Abstract
Mångfalden av små icke-kodande RNA (sRNA) växer snabbt och deras roller i biologiska processer, inklusive genreglering, växer fram. Mest intressant är sRNAs också funnit utanför celler och är stabilt närvarande i alla biologiska vätskor. Som sådan, extracellulära sRNAs representerar en ny klass av sjukdoms biomarkörer och är troligen involverade i cellsignalering och intercellulära kommunikationsnäten. För att bedöma deras potential som biomarkörer kan sRNAs kvantifieras i plasma, urin och andra vätskor. Ändå till fullo förstå effekterna av extracellulära sRNAs som endokrina signaler, är det viktigt att bestämma vilken bärare transportera och skydda dem i biologiska vätskor (t.ex. plasma), vilka celler och vävnader bidrar till extracellulära Srna pooler och celler och vävnader kapabla för att acceptera och använda extracellulär sRNA. För att uppnå dessa mål, är det viktigt att isolera mycket rena populationer av extracellulära bärareför sRNA profilering och kvantifiering. Vi har tidigare visat att lipoproteiner, i synnerhet hög-density lipoprotein (HDL), transport funktionella mikroRNA (miRNA) mellan celler och HDL-miRNA signifikant förändrade i sjukdom. Här, vi detalj ett nytt protokoll som utnyttjar tandem HDL isolering med densitetsultracentrifugering (DGUC) och snabb-protein-vätskekromatografi (FPLC) för att erhålla högren HDL för nedströms profilering och kvantifiering av alla sRNAs, inklusive miRNA, med användning av både hög -throughput sekvensering och realtids-PCR metoder. Detta protokoll kommer att vara en värdefull resurs för att undersöka sRNAs på HDL.
Introduction
Extracellulära icke-kodande små RNA (sRNAs) representerar en ny klass av sjukdoms biomarkörer och potentiella terapeutiska mål och sannolikt underlätta cell-till-cellkommunikation 1. Den mest studerade typen av sRNA är mikroRNA (miRNA) som är cirka 22 nätter i längd och bearbetas från längre föregångare former och primära transkript 2. miRNA har demonstrerats till post-transkriptionellt reglera genuttrycket genom undertryckande av proteintranslation och induktion av mRNA nedbrytning 2. Ändå miRNA är bara en av många typer av sRNAs; som sRNAs kan klyvas från moder tRNA (tRNA-härledda sRNAs, TDR), små nukleära RNA (sRNA-härledda sRNAs, sndRNA), små nukleolära RNA (snoRNA-härledda sRNAs, snRNA), ribosomala RNA (rRNA-härledda sRNAs, RDR ), Y-RNA (yDR), och andra diverse RNA 1. Några exempel på dessa nya sRNAs har rapporterats att fungera som liknar miRNA; emellertid den biologiska fuk tio n er av många av dessa sRNAs återstår att fastställa, även om roller i genreglering sannolikt 3-6. Mest intressant är miRNA och andra sRNAs är stabilt närvarande i extracellulära vätskor, inklusive saliv, plasma, urin, och galla. Extracellulära sRNAs sannolikt skyddas från RNaser genom deras association med extracellulära vesiklar (EV), lipoproteiner, och / eller extracellulära ribonukleoprotein komplex.
Tidigare rapporterade vi att lipoproteiner, nämligen hög-density lipoprotein (HDL), transport miRNA i plasma 7. I denna studie var HDL isolerades med användning av en sekventiell metod för densitets gradient ultracentrifugering (DGUC), snabb-protein-vätskekromatografi (storleksuteslutningskromatografi gelfiltrering, FPLC) och affinitetskromatografi (anti-apolipoprotein AI (apoA-I) immunutfällning ) 7. Använd båda realtids-PCR-baserade låg densitet arrayer och individuella miRNA analyser var miRNA nivåer kvantifieras på HDL isoleras från läkathy och hyperkolesterolemiska försökspersoner 7. Med hjälp av denna metod, kunde vi profilera miRNA och kvantifiera specifika miRNA i mycket rena HDL preparat. Sedan 2011 har vi fastställt att även affinitetskromatografi ökar HDL renhet, antikroppsmättnad begränsar kraftigt avkastning, och kan vara kostsamt. För närvarande rekommenderar våra protokoll ett två-stegs sekventiell tandem metod för DGUC följt av FPLC, som också producerar högkvalitativa HDL prover för nedströms RNA-isolering och sRNA kvantifiering. På grund av de senaste framstegen inom high-throughput sekvensering av sRNAs (sRNAseq), t.ex. miRNA, och ökad medvetenhet om andra icke-miRNA Srna klasser, är sRNAseq den nuvarande state-of-the-art i miRNA och sRNA profilering. Som sådan, rekommenderar våra protokoll kvantifiera miRNAs och andra sRNAs på HDL prover med sRNAseq. Icke desto mindre kan totalt RNA isolerat från HDL också användas för att kvantifiera individuella miRNA och andra sRNAs eller validera sRNAseq resultat med hjälp av realtids-PCR enpproaches. Här beskriver vi i detalj ett protokoll för insamling, rening, kvantifiering, dataanalys och validering av högrent HDL-sRNAs.
Det övergripande målet med denna uppsats är att demonstrera och processen för sRNA kvantifiering i mycket ren HDL isoleras från human plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HDL Rening (~ 5,5 dagar)
- Densitetsultracentrifugering (DGUC, ~ 5 dagar)
- Lägg 90 mikroliter av 100x antioxidanter till 9 ml av plasma som isolerats från färska venöst blod.
- Justera plasmatätheten med KBr från 1,006 g / ml till 1,025 g / ml genom att tillsätta 0,251 g KBr till 9 ml plasma från steg 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr plasma). Rock plasma tills allt salt upplöses vid rumstemperatur och överföra till ultracentrifugrör och se till att alla bubblor stiger till toppen.
- Böj spetsen av en 18-G nål till 90 ° 1 cm från spetsen, koniska uppåt. Med hjälp av en spruta och 18-gauge nål, försiktigt placera 3 ml av overlay lösning # 1 över plasma (tabell 1).
OBS: Den böjda nålen ger alla VLDL / IDL, LDL, och HDL avlägsnas utan att blandas med overlay. - Avlägsna huvuddelen av bubblorna i toppen, vilket lämnar 2-3 mm utrymme från menisken till toppen av röret och carefully placera rören i SW-40Ti hinkar.
- Väg varje hink (med lock) på balansen, och exakt balans med det motsatta skopa (hink + cap): # 1 till # 4, # 2 till # 5 och # 3 till # 6.
OBS: Dessa hinkar måste vara balanserad och matchas vid alla tidpunkter. - Placera rotorn i ultracentrifug (Förteckning över Materials). Centrifugera vid 274.400 xg under 24 h vid 4 ° C med en # 4 mellanliggande broms.
- Försiktigt bort hinkar från rotorn och rören från hinkar.
- Försiktigt bort 2 ml från det översta lagret av överlägget användning av en spruta och böjd nål. Detta kommer att vara VLDL / IDL fraktion som kan lagras vid 4 ° C eller -80 ° C.
- Efter avlägsnande av VLDL / IDL fraktionen uppsamling av resterande 7 ml prov (plasma) och placera den i en 15 ml koniska rör. Bringa volymen av provet upp till 9 ml med overlay-lösning # 2 (tabell 1).
- Justera prov densitet från 1,025 g / ml till 1,080 g / ml med KBr använderca 0,746 g KBr i 9 ml prov eller 0,0828 g / ml KBr prov. Skaka provet tills all KBr upplöses (ca 20 min) och överför till ultracentrifugrör samtidigt säkerställer bubblor stiger till toppen.
- Med sprutan och nålen, försiktigt placera 3 ml av overlay lösning # 3 över provet (tabell 1). Lämna 2-3 mm utrymme från menisken till toppen av röret.
- Avlägsna huvuddelen av alla kvarvarande bubblor vid toppen av röret och försiktigt placera de fyllda ultracentrifugrör i SW-40Ti hinkar.
- Väg varje hink (med lock) på balansen, och exakt balans med det motsatta hink + mössa, som i 1.1.5.
- Placera rotorn i ultracentrifug (se lista över material). Centrifugera vid 274.400 xg under 24 h vid 4 ° C med en # 4 mellanliggande broms.
- Försiktigt bort hinkar från rotorn och rören från hinkar.
- Försiktigt bort 2 ml från det översta lagret av överlägget med användning av en spruta och varant nål. Detta kommer att vara LDL-fraktionen, som kan lagras vid 4 ° C eller -80 ° C.
- Efter avlägsnande av LDL-fraktionen, samla de resterande ungefärliga 7 ml prov (plasma) och placera den i en ny 15 ml koniska rör. Bringa volymen av provet (plasma) upp till 9 ml med 1,080 g / ml lösning # 4 (Tabell 1).
- Justera prov densitet från 1,080 g / ml till 1,30 g / ml med KBr använder 3,33 g KBr i 9 ml prov (plasma) eller 0,37 g KBr för varje ml prov. Rock eller svagt agitera provet tills all KBr (salt) löses och överföra till ultracentrifugrör.
- Med sprutan och nålen, försiktigt placera 3 ml av overlay lösning # 5 över provet (tabell 1).
- Avlägsna huvuddelen av alla kvarvarande bubblor på toppen av röret, lämnande 2- 3 mm utrymme från menisken till toppen av röret och försiktigt placera de fyllda ultracentrifugrör i SW-40Ti hinkar.
- Väg varje hink (med lock) på balans och exakt balans med det motsatta hink + mössa, som i 1.1.5.
- Placera rotorn i ultracentrifug (se lista över material). Centrifugera vid 274.400 xg under 48 h vid 4 ° C med en # 4 broms.
- Försiktigt bort hinkar från rotorn och rören från hinkar.
- Försiktigt bort ungefär 2 ml från det översta lagret av överlägget användning av en spruta och böjd nål. Detta är HDL-fraktionen, som kan lagras vid 4 ° C eller -80 ° C.
OBS: Efter DGUC HDL kan dialyseras för att avlägsna de hög-saltlösningar. - Att dialysera, placera den insamlade HDL-fraktionen i en förseglad dialys hylsa (10000 mw cut-off) och dialysera över natten i en L 1x PBS. Ändra dialysbuffert (1x PBS) 3 gånger under 24 timmar. Mild störning av PBS med en magnetisk omrörarstav kommer att förbättra dialys.
- Bestämma proteinkoncentrationen av det DGUC-HDL med användning av en BCA-förfarandet 8.
- Snabb-Protein Liquid Chromatography (FPLC) eller Storlek kromatografi (~ 6 h)
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (totalt protein) i 500 mikroliter genom ett 0,22 um mikro centrifugal filter (se lista över material), omedelbart före injektion.
ANMÄRKNING: En ytterligare filtrering av DGUC-HDL provet genom ett 0,45 | im mikro centrifugalfilter före 0,22 pm filter kan erfordras för vissa prover. - Samla den filtrerade DGUC-HDL prov, ladda FPLC (fyllning) injektionsspruta, och se till att det inte finns några bubblor i sprutan före injektion i FPLC.
- Ställa in flödeshastigheten FPLC till 0,3 ml / min med en tryckgräns vid 2,6 MPa. Jämvikt kolumner med 0,2 kolonnvolymer (ca 15 ml) buffert, före provinjektion. Injicera provet med 3 ml buffert in i FPLC (injektionsslinga) instrument och starta körningen. Samla 1,5 ml fraktioner för totalt 72 fraktioner.
- Filter 1,2 mg DGUC-HDL (totalt protein) i 500 mikroliter genom ett 0,22 um mikro centrifugal filter (se lista över material), omedelbart före injektion.
2. hög kapacitet Små RNASekvensering (sRNAseq, ~ 9 dagar)
- RNA-isolering (~ 1 dag)
- Identifiera FPLC-fraktioner motsvarande DGUC-HDL genom att bestämma den totala kolesterolnivåer genom att använda en kolorimetrisk kit enligt tillverkarens anvisningar. Med hjälp av denna FPLC set-up, förvänta sig att hitta 6 - 7 FPLC-fraktioner innehållande DGUC-HDL.
- Samla alla volym (cirka 8 -1 0 ml pool av 1,45 ml fraktion volymer) från DGUC-HDL FPLC-fraktioner och koncentrera användning av 10 kDa molekylviktsavskiljning centrifugal filterenheterna vid 4000 xg under 1 h vid 4 ° C eller tills HDL koncentrat är ungefär 100 mikroliter.
- Samla HDL koncentrat och kvantifiera HDL total proteinkoncentration med användning av BCA-metoden 8.
- Bestämma den högsta koncentrationen av HDL totalprotein, upp till 1 mg, som kan alikvoteras från varje prov i uppsättningen. Till exempel, isolera RNA från samma mängd av HDL totalt protein för varje prov.
- Utför RNA Isolering med hjälp avett modifierat protokoll (se lista över material).
- Lägg 10x volym fenol lysisreagens (se lista över material) prov och virvel under 1 minut.
- Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Lägg till kloroform (20% fenol lys reagensvolym som används i steg 2.1.5.1) och skaka kraftigt i 15 sekunder.
- Inkubera vid rumstemperatur under 2-3 min.
- Centrifugera i 15 minuter vid 12.000 xg vid 4 ° C i en kyld centrifug.
- Överför den övre vattenhaltiga fasen till ett nytt rör, undvika interfasen.
- Lägga 1.5x volym av 100% etanol till den vattenhaltiga fasen och vortexblanda i 1 min.
- Förvara proverna under minst 1 timme eller över natten vid -80 ° C.
- Fortsätt med RNA isolering protokoll med de medföljande minikolonner.
- Eluera med 30 mikroliter av RNas-fritt H2O Först lägga 15 mikroliter av H2O direkt till frittan, centrifugering vid låg hastighet (2000 x g) under 2 min, ochsedan snurra med hög hastighet (max) under 1 min. Upprepa detta steg med ytterligare 15 mikroliter H2O
- Omedelbart gå till sRNA bibliotek generation eller förvara vid -80 ° C.
- Bibliotek Generation (~ 6 h)
- Förbered sRNA cDNA-bibliotek med hjälp av sRNA biblioteket generationen kit-protokollet, enligt tillverkarens anvisningar med en modifiering av PCR-amplifiering enligt nedan.
- Förbered PCR mastermixens på is innehållande 0,5 mikroliter DNas / RNas-fri H2O, 15 mikroliter PCR-blandning (PML) och 1 pl RNA PCR Primer (RP1) per prov (inkludera ytterligare 10% för pipettering fel).
- Lägg 16,5 mikroliter av PCR-blandningen till vardera (cDNA) prov.
- Tilldela ett index / streckkod nummer på varje prov för multiplexering och tillsätt 1 mikroliter PCR Primer index (motsvarande nummer) till provet.
- Utför en snabb dragning med hjälp av mikro.
OBS: Total volym börnu vara 30 mikroliter per prov. - Utföra de cykelbetingelser för PCR-amplifiering enligt tabellerna 2 och 3.
- Förbered sRNA cDNA-bibliotek med hjälp av sRNA biblioteket generationen kit-protokollet, enligt tillverkarens anvisningar med en modifiering av PCR-amplifiering enligt nedan.
- Storlek Välj sRNA Bibliotek att ta bort adapter: Adaptrar (~ 1,5 h)
- Utför bibliotek storleksurvalet med automatisk DNA storleksväljaren enligt tillverkarens anvisningar med följande storleksparametrar: Mål: 156 bp, Start: 135 bp, Slut: 177 bp, Range Flagga: Bred.
- DNA Clean Up (~ 0,5 h)
- Städa upp storleksselekterat sRNA cDNA enligt tillverkarens anvisningar.
- Eluera ren och koncentrerad sRNA cDNA med 2 x 7 mikroliter DNas / RNas-fri H2O
- Kvantifiera och bedöma sRNA cDNA-bibliotek avkastning och kvalitet (~ 1 h)
- Bedöm sRNA cDNA-bibliotek kvalitet och storlek med en högkänslig DNA-chip på en Bioanalyzer (Förteckning över material) enligt Tillverkningsfact UReR anvisningar.
- Kvantifiera de enskilda sRNA cDNA-bibliotek koncentrationer genom en högkänslig DNA-analys (lista över material), enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Det rekommenderas att alla prover med olika index köras på samma körfält på flödescellen om möjligt. Om mer än ett körfält krävs, blanda fall- och kontrollprover på lämpligt sätt.
- Hög genomströmning sRNA Sequencing (~ 7 dagar)
- Pool individ indexeras sRNA bibliotek baserat på ekvimolära koncentrationer.
- Skärm poolade Srna bibliotek för kvalitet med hög känslighet DNA-chip på Bioanalyzer och bestämma bibliotek DNA-koncentration som i punkt 2.5.1 - 2.5.2.
- Utför kvantitativ PCR (qPCR) av adaptern innehåll för att säkerställa lämplig sekvensedjup med sekvense biblioteket qPCR kvantifiering kit enligt tillverkarens anvisningar (lista över material).
- Utför sekvense med hjälp av en enda läsning, 50bp-protokollet för att nå ett djup av cirka 20-25 M läser / prov, enligt tillverkarens instruktioner.
3. Data Analysis (~ 1 dag)
- Använd bcl2fastq2, enligt användarstyrinstruktioner till förbehandla rå fastq filer av demultiplexerade prover (lista över material).
- Använd Cutadapt att trimma adaptrar 9 och ta bort läser <16 nukleotider (nätter) i längd, som per användarguide instruktioner (lista över material).
- Ta bort förorenings sekvenser som är närvarande i Srna bibliotek, inklusive stopplösning sekvens (STP: CCACGTTCCCGTGG) och adapter överföring (CTACAGTCCGACGATC) använder removeSequenceInFastq funktion i NGSPERL ram, enligt manualen instruktioner (lista över material).
- Utför kvalitetskontroll mått av FastQC hjälp av Centrum för kvantitativa Sciences (CQS) verktyg, enligt manualen instruktioner (lista över material).
- Generera icke-redundant lista över "identisk" läser (kollaps redundant läser) och registrera antalet kopior med hjälp av CQSTools, enligt manualen instruktioner (lista över material).
- Justera läser för mänskliga genomet med hjälp av Bowtie1.1.2 tillåter en mismatch (alternativ: -a -m 100 --best --strata -v 1), enligt manualen instruktioner (lista över material).
- Utför läsa inriktningen, räkning, och resultera sammanfattnings uppgifter med hjälp NGSPERL, enligt användarstyrinstruktioner.
- Konvertera exporterade räkna bord till ett kalkylark.
- Normalisera läser av en specifik klass (t.ex. miRNA) till antalet läser för denna klass (t.ex. totala antalet miRNA läser) och rapport signaler Läser Per Mapped miRNA (RPMM). (T.ex. RPMM = (MIR-X / Totalt av miRNA läser) * miljoner).
- Ingång normaliserad räkna tabell som generisk enfärgad teknik i programvara för lågaktivt och hög nivå differentialanalyser per manual instruktioner (lista över material).
OBS: För närvarande finns det inga välkarakteriserade hushållningsgener / SRNSom för HDL-sRNA. En spik-kontroll kan användas, men kan vara problematiskt. Normalisera till HDL totala protein insignal eller volym rekommenderas. Viktigast är det rekommenderat att validera sekvense resultat av en av de olika strategier för att kvantifiera miRNAs och sRNAs använder realtids-PCR eller kvantitativ PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll är en serie av etablerade metoder kopplas samman för att göra det möjligt för kvantifiering av sRNAs på mycket ren HDL med hög genomströmning sekvensering eller realtids-PCR (figur 1). För att demonstrera genomförbarheten och effekterna av detta protokoll var HDL renat från humant plasma genom tandem DGUC och FPLC metod. Insamlade FPLC-fraktioner motsvarande HDL (genom kolesterol fördelning) koncentrerades och total RNA isolerades från 1 mg HDL (totalt protein). Srna bibliotek genererades med HDL samlats in från n = 4 friska humana individer. Alla mänskliga blod / plasmaprover samlades in under aktiv Institutional Review Board protokoll (# 070.416), och humanpatienter rekryterades med informerat samtycke som har godkänts av Vanderbilt University School of Medicine. Beredda bibliotek Srna sekvenserades vid Vanderbilt teknik för Advanced Genomics (VANTAGE) DNA-sekvensering center och dataanalyser utfördesmed hjälp av interna rörledningar. Datavisualiseringar skapades genom grafiska program.
Den kritiska behov av att utföra en andra metod (FPLC) för HDL isolering efter DGUC beror på eventuell samtidig rening av elfordon. Elbilar är ett generaliserat klass av membran härledda vesiklar som härrör från multivesikulära organ (exosomes), plasmamembranet spirande (mikrovesiklar), och andra processer, inklusive apoptotiska kroppar 10. EV, nämligen exosomes, har rapporterats ha en liknande densitet som små HDL (figur 2A), och därmed skulle kunna vara närvarande i HDL densitetsfraktionen (1,063 till 1,21 g / ml) efter DGUC 11,12. För att ta bort elbilar och andra lipoproteiner (t.ex. LDL), från DGUC-HDL var FPLC användes för att separera HDL från andra blåsor och partiklar efter storlek; HDL (7-12 nm i diameter) och elfordon (40-220 nm i diameter) är lätt fraktion på grund av deras storleksskillnader (Figur 2A, B). HDL-fraktionens var uppenbart på grund av fördelningen av kolesterol, och DGUC-HDL FPLC-fraktioner slogs samman och koncentrerades med användning av 10 kDa cut-off centrifuge filter. Koncentrerad HDL uppsamlades och användes för efterföljande RNA-analys (figur 2B). För att illustrera detta, var plasma före DGUC fraktion hjälp av FPLC och fördelningen av fosfolipider (fosfatidylkolin, PC); totalkolesterol (TC), och proteinnivåer kvantifierades och plottades över fraktioner. PC, TC, och proteiner nivåer kvantifieras med hjälp av tre kolorimetriska kit. Alla tre parametrar definieras tydligt HDL fraktionerna (19 - 24) och VLDL / LDL-fraktioner (14 - 18). I FPLC-fraktione plasma var protein och lipid signaler minimalt detekteras eller inte upptäcks alls i fraktioner motsvarande vesikler storlekar större än VLDL (till vänster om Orange Box) (Figur 3A). För att demonstrera DGUC separation av HDL, var DGUC-HDL också fraktioneras genom FPLC och PC, TC, och proteiner nivåerna quantifIED (figur 3B). Plotta dessa värden illustrerar samtidig fraktionering av en liten mängd av LDL med hjälp DGUC och förstärker behovet av att använda DGUC-FPLC strategi tillsammans för att isolera mycket ren HDL. Även elbilar förutspås att samverka fraktionera med HDL under DGUC, det var lite för att ingen som finns i lipid och protein i fraktioner motsvarande vesikler storlekar större än LDL (Figur 3B). EV lipid och protein signatur i den förutsagda storleksintervallet är också minimalt detekterbara eller frånvarande från DGUC-VLDL och DGUC-LDL när fraktion av FPLC (data visas ej). För RNA-analys, isolerades totalt RNA från 1 mg tandem renad HDL för sRNA biblioteksgenerering. I korthet innebar detta adaptrar ligerades till 3 'och därefter 5' terminala ändarna av sRNAs, inklusive miRNA och TDR: er (Figur 4A). Ligerade produkterna transkriberades omvänt (RT) och PCR-amplifierades med användning av PCR-primrar som härbärgerar specifika index som utformats för multiplexering prover under downstream sekvenseringsreaktioner (Figur 4A). Varje adapter är 61 nätter i längd; därför skulle ett ligerat miRNA (cirka 22 nts i längd) producera en produkt av 144 nts i längd. Många icke-miRNA sRNAs är något längre än miRNA (t.ex., 30 - 35 nts i längd). Som sådan, vår riktade längd av produkt var 156 bps i längd. Amplifierade produkter var storleksselekterat användning av en automatisk DNA-storlek väljare och alla cDNA-produkter med 135 - 177 bps i längd uppsamlades (Figur 4A). Kvaliteter av storleksselekterat bibliotek bedömdes av högkänsliga DNA-chips genom att använda Bioanalyzer (Figur 4B). sRNA cDNA bibliotek av denna storlek verkade något större på grund av möjlig "bubblande" effekter under analysen. För multiplexerade sekvensering, var ekvimolära koncentrationer av cDNA-bibliotek poolade, rengöras, koncentrerades och omanalyseras hjälp av Bioanalyzer (Figur 4B). Den multiplexerade Provet utsattes därefter sequencerad med hjälp av en enda läsa 50 bp protokoll. Egen dataanalys rörledningar användes för att demultiplexera prover baserade på index, trimma adaptrar, köra kvalitetskontroll mått, anpassa sig till det mänskliga genomet och räkna kommenterade sRNAs. Fördelningen av normaliserade läser (Läser Per Million, RPM),> 16 nätter i längd, belyser anrikningen av sRNAs 20 - 22 nätter i längd och 34 - 35 nätter i längd på HDL (Figur 4C).
Uppriktning och räkning analys av de fyra HDL-sRNA bibliotek fann att 38% av läsningar anpassa till kommenterade regioner av det mänskliga genomet var miRNA (figur 5A). Lika överflödande (37%) var sRNAs-härledda från tRNA (TDR). sRNAs-härledda från diverse RNA (t.ex. Y RNA), rRNA, små ribonukleinsyrorna, snoRNAs, och långa icke-kodande RNA (lincRNAs) var också närvarande på HDL (figur 5A). Efter normalisering till det totala antalet läser för varje klass, de 50 mest förekommande miRNAS-enheter (Läser Per Mapped miRNA, RPMM figur 5B), TDR (Läser Per Mappade TDR, RPMT figur 5C), och andra icke-miRNA icke-TDR sRNAs (Läser Per Mapped sRNA, RPMS figur 5D) organiserades av heatmaps . Dessa data visar likhet (t.ex. HDL-miRNA) och avvikelser (t.ex. TDRS) av de mest förekommande HDL-sRNAs tvärs friska individer (figur 5B-D). Dessa resultat visar kraften i denna strategi och protokoll för att ge anmärkningsvärda insikter transport av sRNAs av HDL. Ändå bör sRNA sekvense inte bli lättnad på för absolut kvantifiering. sRNAs av intresse bör godkännas av realtids-PCR. På samma sätt kan många forskare endast kräva kvantifieringen av individuella miRNA på HDL. Som sådan var totalt HDL-RNA isolerat från varje försöksperson under relativ kvantifiering av HDL-miRNA med hjälp av realtids-PCR. Fem av de mer rikliga miRNA upptäckts på HDL med sRNAseq användes för real-time PCR-analyser för att bestämma deras nivåer på varje HDL prov (Figur 5E). De relativa kvantitativa värden beräknades med hjälp av en godtycklig hushållning Ct 32 (RQV = 2 - ΔCtArb) och normaliserades till 1000 mikrogram av HDL-protein matas in i RNA isolering 13. Resultat från realtids-PCR studie visar att detta protokoll är också värdefullt för att detektera HDL-miRNA och kvantifiera skillnader mellan individer. Tillsammans de presenterade scheman definierar de kritiska uppgifter om de metoder, och resultaten från både hög genomströmning sekvensering och realtids-PCR metoder representerar resultat av detta protokoll.
Figur 1. Representativa flödesschema av protokollet. Ren HDL isoleras från densitetsgradient ultracentrifugering och snabb protein flytande Chromatog grafi. Total HDL-RNA kan sedan användas för små RNA (sRNA) sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Isolering av HDL. (A) Diagram av densiteten och diameter av lipoproteiner och extracellulära vesiklar (EV). (B) Schematisk bild av sekventiell tandem HDL isolering, inklusive plasmaseparation, densitets gradient ultracentrifugering (DGUC), snabb protein vätskekromatografi (FPLC), filtrering och koncentration. klicka här för att se en större version av denna siffra.
pload / 54.488 / 54488fig3.jpg "/>
Figur 3. Snabb-protein-vätskekromatografi (FPLC) Separation av Lipoproteiner EV, extracellulära vesiklar.; VLDL, mycket low-density lipoprotein; LDL, lipoproteiner med låg densitet; HDL, lipoproteiner med hög densitet; FP, fritt protein; PC, fosfatidylkolin; och TC, totalkolesterol. Röd linje, TC; Blå linje, protein och svart linje, PC. Separation av lipoproteiner från (A) humanplasma före densitets gradient ultracentrifugering (DGUC) och (B) HDL-fraktionen efter DGUC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Framställning av små RNA bibliotek. (A) Schematisk bild av små RNA (sRNA) bibliotek construction och storleksurvalet. miRNA, microRNA; TDR, tRNA-härledda sRNAs; sRNA, icke-miRNA icke-TdR sRNAs; RT, omvänd transkription; bp, baspar; och cDNA klonat DNA. (B) Analys av HDL-Srna bibliotek före och efter multiplexering med användning av högkänsliga DNA-chips och Bioanalyzer. (C) Längd distribution av HDL-sRNA läser efter sekvensering. RPM, Läser per miljon; M, manliga försökspersoner; F, kvinnliga försökspersoner; och nt, nukleotid. N = 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Mångfald av HDL-sRNAs. (A) Fördelning av HDL-sRNAs över Srna klasser. Fraktion av läsningar anpassas till kommenterade sRNAs i det mänskliga genomet. (BD) Heatmaps N = 4 HDL-Srna prover.
| 1. Antioxidanter för lipoprotein separation | Gör förrådslösning vid 100x |
| EDTA | Etylendiamintetraättiksyra (0,5 M stock) |
| AZT | 3-amino-1,2,4-triazol: 42 mg / ml H2O |
| BHT | Butylhydroxitoluen: 25 mg / 100 mikroliter EtOH |
| Trolox | (+) - 6-hydroxi-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-karboxylsyra: 41,7 mg / 500 | il EtOH |
| 2. Överlagringslösningar | |
| Lösning nr 1 | 1,019 g / ml i H2O |
| Lösning nr 2 | 1,025 g / ml KBr / H2O |
| Lösning nr 3 | 1,063 g / ml KBr / H2O |
| Lösning nr 4 | 1,080 g / ml KBr / H2O |
| Lösning nr 5 | 1,255 g / ml KBr / H2O |
| 3. FPLC buffert | </ Tr> |
| 1 L Recept | 50 ml 3M NaCl; 20 ml 0,5 Tris-HCl, pH 7,6; 2 ml av 10% Sodium Azide; 930 ml H2O |
Tabell 1. Särskilda reagenser.
| Skede | (° C) | Tid | cykler |
| en | 98 | 30 s | 1 |
| B | 98 | 10 s | 25 |
| 60 | 30 s | ||
| 72 | 15 s | ||
| C | 72 | 10 min | 1 |
Tabell 2.Bibliotek Generation amplifieringsstegen.
| Primer | Sekvens |
| primer 1,1 | AATGATACGGCGACCACCGAGAT |
| primer 2,1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGA |
Tabell 3. PCR-Primers.
| Skede | (° C) | Tid | cykler |
| en | 95 | 10 min | 1 |
| B | 95 | 10 s | 40 |
| 60 |
Tabell 4. Bibliotek Kvantifiering förstärkningssteg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är utformad för att kvantifiera miRNA och andra sRNAs genom hög genomströmning sekvensering eller realtids-PCR på högren HDL. Som med alla synsätt, bör särskilda överväganden ges till varje steg i processen för rening av HDL och RNA och sedan kvantifiera sRNAs. Detta protokoll är avsedd för projekt som börjar med ≥ 2 ml plasma. Ändå kan högkvalitativa RNA analyser framgångsrikt kompletteras med HDL renas från så lite som 80 mikroliter av humant eller mus plasma med hjälp av affinitetskromatografi; Men större startplasmavolymer ger bättre data med hjälp av de metoder som presenteras här. Beredning av prover och utvinningsmetoder kan drastiskt förändra miRNA / sRNA kvalitet och avkastning. Användningen av antikoagulantia, medan väsentlig för plasmauppsamling, sannolikt påverkar nedströms utvinning. Till exempel är heparin inte lätt avlägsnas under RNA-extraktion 14,15, och kan hämma nedströms enzymer som används i PCR 16-18. Dessutom, there finns rapporter om att natriumcitrat också kan störa qPCR mätningar där miRNAs från EDTA prover visat sig ha förbättrat uttryck profil jämfört med natriumcitrat prover 16,19,20. Dessa studier visar på behovet av noggrant övervägande när man väljer en antikoagulant. Dessutom, på grund av ökad risk för cellysering under koagulering, serumprover rekommenderas inte som lyserade cellulära miRNA kan artificiellt förknippar med lipoproteiner. Likaså är plasma idealiskt isolerat omedelbart från helblod för att undvika kontaminering från andra perifera blodceller, inklusive lyserade leukocyter. Kall temperatur är allmänt känd för att påverka blodplättsaktivering, är helblodprover snurrade bort från erytrocyter, leukocyter och trombocyter vid 3000 xg under 15 minuter vid rumstemperatur. Hemolys är också sjuk rekommenderas såsom brustna erytrocyter har rapporterats också påverka miRNA utfall 21,22, eftersom de innehåller miRNA som kan kasta under hemollys 23,24. Plasma kan sedan lagras vid 4 ° C under 2 - 4 veckor eller alternativt plasma kan frysas vid -80 ° C där miRNA innehåll är stabilt och lönsamt både på kort och lång sikt lagring (max 4 år) 25. Till vår nuvarande kunskap, frysning plasmaprover inte väntas skada HDL-miRNA och frysta plasmaprover är lämpliga för att analysera. Som lipoproteiner och andra hela blodkomponenter kan påverkas av födointag, fastar blodinsamling föredra.
Såsom nämnts ovan, kan plasma-HDL isoleras genom ett antal standardmetoder, inklusive DGUC, FPLC och affinitetskromatografi mot apo A-I. . Isolering av plasmalipoproteiner genom DGUC med användning av KBr, såsom beskrivits av Redgraves et al 26, separerar VLDL (d = 0,94 till 1,006 g / ml), LDL (d = 1,006-1,063 g / ml) och HDL (d = 1,063 till 1,21 g / ml) och är en idealisk metod för att stora volymer av plasma (2 - 60 ml per prov). begränsningenatt använda denna metod enbart är att exosomes och andra miRNA innehåller elbilar rapporteras ha en liknande densitet att HDL och kan förekomma i DGUC HDL (Figur 2A). Andra nackdelar inkluderar möjlig strukturell skada på proteiner från hög saltexponering i buffertar och starka ultracentrifugeringskrafter samt differential stabiliteten av HDL underklasser 27,28. Trots detta är DGUC vanligen används som det resulterar i ett högt utbyte av HDL-protein, producerade nära 1 mg av HDL protein per 1 ml plasma 29. FPLC tillvägagångssätt, som innebär storleks uteslutning gelfiltrering, kräver mindre tid, beroende på flödeshastigheten (cirka 6 h), och har större precision separera HDL från apoB-innehållande lipoproteiner (efter storlek) och deras underklasser, inklusive EVs som är mycket större än HDL men har liknande densiteter. Det bör noteras att med hjälp av de metoder som beskrivs i detta protokoll, plasma vesiklar mellan cirka 220 till 75 nm i diameter inteframkalla en detekterbar lipid eller protein signatur när separerade med FPLC. Beroende på set-up kräver FPLC relativt liten ingång, 0,3-1 ml, vilket är användbart för gnagare plasma och små frusna portioner. Snabb kolorimetriska kolesterol analyser är också viktigt efter FPLC för att bekräfta fördelningen av HDL eller andra lipoproteinfraktioner. Fraktione späder prover och lipoproteiner; emellertid kan proverna sedan koncentreras med användning av standard centrifugal storlek-filter (t.ex., 10 kDa MW cut-off-filter). HDL isolering av apo-I IP med hjälp av mikro-spinnkolonner är den snabbaste av de tre metoder, men begränsas av låg ingång (0,08-1 mikroliter) volym och lågt utbyte (ca 0,1 mg). Medan apoA-I IP kan vara arbetskrävande, är denna metod idealisk för låg volym cellkultursupernatanter. Även om var och en av dessa metoder har styrkor och svagheter, kan dessa minskas om de används i tandem (t.ex. DGUC följde FPLC). Med hjälp av två metoder i tandem, resulterar i större renhet avHDL för miRNA och sRNA analys.
Här beskrivs vi de åtgärder som krävs för att isolera mycket ren HDL använder tandemmetoden DGUC följt av FPLC och redogjorde för de steg som används för att kvantifiera HDL-miRNA och sRNAs med antingen hög genomströmning sekvensering eller realtids-PCR. Även om detta protokoll har utformats för HDL, har det stor användbarhet i kvantifiera sRNAs på andra lipoproteiner, inklusive LDL och VLDL, baserat på deras densiteter och storlekar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | Optima XPN-80 |
| Ultracentrifuge Rotor | Beckman Coulter | 331362 | SW-41Ti |
| AKTA Pure FPLC System | GE Healthcare | 29018224 | |
| 3x FPLC Superdex 200 Increase Columns In-line | GE Healthcare | 28990944 | 10/300 gl |
| SynergyMx | BioTek Instruments | 7191000 | |
| Tabletop centrifuge | Thermo Scientific | 75004525 | Sorvall ST40R |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 22629867 | 5417R (purchased through USA Scientific) |
| Microfuge | USA Scientific | 2631-0006 | |
| PippenPrep | Sage Science | PIP0001 | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2938B | |
| High Sensitivity DNA Assay | Agilent | 5067-4626 | |
| Sequencing Library qPCR Quantification Kit | Illumina | SY-930-1010 | |
| ProFlex Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4484073 | |
| QuantStudio 12k Flex | Applied Biosystems | 4471134 | |
| EpMotion Robot | Eppendorf | 960000111 | 5070 |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344059 | |
| Potassium Bromide | Fisher Chemicals | P205-500 | |
| 15 mL conical tube | Thermo Scientific | 339650 | |
| Micro-centrifugal filters 0.45 µm | Millipore | UFC30HV00 | |
| Micro-centrifugal filters 0.22 µm | Millipore | UFC30GV00 | |
| miRNAEasy Total RNA Isolation Kits | Qiagen | 217004 | |
| Total Cholesterol colormetric kit | Cliniqa (Raichem) | R80035 | |
| 10,000 m.w. cut-off centrifugation filter | Amicon | UFC801024 | purchased through Millipore |
| PCR strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | purchased through Fisher |
| microRNA RT kit | Life Technologies | 4366597 | For 1000 reactions |
| PCR master mix | Life Technologies | 4440041 | 50 mL bottle |
| Pierce BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Clean and Concentrator Kit | Zymo | D4014 | |
| Dialysis tubing | Spectrum Labs | 132118 | purchased through Fisher |
| bcl2fastq2 | Illumina | n/a | Software |
| Cutadapt | https://github.com/marcelm/cutadapt | n/a | Software |
| NGSPERL | github.com/shengqh/ngsperl | n/a | Software |
| CQSTools | github.com/shengqh/CQS.Tools | n/a | Software |
| Bowtie 1.1.2 | http://bowtie-bio.sourceforge.net | n/a | Software |
| GeneSpringGX13.1.1 | Agilent | n/a | Software |
References
- Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
- Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
- Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
- Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
- Smith, P. K., et al.
- Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8 (2014).
- Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
- Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
- Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164 (2015).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
- Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
- Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
- Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
- Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
- Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
- McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145 (2011).
- Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
- Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360 (2008).
- Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
- Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
- Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
- Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
- Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533 (2015).
