Methodenartikel

Isolierung von Lipoproteinen hoher Dichte für Non-coding Small RNA Quantification

DOI:

10.3791/54488

⸱

28. November 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Quantifizierung von kleinen RNAs mit hohem Dichtheits-Lipoprotein.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Vielfalt der kleinen nicht-kodierenden RNAs (sRNA) ist schnell wachsenden und ihre Rollen in biologischen Prozessen, einschließlich der Genregulation, entstehen. Interessanterweise sRNAs werden auch außerhalb der Zellen und sind stabil in allen biologischen Flüssigkeiten gefunden. Als solche stellen extrazelluläre sRNAs eine neue Klasse von Krankheits Biomarkern und werden in Zellsignalisierung und interzellulare Kommunikationsnetze wahrscheinlich beteiligt. Ihr Potenzial als Biomarker beurteilen kann sRNAs im Plasma, Urin und anderen Flüssigkeiten quantitativ bestimmt werden. Dennoch vollständig die Wirkung von extrazellulärem sRNAs als endokrine Signale zu verstehen, ist es wichtig , zu bestimmen , welche Ladungsträger zu transportieren und sie in biologischen Flüssigkeiten (zB Plasma) zu schützen, das Zellen und Gewebe zu extrazellulärem sRNA Pools tragen und Zellen und Gewebe fähig des Annehmens und der extrazellulären sRNA verwendet. Um das zu erreichen, diese Ziele ist es entscheidend, hochreine Populationen von extrazellulären Träger zu isolierenfür sRNA Profilierung und Quantifizierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass Lipoproteine, insbesondere Lipoproteine ​​hoher Dichte (HDL), transportiert funktionelle mikroRNAs (miRNAs) zwischen Zellen und HDL-miRNAs sind Krankheit signifikant verändert. Hier Detail, das wir ein neues Protokoll, das Tandem-HDL-Isolierung mit Dichte-Ultrazentrifugation (DGUC) und Fast-Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) verwendet zu erhalten hochreine HDL für Downstream-Profilierung und Quantifizierung aller sRNAs, einschließlich miRNAs, die beide hoch mit -throughput Sequenzierung und Real-Time-PCR-Ansätze. Dieses Protokoll wird eine wertvolle Ressource für die Untersuchung von sRNAs auf HDL sein.

Einleitung

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Die extrazelluläre nicht-kodierende kleine RNAs (sRNAs) stellen eine neue Klasse von Krankheit Biomarker und potentielle therapeutische Targets und wahrscheinlich erleichtern Zell-zu-Zell - Kommunikation 1. Die am häufigsten untersuchten Typ von sRNA sind Mikro - RNAs (miRNAs) , die etwa 22 nts lang sind und aus längeren Vorläuferformen und primären Transkripte 2 verarbeitet. miRNAs wurden posttranskriptionell demonstriert die Genexpression durch Unterdrückung der Proteintranslation und die Induktion von mRNA - Abbau 2 regulieren. Dennoch sind miRNAs nur eine von vielen Arten von sRNAs; wie sRNAs kann von den Eltern tRNAs (tRNA-derived sRNAs, TDR), small nuclear RNAs (sRNA-derived sRNAs, sndRNA), kleine nucleolar RNAs (snoRNA abgeleitete sRNAs, snRNA), ribosomale RNAs (rRNA-abgeleitete sRNAs gespalten werden, RDR ), Y RNAs (yDR) und verschiedene andere RNAs 1. Einige Beispiele dieser neuartigen sRNAs wurden berichtet miRNAs ähnlich zu funktionieren; jedoch die biologische funktionen vieler dieser bleibt sRNAs bestimmt werden, obwohl Rollen in Genregulation 3-6 wahrscheinlich sind. Interessanterweise sind miRNAs und andere sRNAs stabil in extrazellulären Flüssigkeiten, einschließlich Speichel, Plasma, Urin und Galle. Extrazellulärem sRNAs wahrscheinlich von RNasen durch ihre Assoziation mit extrazellulären Vesikeln (EV), Lipoproteine ​​und / oder extrazellulären Ribonukleoprotein-Komplexe geschützt.

Zuvor haben wir berichtet , dass Lipoproteine, nämlich High-Density - Lipoproteine (HDL), Transport miRNAs in Plasma 7. In dieser Studie wurden HDL unter Verwendung einer sequenziellen Methode der Dichte-Gradienten-Ultrazentrifugation (DGUC) isoliert, schnell-Protein-Flüssigchromatographie (Grßenausschlußchromatographie Gelfiltration, FPLC) und Affinitätschromatographie (anti-Apolipoprotein AI (ApoA-I) Immunpräzipitation 7). Mit beiden real-time PCR-basierten Low-Density-Arrays und einzelne miRNA-Assays wurden miRNA Ebenen auf HDL quantifiziert isoliert von heilendeine und hypercholesterolemic Themen 7. Mit diesem Ansatz konnten wir miRNAs zu profilieren und spezifischen miRNAs in hochreiner HDL Vorbereitungen zu quantifizieren. Seit 2011 haben wir festgestellt, dass, obwohl die Affinitätschromatographie HDL Reinheit verbessert, Antikörpersättigung Ausbeute stark begrenzt und kann kostspielig sein. Derzeit empfiehlt unser Protokoll einen zweistufigen sequentiellen Tandemverfahren DGUC durch FPLC gefolgt, die auch hochwertige HDL Proben für Downstream-RNA-Isolierung und Quantifizierung sRNA erzeugt. Aufgrund der jüngsten Fortschritte in der Hochdurchsatz - Sequenzierung von sRNAs (sRNAseq), zB miRNAs, und das erhöhte Bewusstsein für andere nicht-miRNA sRNA Klassen ist sRNAseq die aktuellen State-of-the-art in miRNA und sRNA Profilierung. Als solches unser Protokoll empfiehlt miRNAs und andere sRNAs auf HDL-Proben unter Verwendung von sRNAseq zu quantifizieren. Dennoch kann Gesamt-RNA aus HDL isoliert auch einzelne miRNAs und andere sRNAs oder validieren sRNAseq Ergebnisse mit real-time PCR eine Quantifizierung verwendet werdenpproaches. Hier beschreiben wir ausführlich ein Protokoll für die Erfassung, Reinigung, Quantifizierung, Datenanalyse und Validierung von hochreinem HDL-sRNAs.

Das übergeordnete Ziel dieser Arbeit ist es, die Machbarkeit und den Prozess der sRNA Quantifizierung in hochreiner HDL aus menschlichem Plasma isoliert zu demonstrieren.

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Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HDL Reinigung (~ 5,5 Tage)

  1. Density-Ultrazentrifugation (DGUC, ~ 5 Tage)
    1. In 90 ul 100x Anti-Oxidantien zu 9 ml Plasma isoliert aus frischem venösen Blut.
    2. Einstellen Plasmadichte mit KBr von 1,006 g / ml bis 1,025 g / ml durch Zugabe von 0,251 g KBr bis 9 ml Plasma aus Schritt 1.1.1 (0,0278 g / ml KBr Plasma). Schaukeln Sie das Plasma, bis alle das Salz bei Raumtemperatur aufgelöst ist, und Rohre zu Ultracentrifuge und sicherzustellen, dass alle Blasen nach oben steigen.
    3. Biegen Sie die Spitze eines 18-G-Nadel auf 90 ° 1 cm von der Spitze, mit Blick auf Kegel Seite nach oben. Unter Verwendung einer Spritze und die 18-Gauge - Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 1 über die Plasma (Tabelle 1).
      HINWEIS: Die gebogene Nadel sorgt für all die VLDL / IDL, LDL und HDL mit dem Overlay entfernt werden ohne Mischen.
    4. Entfernen Sie die Mehrheit der Blasen an der Spitze, so dass 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres und carefully Die Röhrchen in SW-40Ti Eimer.
    5. Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer (Eimer + cap) Balance: # 1 bis # 4, # 2 bis # 5 und # 3 bis # 6.
      Hinweis: Diese Eimer müssen jederzeit ausgeglichen und abgestimmt sein.
    6. Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse.
    7. Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
    8. Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage einer Spritze und gebogenen Nadel. Dies wird die VLDL / IDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C.
    9. die VLDL / IDL-Fraktion, sammeln die restlichen 7 mL Probe (Plasma) und legen Sie es in eine 15 ml konischen Röhrchen Nach dem Entfernen. Bringen Sie das Volumen der Probe bis zu 9 ml mit Overlay - Lösung # 2 (Tabelle 1).
    10. Stellen Sie die Probendichte von 1,025 g / ml bis 1,080 g / ml mit KBr mitca. 0.746 g KBr in 9 ml Probe oder 0,0828 g / ml KBr Probe. Schütteln Sie die Probe, bis das gesamte KBr gelöst (ca. 20 min) und das Übertragungsrohr zu Ultracentrifuge während sichergestellt Blasen nach oben steigen.
    11. Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 3 über die Probe (Tabelle 1). Lassen Sie 2 - 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres.
    12. Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen am oberen Ende des Rohres und legen Sie sorgfältig die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer.
    13. Wiegen jeder Eimer (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe balancieren, wie in 1.1.5.
    14. Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 24 h bei 4 ° C mit einem # 4 Zwischenbremse.
    15. Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
    16. Entfernen Sie vorsichtig 2 ml aus der oberen Schicht der Auflage unter Verwendung einer Spritze und seinnt Nadel. Dies wird die LDL-Fraktion sein, die bei 4 gelagert werden kann -80 ° C oder ° C.
    17. Nach der LDL-Fraktion zu entfernen, sammeln die verbleibenden annähernd 7 ml Probe (Plasma) und legen Sie sie in ein neues 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie das Volumen der Probe (Plasma) bis zu 9 ml mit 1,080 g / ml - Lösung # 4 (Tabelle 1).
    18. Stellen Sie die Probendichte von 1,080 g / ml bis 1,30 g / ml KBr unter Verwendung 3,33 g KBr in 9 ml Probe (Plasma) oder 0,37 g KBr pro ml Probe. Rock oder leicht die Probe rühren, bis das gesamte KBr (Salz) aufgelöst ist, und Rohr Ultracentrifuge.
    19. Mit Spritze und Nadel, legen Sie vorsichtig 3 ml Overlay - Lösung # 5 über die Probe (Tabelle 1).
    20. Entfernen Sie die Mehrheit der verbleibenden Blasen an der Spitze des Rohres, 2- 3 mm Abstand Meniskus an die Spitze des Rohres zu verlassen und sorgfältig legen die gefüllten Ultra Rohre in SW-40Ti Eimer.
    21. Wiegen Sie jede Schaufel (mit den Kappen) auf die Waage, und genau mit dem anderen Eimer + Kappe, wie in 1.1.5 balancieren.
    22. Platzieren Rotor in Ultrazentrifuge (siehe Materialliste). Zentrifuge bei 274.400 xg für 48 h bei 4 ° C mit einem # 4 Bremse.
    23. Entfernen Sie vorsichtig Eimer aus Rotor und die Rohre aus Eimern.
    24. Entfernen Sie vorsichtig mit einer Spritze und verbogene Nadel ca. 2 ml aus der oberen Schicht des Overlays verwenden. Dies ist der HDL-Fraktion, die bei 4 ° C oder -80 ° C gelagert werden kann.
      HINWEIS: Nach DGUC HDL kann die Hochsalzlösungen zu entfernen dialysiert werden.
    25. Um dialysiere, legen Sie die gesammelten HDL-Fraktion in einem verschlossenen Dialysehülse (10.000 MW cut-off) und über Nacht in 1 L 1x PBS dialysiert. Ändern Dialysepuffer (1x PBS) 3-mal mehr als 24 Stunden. Sanfte Störung des PBS mit einem magnetischen Rührstab wird die Dialyse zu verbessern.
    26. Bestimmung der Proteinkonzentration des DGUC-HDL 8 ein BCA - Methode.
  2. Schnell-Protein Liquid Chrographie (FPLC) oder Grßenausschlußchromatographie (~ 6 h)
    1. Filter 1,2 mg DGUC-HDL (Gesamtprotein) in 500 & mgr; l durch einen 0,22 & mgr; m Mikrozentrifugenfilter (siehe Liste der Materialien), unmittelbar vor der Injektion.
      HINWEIS: Eine zusätzliche Filterung des DGUC-HDL Probe durch ein 0,45 um-Mikrozentrifugenfilter vor dem 0,22 um-Filter kann für einige Proben erforderlich sein.
    2. Sammeln Sie die gefilterten DGUC-HDL-Probe, laden Sie die FPLC (Füllung) Injektionsspritze, und sicherzustellen, dass keine Luftblasen in der Spritze sind, bevor sie in die FPLC injiziert wird.
    3. Stellen Sie die FPLC Flussrate auf 0,3 ml / min bei einer Druckgrenze bei 2,6 MPa. Äquilibrieren Säulen mit 0,2 Säulenvolumen (ca. 15 ml) der Puffer vor Injektion abzutasten. Injizieren Sie die Probe mit 3 ml Puffer in die FPLC (Injektionsschleife) Instrument und den Lauf starten. Sammeln 1,5-ml-Fraktionen für insgesamt 72 Fraktionen.

2. Hochdurchsatz-Small RNASequenzierung (sRNAseq, ~ 9 Tage)

  1. RNA - Isolierung (~ 1 Tag)
    1. Identifizieren der FPLC-Fraktionen DGUC-HDL entspricht, die von Gesamt-Cholesterinspiegel Bestimmen eines kolorimetrischen Kits nach den Anweisungen des Herstellers. Mit dieser FPLC Set-up, erwarten zu finden 6 - 7 FPLC Fraktionen, die DGUC-HDL.
    2. Sammle alle Volumen (ca. 8 -1 0 ml Pool von 1,45 ml Fraktionsvolumina) von DGUC-HDL FPLC-Fraktionen und konzentriere unter Verwendung von 10 kDa MG Rückhalte Zentrifugalfilter Einheiten bei 4.000 × g für 1 h bei 4 ° C oder bis HDL Konzentrat beträgt etwa 100 & mgr; l.
    3. Sammeln Sie die HDL - Konzentrat und quantifizieren HDL Gesamtproteinkonzentration 8 der BCA - Methode.
    4. Bestimmen die höchste Konzentration an HDL Gesamtprotein, bis zu 1 mg, die aus jeder Probe in dem Satz aliquotiert werden kann. B. Isolierung für jede Probe RNA aus der gleichen Menge an HDL Gesamtprotein.
    5. Führen RNA-Isolierung verwendetein modifiziertes Protokoll (siehe Liste der Materialien).
      1. In 10x Volumen Phenol Lysereagenz (siehe Liste der Materialien) Probe und Vortex für 1 min.
      2. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
      3. In Chloroform (20% Reagenz Volumen in Schritt 2.1.5.1 verwendet Phenol Lyse) und kräftig schütteln, 15 s.
      4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 - 3 min.
      5. Zentrifuge für 15 min bei 12.000 × g bei 4 ° C in einer Kühlzentrifuge.
      6. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein neues Röhrchen, die Vermeidung der Interphase.
      7. Hinzufügen 1,5x Volumen von 100% Ethanol zu der wässrigen Phase und vortex für 1 min.
      8. Store Proben für mindestens 1 h oder über Nacht bei -80 ° C.
      9. Fahren Sie mit dem RNA-Isolierung Protokoll der mitgelieferten Mini-Spalten verwenden.
      10. Eluieren mit 30 & mgr; l RNase-freiem H 2 O. Erste hinzuzufügen 15 ul H 2 O direkt auf die Fritte, Schleudern bei niedriger Geschwindigkeit (2000 × g) für 2 min, undSpin dann bei hoher Geschwindigkeit (max) für 1 min. Wiederholen Sie diesen Schritt mit zusätzlichen 15 & mgr; l H 2 O
    6. Fahren Sie direkt mit sRNA Bibliothek Generation oder bei -80 ° C.
  2. Bibliothek Generation (~ 6 h)
    1. Bereiten Sie sRNA cDNA-Bibliotheken, die sRNA Bibliothek Generation Kit-Protokoll, als den Anweisungen des Herstellers mit einer Modifikation der PCR-Amplifikation wie nachfolgend beschrieben.
      1. Bereiten Sie die PCR - Mastermix auf Eis mit 0,5 ul DNase / RNase-freiem H 2 O, 15 & mgr; l PCR - Mix (PML) und 1 & mgr; l RNA - PCR - Primer (RP1) pro Probe (einen zusätzlichen 10% zum Pipettieren Fehler).
      2. In 16,5 ul der PCR-Mix zu jedem (cDNA) Probe.
      3. einen Index / Barcode-Nummer zu jeder Probe zum Multiplexen zuweisen und 1 & mgr; l PCR Primer Index (auf die entsprechende Nummer) zu der Probe hinzuzufügen.
      4. Führen Sie eine schnelle Drehung der Mikrofuge verwenden.
        HINWEIS: Das Gesamtvolumen solltejetzt 30 ul pro Probe sein.
      5. Führen Sie die Zyklusbedingungen für die PCR - Amplifikation wie in den Tabellen 2 und 3 aufgeführt.
  3. Größe auswählen sRNA - Bibliothek zu entfernen Adapter: Adapter (~ 1,5 h)
    1. Führen Sie Größe der Bibliothek-Auswahl unter Verwendung einer automatischen DNA-Größenwähler gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden Größenparameter: Ziel: 156 bp, Beginn: 135 bp, Ende: 177 bp, Bereich Flag: Breit.
  4. DNA Clean Up (~ 0,5 h)
    1. Clean up größenselektierten sRNA cDNA gemäß den Anweisungen des Herstellers.
    2. Eluieren sauber und konzentriert sRNA cDNA mit 2 x 7 ul DNase / RNase-freiem H 2 O.
  5. Quantifizieren und Beurteilen sRNA cDNA - Bibliothek Ertrag und Qualität (~ 1 h)
    1. Beurteilen Sie sRNA cDNA-Bibliothek Qualität und Größe unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Chip auf einem Bioanalyzer (Materialliste) gemäß manufacturer Anweisungen.
    2. Quantifizieren der einzelnen sRNA cDNA-Bank-Konzentrationen unter Verwendung eines hochempfindlichen DNA-Test (Materialliste), gemäß den Anweisungen des Herstellers.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, alle Proben mit unterschiedlichen Indizes haben auf der gleichen Spur der Flusszelle, wenn möglich ausgeführt werden. Wenn mehr als eine Spur erforderlich ist, mischen Fall und Kontrollproben geeignet.
  6. Hochdurchsatz - Sequenzierung sRNA (~ 7 Tage)
    1. Pool einzelne indiziert sRNA Bibliotheken basierend auf äquimolare Konzentrationen.
    2. Bildschirm gepoolt sRNA Bibliotheken für Qualität mit hoher Empfindlichkeit DNA-Chip auf der Bioanalyzer und bestimmen Bibliothek DNA-Konzentration wie in 2.5.1 - 2.5.2.
    3. Führen quantitative PCR (qPCR) des Adapters geeignete Inhalte Sequenzierungstiefe mit Hilfe der Sequenzierung Bibliothek qPCR Quantifizierung Kit, um sicherzustellen, laut Herstellerangaben (Materialliste).
    4. Führen Sie die Sequenzierung eines einzelnen Lese verwenden, 50 b25 M liest / Probe, gemäß den Anweisungen des Herstellers - p-Protokoll eine Tiefe von etwa 20 zu erreichen.

3. Datenanalyse (~ 1 Tag)

  1. Verwenden Sie bcl2fastq2, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen vorverarbeiten rohen fastq Dateien von demultiplexten Proben (Materialliste).
  2. Verwenden Sie Cutadapt zu trimmen Adapter 9 und entfernen Sie liest <16 Nukleotiden (nts) in der Länge, wie pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste).
  3. Entfernen Kontamination Sequenzen, die in den sRNA Bibliotheken, einschließlich Stop-Lösung Sequenz (STP: CCACGTTCCCGTGG) und Adapter Übertrag (CTACAGTCCGACGATC) mit removeSequenceInFastq Funktion in NGSPERL Rahmen, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
  4. Führen Sie die Qualitätskontrolle Metriken von FastQC mit Center for Quantitative Sciences (CQS) Werkzeuge, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
  5. Generieren Sie nicht redundante Liste der "identisch" liest (Zusammenbruch redundant liest) und Zahlen Rekordkopie CQSTools, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
  6. Richten Sie liest menschlichen Genoms Bowtie1.1.2 ermöglicht ein Mismatch (Optionen: -a -m 100 --bester --strata -v 1), pro Benutzerhandbuch Anweisungen (Materialliste).
  7. Führen Sie lesen Ausrichtung, Zählen, und führen Verdichtungsaufgaben mit NGSPERL, gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen.
  8. Konvertieren Sie exportierte Zählung Tabelle in ein Tabellenkalkulationsdatei.
  9. Normalisieren liest einer bestimmten Klasse (zB miRNAs) zur Gesamtzahl der für diese Klasse lautet (zB Gesamtzahl der miRNAs liest) und Bericht - Signale als Lesevorgänge pro Mapped miRNA (RPMM). (ZB RPMM = (miR-X / Gesamtanzahl von miRNA liest) * 1.000.000).
  10. Eingang normalisiert Zählung Tabelle als generische einzelne Farbtechnologie in Software für Low-Level-und High-Level-Differenzanalysen gemäß Bedienungsanleitung Anweisungen (Materialliste).
    HINWEIS: Zur Zeit gibt es keine gut charakterisierten Housekeeping-Gene / SRNWie für HDL-sRNA. Ein Spike-Kontrolle kann verwendet werden, kann aber problematisch sein. Normalisieren zum Gesamtprotein Eingang oder Volumen wird empfohlen, HDL. Am wichtigsten ist, ist es empfehlenswert, Sequenzierungsergebnisse von einem der verschiedenen Strategien zur Validierung miRNAs und sRNAs mittels real-time PCR oder quantitative PCR quantifiziert werden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll ist eine Reihe von etablierten Methoden miteinander verbunden sind für die Quantifizierung von sRNAs auf hochreine HDL durch Hochdurchsatz - Sequenzierung oder Echtzeit - PCR (1) zu ermöglichen. Um die Machbarkeit und die Auswirkungen dieses Protokoll zeigen, HDL wurde aus Humanplasma durch das Tandem DGUC und FPLC-Methode gereinigt. Collected FPLC-Fraktionen zu HDL (von Cholesterinverteilung) wurden konzentriert, und Gesamt-RNA wurde aus 1 mg von HDL (G...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieses Protokoll wurde entwickelt miRNAs und andere sRNAs durch Hochdurchsatz-Sequenzierung oder Real-Time PCR auf hochreines HDL zu quantifizieren. Wie bei jedem Ansatz sollte besondere Überlegungen zu jedem Schritt in dem Verfahren zur Reinigung von HDL und RNA und dann sRNAs Quantifizieren gegeben werden. Dieses Protokoll wird für Projekte mit ≥ 2 ml Plasma gestartet wird. Dennoch können qualitativ hochwertige RNA Analysen erfolgreich mit HDL von so wenig wie 80 & mgr; l des menschlichen oder Maus-Plasma unter Ve...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde durch Auszeichnungen der National Institutes of Health, des National Heart, Lung and Blood Institute an K.C.V. HL128996, HL113039 und HL116263 unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch Auszeichnungen der American Heart Association an K.C.V. CSA2066001, D.L.M POST26630003 und R.M.A. POST25710170 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ultrazentrifuge Beckman CoulterA99839Optima XPN-80
Ultrazentrifuge RotorBeckman Coulter331362SW-41Ti
AKTA Pure FPLC SystemGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 Erhöhung der Säulen InlineGE Healthcare2899094410/300
gl SynergyMxBioTek Instruments7191000
Tischgerät ZentrifugeThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
KühlzentrifugeEppendorf226298675417R (gekauft über USA Scientific)
Mikrofuge USA Scientific2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 Bioanalysator AgilentG2938B
Hochempfindlicher DNA-AssayAgilent5067-4626
Sequenzierungsbibliothek qPCR-QuantifizierungskitIlluminaSY-930-1010
ProFlex ThermocyclerAngewandte Biosysteme4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RoboterEppendorf9600001115070
Ultra-klare ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter344059
KaliumbromidFisher ChemicalsP205-500
15 mL konisches RöhrchenThermo Scientific339650
Mikrozentrifugalfilter 0,45 & Mikrozentrifugalfilter mMilliporeUFC30HV00
Mikrozentrifugalfilter 0,22 & Mikro; mMilliporeUFC30GV00
miRNAEasy Total RNA Isolation KitsQiagen217004
Total Cholesterol Colormetric KitCliniqa (Raichem)R80035
10.000 m.w. Cut-off-ZentrifugationsfilterAmiconUFC801024gekauft über Millipore
PCR-StreifenröhrchenAxygenPCR-0208-Cgekauft über Fisher
microRNA RT-KitLife Technologies4366597Für 1000 Reaktionen
PCR-MastermixLife Technologies444004150-ml-Flasche
Pierce BCA-KitThermo Scientific23225
Reinigungs- und Konzentrator-KitZymoD4014
DialyseschlauchSpectrum Labs132118über Fisher erworben
bcl2fastq2Illuminan/aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptn/aSoftware
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperln/aSoftware
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.Toolsn/aSoftware
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netn/aSoftware
GeneSpringGX13.1.1Agilentn/aSoftware

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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