se traduce a una hoja de cálculo, haga clic en Archivo> Exportar> Resultados.
3. Evaluar Absoluto qPCR Ensayo de Especificidad y repetibilidad
- repetibilidad
- Utilizar los datos desde el paso 2.7.5 para calcular la desviación estándar de Ct (ciclo umbral de fluorescencia) valores.
Donde N = número de muestras (2 si se hace por duplicado),
= Ct y de la muestra 
= Muestra Ct significa. Compruebe que la desviación estándar de los valores de Ct de duplicados es ≤0.2. Compruebe que los valores de Ct en todo menos en los pozos NTC son más pequeños que 38. - Si repetibilidad es pobre parámetros a optimizar el ciclismo, ya sea por tiempo de recocido aumentando o disminuyendo.
- Utilizar los datos desde el paso 2.7.5 para calcular la desviación estándar de Ct (ciclo umbral de fluorescencia) valores.
- Parcela copia del registro entumecidaer (como se determina en el paso 1.12 y preparada en el paso 2.1) vs valor de Ct para crear una curva estándar; dando la siguiente ecuación:
Donde y es Ct, m es la pendiente, x es log (número de copias) y b es el valor de intercepción.
NOTA: El valor de R 2 de la regresión lineal será ≥0.95 de buenos datos. - Calcular la eficiencia de amplificación utilizando la curva estándar y la ecuación:
NOTA: Objetivo para la eficiencia ≥75%. - Calcular la especificidad del ensayo qPCR 1 según la fórmula de Too:
Donde objetivo Δ Ct = Ct Demasiado - Ct no objetivo, que describe la diferencia en el número de ciclo umbral para el amplificador específica y no específicalification
NOTA: Especificidad debe exceder de cuatro órdenes de magnitud (es decir, el factor de especificidad ≥4.).- Si es pobre especificidad, optimizar mediante la reducción de la concentración de imprimación. Configurar ensayos (como se describe en los pasos 2.5-2.7) con concentraciones de cebador finales que van de 100 nM a 500 nM.
= Ct y de la muestra 
= Muestra Ct significa. Compruebe que la desviación estándar de los valores de Ct de duplicados es ≤0.2. Compruebe que los valores de Ct en todo menos en los pozos NTC son más pequeños que 38. 
4. Realización de Ensayos relativos qPCR
- Tratar las células con citoquinas para promover la transcripción.
- Para eosinófilos recién donados, preparar muestras duplicadas de 2,5 x 10 6 células / ml en medio de cultivo celular (RPMI 1640) y se trata con 50 ng / ml de interleucina-3 (IL3) y / o 50 ng / ml de factor de necrosis tumoral α ( TNFa) por períodos de 3, 6, 9 y 20 horas a 37 ° C bajo 5% de CO2 y 10% de humedad.
- Preparar cDNA a partir de muestras de eosinófilos (al menos 1 x 10 6 células por preparación) según las instrucciones del fabricante usando los kits de extracción de ARN y síntesis de ADNc. Preparar diluciones seriadas de dos alícuotas de cDNA de la muestra (o muestras de control en reposo), con un intervalo de dilución de "1" a "1 en 1024" dilución.
- Para la dilución de 1 en 4, pipeta de 1 l de cDNA y 3 l de agua ultrapura.
- Para la dilución de 1 en 16, pipeta de 1 l de la dilución 1 en 4 y 3 l de agua ultrapura, etc.
- Configurar PCR en placas de 96 pocillos con reacciones de 25 l como pasos descritos 2.3-2.5 pero con varias concentraciones de cebadores para STAT3 pancreatitis y GUSB (véase la plantilla de la Tabla 4).
- Añadir "nuevo detector" para GUSB y siga los pasos 2,6-2,7, utilizando los parámetros de los ciclos descritos en la Tabla 2c.
- Generar curvas estándar (consulte los pasos 3.2 y 3.3) para determinar qué concentraciones de cebador resultan en la eficiencia de amplificación 95-100%.
- Configurar placa con muestras preparadas de ADNc (del Paso 4.2) y concentraciones de cebadores optimizados(ver Tabla 2c de parámetros cíclicos, reactivos y Tabla 5 plantilla de la placa de 96 pocillos).
- Realice los pasos 2,6-2,7. Repetir prueba al menos una vez y comprobar la calidad de los datos.
- Calcular el valor medio de Ct muestra duplicada Cts tanto para STAT3 y GUSB limpieza de genes.
- Obtener los valores Δ Ct para cada muestra.
- Designar la muestra en reposo (por lo general tiene menor concentración de transcripción de interés) como Muestra 0. 31 Ct para cada muestra (en este caso designado como muestra de X) Calcular ΔΔ:
- Calcula plegable aumento para cada muestra:
- reproducibilidad
- Calcular el coeficiente de variación (CV) del número de copias de pan-STAT3 y GUSB.
Donde N = número de muestras, = número de copias calculado de la muestra y = media de la muestra. Compruebe que la CV de cada muestra (ensayos múltiples) es ≤10%.
- Calcular el coeficiente de variación (CV) del número de copias de pan-STAT3 y GUSB.
5. Analizar Absoluto qPCR datos para muestras desconocidas
- Comparación de los valores de Ct obtenidos en relación qPCR (como se describe en el paso 4.9) para GUSB gen de mantenimiento para asegurar concentraciones de cDNA muestras estarán dentro de un orden de magnitud.
- Diluir ADNc en consecuencia (por ejemplo, si la muestra 1 tiene un valor de Ct ~ 17.5, y los valores de Ct otras muestras son '~ 21, la muestra 1 es más o menos 2 (21-17.5) = 11 veces más concentrado Realizar una. 1: 1 con dilución agua ultrapura dentro de la misma gama sin diluir más de lo necesario).
NOTA: vastamente diferentes concentraciones de partida serán sesgo del análisis de regresión lineal (paso 4.12).
- Diluir ADNc en consecuencia (por ejemplo, si la muestra 1 tiene un valor de Ct ~ 17.5, y los valores de Ct otras muestras son '~ 21, la muestra 1 es más o menos 2 (21-17.5) = 11 veces más concentrado Realizar una. 1: 1 con dilución agua ultrapura dentro de la misma gama sin diluir más de lo necesario).
- Se dispone el ensayo qPCR absoluta de las muestras. Preparar ensayo de placa de plantilla 2a para Sα y Sß según la Tabla 6; y preparar 2b ensayo para ΔSα y ΔSβ según la Tabla 7. Realizar ensayos como se describe en los pasos 2.6-2.7.3 (y 2b). Repetir los ensayos al menos una vez.
- Comprobar la calidad y exportación de datos como se describe en los pasos 2.7.4-2.7.5.
- Configurar absoluta placa de qPCR 96 con reacciones de 25 l utilizando cebadores pan-STAT3 (cebadores en la Tabla 1c, plantilla de la Tabla 8) en 400 mM y una mezcla de los cuatro plásmidos o un único plásmido a concentraciones totales mencionados.
NOTA: La eficiencia no importa para qPCR absoluta, pero la optimización de la eficiencia de estos cebadores es importante para el pariente qPCR (Paso 4). - La placa del sello qPCR con cubierta adhesiva y centrifugar durante 5 minutos a 1.200 xg a 12ºC.
- Configurar "nuevo detector" de la cacerola- STAT3 como en los pasos 2.7.1-2.7.3.
- Establecer un ciclo de pan- STAT3 según la Tabla 2c (mismas condiciones que en relación qPCR). Asegúrese de que la lectura de fluorescencia (para determinar Ct) se produce durante la etapa de 72 ° C de cada ciclo. Repetir el ensayo al menos una vez para asegurar la reproducibilidad.
- Comprobar la calidad y exportación de datos (consulte los pasos 2.7.4-2.7.5).
- Si gráficas de amplificación no son exponenciales (véase la figura 2), diluir cDNA de la muestra (1:10) y repetir ensayo como se describe (paso 5.7).
- Usando la ecuación de la curva estándar (ver 3.2, Figura 3) y los valores de Ct de las muestras, calcular el número de copias de cada variante de empalme y de STAT3 pan- en cada muestra.
- Registro de la parcela (valores absolutos del número de copias qPCR obtenidos para pan-STAT3) vs log (valores absolutos acumulados qPCR número de copias para STAVariantes de empalme T3).
NOTA: regresión lineal y la pendiente Ideal valores de ambos serían ~ 1. - Calcula repetibilidad (Paso 3.1) y reproducibilidad (Paso 4.13).
6. La fusión absoluta y relativa de datos qPCR
- Multiplicar la proporción de la variante con el total de STAT3 plegable aumento para calcular plegable aumento de cada variante de empalme.
- Calcular las desviaciones estándar (véase el paso 3.1.1) de los valores absolutos y relativos para dar cuenta de la propagación del error. Determinar el error estándar de la media (ESM), como se muestra:
Representative Results
QPCR datos de buena calidad generarán un gráfico de amplificación sigmoidal (figura 2a), lo que significa aumento exponencial en las transcripciones en el transcurso de la bicicleta. La presencia de un exceso de plantilla puede dar lugar a un fondo de fluorescencia de alta, lo que significa un nivel de referencia apropiado se establece en los primeros ciclos. Si los datos no proporcionan una curva exponencial (Figura 2b), una mayor optimización es necesario (descrito en los pasos 3.1 y 3.4). Para más información acerca de cómo solucionar qPCR resultados, consulte la referencia 32. Las curvas estándar generadas para los plásmidos de plantilla del calibrador indicarán la eficacia de la amplificación (curva para STAT3 Sα muestra en la Figura 3). se observaron eficiencias entre 83 y 95% en las condiciones descritas. La ecuación para la especificidad (Paso 3.4) asume la misma eficacia, lo que es poco probable 25, por lo que la especificidades probable que sea mayor que el factor especificidad sugiere.
Con el fin de evaluar la congruencia de los niveles de STAT3, se midieron los valores absolutos de cada una de las cuatro variantes de empalme, así como el nivel de STAT3 total, de las últimas utilizando cebadores que amplifican una región común a las cuatro variantes de empalme (Figura 4). Lo ideal sería que la regresión lineal (indicación de correlación) y la pendiente (relación de STAT3 pan- a las variantes de corte y empalme sumadas) deben tanto estar cerca de 1.
Los datos absolutos qPCR se presentan como gráficos circulares para mostrar las proporciones de las cuatro variantes de empalme con el tiempo después de la estimulación con citoquinas (Figura 5a). Eosinófilos en reposo (0 h) tenían la menor proporción de STAT3 Sα, aunque esta variante fue siempre el más abundante. Multiplicando la fracción de STAT3 β variantes de corte y empalme (S ^6; ΔSβ +) por la fracción de variantes de empalme STAT3 Delta S (+ ΔSα ΔSβ) produjo de forma consistente un valor inferior al valor registrado experimentalmente para ΔSβ. Si los eventos de corte y empalme fueron independientes, uno esperaría que la multiplicación de fracción de? S variantes por la fracción de las variantes de beta daría un valor que está de acuerdo con el valor determinado experimentalmente. Los niveles más altos de ΔSβ de lo esperado de eventos de empalme independientes sugiere que existe un sesgo co-empalme.
La fusión de los datos absolutos y relativos qPCR demostró que los niveles de todas las variantes de empalme STAT3 se incrementaron después de la estimulación con citocinas IL3 y TNFa, con niveles pico 6 horas después de la estimulación (Figura 5b - e). Para tres de las cuatro variantes de empalme, los niveles de transcripción fueron aproximadamente 3 veces mayor en los eosinófilos tratados IL3 + TNFa (6 h) en comparación con los eosinófilos en los mediosen el mismo punto de tiempo. Sα niveles de STAT3 fueron 3,5 veces más alta en los eosinófilos tratados IL3 + TNF en comparación con los eosinófilos en los medios de comunicación en este punto de tiempo. La mayor incertidumbre (el mayor error estándar de medición) se observó en ΔSβ (Figura 5e), que comprende la fracción más pequeña del total de STAT3 en todas las muestras. Esto no era sorprendente, ya que los niveles más bajos están asociados con los valores de Ct superiores. Que requiere más ciclos para alcanzar el umbral del ciclo agravará la incertidumbre debido a la variación ciclo a ciclo en la eficiencia de la amplificación.
Figura 1: Esquema de pares de cebadores utilizados para llevar a cabo qPCR de variantes de corte y empalme STAT3 y cebadores utilizados para amplificar específicamente cada una de las variantes de corte y empalme (STAT3 Sα, Sß, ΔSα y ΔSβ respectivamente) son s-STAT3 pan.hown. Cebadores directos (STAT3 "S" y "Delta S") abarcan la unión entre los exones 21 y 22. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Gráficas de amplificación de datos de qPCR (a) gráficas de amplificación sigmoideas significa amplificación fiable. Estos datos se obtuvieron de qPCR de dos diluciones en serie de plásmido que contenía STAT3 Sα, con cada par de líneas de color que representan a los niveles de fluorescencia de las muestras duplicadas diluido a lo largo de 40 ciclos (eje x). La muestra más concentrada (verde-gris) estaba suficientemente amplificada por ciclo de 17 (con colorante proporcional a la fluorescencia, que se muestra en el eje y dsDNA vinculante) para superar el valor de fluorescencia umbral (Baseline se muestra como flecha verde). Su valor Ct sería 17. (b) parcelas no exponencial sugieren que el umbral de fondo de fluorescencia no se estableció correctamente en los primeros ciclos. Esto podría ser debido a la presencia de un inhibidor, o una plantilla o cebadores altamente concentrada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: curva estándar de log (número de copias de STAT3 Sα) vs Ct Existe una relación lineal entre el logaritmo del número de copias y el umbral de ciclo de cada variante de empalme STAT3 (Ct).. Creación de una curva estándar a partir de ADN plásmido imita el ADNc de muestras y por lo tantoproporciona una medida mejor que una curva creada a partir de amplicones de PCR diluidas. Los datos presentados son los valores de Ct obtenidos de qPCR de dos diluciones en serie de plásmido que contenía STAT3 Sα. A partir de esta curva, el número de copias presente en cada muestra se puede interpolar, y la eficiencia de amplificación calculado (83,9%). Aunque intercepta y- son menos reproducible que la pendiente, la ordenada al origen sugiere serían necesarios 42,2 ciclos para estar seguro sin ADN diana está presente. Las barras de error indican la SEM, n = 3. Curvas comparables se construyeron para STAT3 Sß, ΔSα y ΔSβ (no se muestra). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Comparación de pancreatitis cuantificada
Figura 5:. Niveles de variante de empalme STAT3 fluctuaron durante el curso del tratamiento de citoquinas (a) Los gráficos circulares que indican porcentajes de cada variante de empalme STAT3en los eosinófilos durante el tratamiento con IL3 y TNFa. (B - e) Los cambios en las variantes de empalme STAT3 en eosinófilos tratados con diversas combinaciones de citocinas, medida mediante la combinación de los datos relativos y absolutos qPCR Sα (B), Sß (c), ΔSα (d), y ΔSβ (e) los niveles de STAT3. fluctuado con el tiempo después de la estimulación. Los niveles aumentaron inicialmente, alcanzando un máximo de 6 horas después de la estimulación. La combinación de IL3 + TNFa produjo mayor tiempo de expresión de todas las variantes de corte y empalme de cuatro STAT3 que IL3 sola. SEM calculada para cada punto de datos que representa la propagación del error. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Los cebadores usados para la amplificación (a), absoluto (b) y relativo (c) PCR cuantitativa. Cebadores de clonación tienen secuencias de restricción y 5'-extensiones para el corte eficiente. KpnI y NheI sitios de restricción se indican en negrita. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 2. Los parámetros de los ciclos de PCR (izquierda) y volúmenes de reactivos (derecha) para la amplificación (a), relativo (b), absoluta (c) PCR cuantitativa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Tabla 3:. Plantilla para el ensayo de calibración absoluta plásmido qPCR Este ensayo es necesario evaluar la reproducibilidad y la eficacia, así como la generación de las curvas de calibración a partir de la cual para interpolar datos. Las mezclas "no objetivo" se dará una estimación de la especificidad. La optimización puede ser necesario para lograr la consistencia. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 4:. Modelo para la relativa qPCR (STAT3 pancreatitis y la limpieza GUSB gen) de ensayo de calibración A diferencia absoluta qPCR, el objetivo de este ensayo es determinar las condiciones en las que la eficiencia de amplificación es de ~ 100%.tp_upload / 54473 / 54473tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 5:.. Modelo para el ensayo de la muestra relativa qPCR para medir pan-STAT3 y limpieza de genes GUSB Las curvas de calibración se repiten junto con las muestras para garantizar la eficiencia comparable de los ensayos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 6: Modelo para el ensayo de la muestra qPCR absoluta para medir variantes S Las curvas de calibración se repiten junto con muestras para asegurar ef comparables. cacia de los ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 7:.. Modelo para el ensayo de la muestra qPCR absoluta para medir variantes? S Las curvas de calibración se repiten junto con las muestras para garantizar la eficiencia comparable de los ensayos Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Tabla 8: Modelo para el ensayo de la muestra qPCR absoluta para medir STAT3 pancreatitis.large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
Discussion
Hemos desarrollado este protocolo con el fin de evaluar los niveles y proporciones de transcripciones variantes de corte y empalme de STAT3 en eosinófilos y células de linfoma y saber si la estimulación de citoquinas afectó los niveles y proporciones. STAT3 es de particular interés debido a su funcionalidad pleiotrópica e incierto, con informes contradictorios sobre si actúa como una oncoproteína o supresor de tumores en el cáncer (revisado en referencia 33). Las diferencias en la STAT3 α y β variante de empalme función se habían caracterizado previamente 34,35, y el protocolo facilitado un análisis knock-down / re-expresión que sugiere la necesidad de una relación óptima de S y? S transcripciones 19.
cuantificación exacta de distintas variantes de empalme facilitará ulteriores investigaciones relativas función de STAT3 heterogénea composición para empalmar variante. El protocolo integra los datos absolutos y relativos qPCR, la combinación de la capacidad de absoluto qPCR para calcular las proporciones de variantes de empalme, y relativa qPCR para medir los cambios en la expresión general de STAT3. Este enfoque permite distinguir diferencias sutiles en la secuencia y al mismo tiempo la medida de relaciones de corte y empalme en dos sitios de corte y empalme alternativos más de 50 nucleótidos de diferencia. La determinación de las proporciones de los eventos de empalme de forma individual no se habría producido el notable descubrimiento de que un sesgo co-splicing existía tal que los niveles de ΔSβ son más altos de lo previsto si los usos de los dos sitios se empalman al azar 25.
Críticamente, absoluta qPCR con el uso de curvas de calibración plásmido permite la cuantificación (en la eficacia sub-óptimo) de las variaciones de corte y empalme que resultan en secuencias muy similares. Anticipamos una novela sutil empalme ensayo qPCR debería tomar aproximadamente dos meses para optimizar. Los pasos clave en el desarrollo del ensayo son la creación de plásmidos STAT3 utilizados en la generación de curvas de calibración para qPCR absoluta; experimentalmentela determinación de secuencias de cebadores óptimos y parámetros de los ciclos para garantizar la especificidad y reproducibilidad; y la integración de los datos relativos qPCR deriva de la cuantificación de pan-STAT3 expresión relativa a la expresión de GAPDH. La correlación del número de copias cuantificado por pan- STAT3 frente cuantificación acumulativa (Sα + ΔSα + Sß + ΔSβ) muestra que el protocolo produce resultados fiables.
Una advertencia de la técnica es el extenso proceso de validación. Es necesario evaluar la variabilidad intra-ensayo (repetibilidad), la variabilidad entre ensayos (reproducibilidad) y especificidad. El protocolo se describen maneras de conseguir salidas numéricas para estos parámetros. Nosotros consideramos la eficiencia ≥75%, factor de especificidad ≥4, coeficiente de variación (reproducibilidad) ≤10% y la desviación estándar de Ct (repetibilidad) ≤0.2 umbrales adecuados 30. Las mutaciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos 1-690 STAT3 no serán descubroja por este protocolo, aunque pueden influir en las proporciones de empalme. Proporciones de transcripción podrían no ser proporcional a proteoform proporciones 36.
Dado que las muestras tienen diferentes cantidades a partir de ADNc total absoluta qPCR es adecuado para comparar el número de copias de las variantes de empalme dentro de una muestra, pero no para la comparación entre muestras a menos que junto con relativa qPCR utilizando un gen de mantenimiento establecido. El método descrito se ajusta a las directrices MIQE qPCR para la reproducibilidad 30. parámetros de los ciclos de PCR y las concentraciones de cebadores pueden necesitar ser modificados para obtener datos reproducibles si se utiliza otros equipos. especificidad perfecta no es posible sin comprometer la eficiencia de manera drástica, pero el objetivo se amplificó de manera más eficiente por más de cuatro de órdenes de magnitud.
ADN lineal se amplificó con mayor facilidad a la circular. Si un plásmido alternativa no proporciona las curvas de calibración satisfactoria (R2 <; 0,95), consideran linealizar el plásmido por la restricción de sitio único antes de la cuantificación. La optimización de qPCR es crucial para la obtención de datos de buena calidad (Figura 1). La mayoría de los protocolos de qPCR se basan en dos etapas de ciclismo, y las máquinas son optimizados en consecuencia. calentamiento no uniforme del bloque de calentamiento puede ser exacerbada en tres pasos de ciclo, lo que contribuye a la mala repetibilidad. Los ensayos se deben configurar en condiciones estériles con puntas de pipeta y filtro de agua ultrapura, idealmente en una campana de flujo laminar dedicado. Debido a que los contaminantes pueden conducir a resultados inconsistentes, los ensayos deben crearse en condiciones estériles con puntas de pipeta y filtro de agua ultrapura, idealmente en una campana de flujo laminar dedicado. Para obtener más información acerca de la optimización de qPCR, consulte Bustin et al. 32
La cuantificación de STAT3 puede conducir a un mayor conocimiento en una serie de contextos. STAT3 auto-regula su propia expresión 37, y el protocolo descrito anteriormente puede ayudarpara dilucidar si las proporciones de variantes de empalme STAT3 contribuyen a la regulación de este bucle de retroalimentación positiva. El protocolo podría ser usado para estudiar los cambios en las relaciones de variante de empalme como se observa en las células a diferentes densidades de 38 o en el transcurso de desarrollo: se sabe que la relación de α / β STAT3 cambios en el nivel de proteínas durante la hematopoyesis 16. Sundin et al. encontrado que un polimorfismo de nucleótido único empalme sesgado intrónica del exón 12 en STAT3 de un paciente con síndrome de Job 39. Es concebible que uno de los muchos SNPs presentes en los intrones entre el exón 21 y 22, o el exón 22 y 23 pueden contribuir a las relaciones de empalme de? S / S y α / β, respectivamente. El ensayo podría ser utilizado para cuantificar las transcripciones STAT3 en células cancerosas, donde las mutaciones o cambios en la regulación de empalme pueden introducir un sesgo para el proceso de empalme 40. Las mutaciones en los factores de empalme (como SF3B1), como se observed en los síndromes mielodisplásicos 41 también puede dar lugar a cambios que se pueden medir mediante este protocolo.
En términos más generales, este enfoque detecta específicamente co-asociación en el empalme, que no es factible con convencional RNA-Seq, ni estándar qPCR. Mientras que el fenómeno de la mutuamente excluyentes empalme exón demuestra coordinación de las decisiones de corte y empalme, la co-asociación de otros eventos de corte y empalme no ha sido bien investigada. Un método alternativo descrito recientemente, en el que el ARN-Seq se modificó a fin de interrogar a ADNc de longitud completa, sugiere eventos de splicing distantes son más co-dependiente que se pensaba anteriormente 42.
STAT3 contiene un sitio de empalme de donantes tándem. Aceptor de empalme sitios tándem son más frecuentes 43 y los principios del protocolo descrito podrían servir como punto de partida para el desarrollo de ensayos para la detección de coincidencia de NAGNAG empalme y otros eventos de empalme dentro de los 200 nucleótidos. otros potenciales aplicaciones incluyen la cuantificación de coincidencia de otros sutiles diferencias en la secuencia, como indeles o polimorfismos de nucleótido doble / triple 44.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer los Institutos Nacionales de Salud-NHLBI para el Proyecto de Programa de Subvenciones sobre el papel de los eosinófilos en las vías respiratorias inflamación y remodelación: P01HL088584 (PI: N. Jarjour), y la Universidad de Wisconsin Centro de Cáncer Carbone y el Departamento de Medicina para la financiación habitual. Agradecemos a Douglas Annis para la clonación de las cuatro variantes de STAT3.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MJ Research PTC-200 Thermal Cycler | GMI | N/A | Used for standard PCR |
| 7500 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | N/A | qPCR machine |
| GS-6R | Beckman Coulter | N/A | centrifuge for 96-well plates |
| Nanodrop 2000 sprectrophotometer | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| RPMI-1640 medium | Sigma Aldrich | R8758 | cell culture medium |
| PfuTurbo DNA Polymerase | Agilent Technologies | 600410 | DNA polymerase for standard PCR |
| KpnI | New England Biosciences | R0142S | |
| NheI | New England Biosciences | R0131S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Qiagen | 330523 | qPCR, DNA polymerase/dsDNA-binding dye mix |
| Rneasy Mini Kit | Qiagen | 74204 | RNA extraction kit |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Invitrogen (ThermoFisher Scientific) | 18080-044 | cDNA synthesis kit |
| Primers | Integrated DNA Technology | N/A | |
| NEBuffer 1.1 | New England Biosciences | B7201S | |
| GenePure LE Agarose | ISC BioExpress | E-3120-500 | component of TAE gel |
| Pipettors | Major lab suppliers (MLS) | N/A | |
| Filter pipette tips | Neptune Scientific | BT10XL, BT20, BT200 | |
| EU One Piece Thin Wall Plate | MidSci | ABI7501 | |
| ThermalSeal A Sealing Film | MidSci | TSA-100 | 96 well plate seal |
| pET-Elmer (variant of pET-28a) | Novagen; modified in Mosher lab | N/A | Details in PMID: 20947497 |
| Wizard Plus SV Minipreps DNA purification system | Promega | A1460 | Plasmid purification |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Sequencing kit |
| QIAEX II Gel Extraction kit | Qiagen | 20021 | Amplicon purification |
| DH5α competent cells | ThermoFisher Scientific | 18265-017 | available from several providers, see PMID: 2162051 |
| kanamycin | Research Products International Corp. | K22000-5.0 | |
| Tris base | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | component of TAE buffer |
| Acetic acid, glacial | ThermoFisher Scientific | A38C-212 | component of TAE buffer |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Chemical Company (Sigma Aldrich) | E-5134 | component of TAE buffer |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | component of Luria Broth |
| Bacto Yeast extract, technical | BD Biosciences | 288620 | component of Luria Broth |
| Sodium chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | component of Luria Broth |
| Sodium hydroxide | ThermoFisher Scientific | SS255-1 | component of Luria Broth |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 | component of Luria Broth plate |
| Lasergene SeqBuilder | DNASTAR | Figure 1 generated using Lasergene SeqBuilder software version 12.2.0 (DNASTAR) |
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