Introduction
Nükleer genomu yanı sıra, her ökaryotik hücre de mitokondrial matriks küçük dairesel DNA kopya binlerce içerir. Mitokondriyal DNA (mtDNA) elektron taşıma zincirinin temel alt birimleri kodlar da, çoğaltma ve mtDNA'nın transkripsiyonu için tüm faktörler de dahil olmak üzere mitokondriyal proteom çoğunluğu, nükleer genom tarafından kodlanır. kalıtım Mendel yasaları takip nükleer genom aksine, hayvan mitokondriyal genom anne soyu ile münhasıran kalıtsaldır. Bu nedenle, mtDNA çoğaldı ve kadın oosit yoluyla bir nesilden nasıl iletildiğini anlamak temelde önemlidir. Ancak, mtDNA çoğaltma kadın germline düzenlenmiştir nasıl üzerinde devam eden tartışmalar vardır. Ayrıca, mtDNA iletimi için yaygın olarak kabul mtDNA darboğaz teorisi primordial germ hücrelerinden mtDNA'nın nüfus nispeten az sayıda durin için alt örneklendirilmiştir olduğunu göstermektedirg geliştirme 1 2. Ayrıca mtDNA çoğaltma geçici ve oogenez boyunca uzaysal olarak düzenlenmiş olduğunu ima eder. Bu nedenle, tohum çizgisi gelişimi sırasında mtDNA replikasyon yerinde tespit mtDNA miras mekanizmasının anlaşılması kolaylaştıracaktır.
Drosophila oogenesis mtDNA çoğaltma ve iletim incelemek için bir genetik uysal bir sistem sağlar. İki Drosophila yumurtalıkların her birinde, yumurta üretiminin işlevsel birimler olan ovaryolden 3 olarak adlandırılan yumurta odaları 16-20 bağımsız dizeleri, (Şekil 1A bakınız) vardır. Her bir ovaryol ön uç germarium denilen bir yapı oluşur oogenez, ilerici bir doğrusal organizasyonunu içerir. germarium daha farklı gelişim aşamalarında germ hücreleri içeren dört bölgeye ayrılmıştır. Bölgede 1, germ kök hücreler c olarak bilinen kızı hücreleri üretmek için asimetrik bölünme yoluyla gitmekystoblasts. Bölge 2a nihai bölünme tamamlayan cystoblasts içerir. Cystoblasts bölümü üreten 16-hücre gruplarının dört mermi uğrarlar. 16 hücreleri halka kanalları denilen sitoplazmik köprülerle birbirine bağlı kalır. Diğer 15 polyploid hemşire hücreler olarak geliştirmek ise sadece hücre biri, oosit olarak farklılaşma taahhüt eder. Fusome olarak bilinen önemli bir sitoplazmik yapısı, halka kanalların oluşumu ile kolaylaştırmak kist polarite ve hemşire hücre oosit etkileşimleri 4,5 belirlemek için önerilmektedir. kistler bölge 2b doğru ilerlerken, kist yapıları germarium tüm genişliği boyunca ve daha folikül hücreleri ile ilişkili hale gelir. germarium yapıları ilk tomurcuklanan yumurta odasını içeren bölge 3 ile sona erer. Daha sonra, yumurta odaları 14 morfolojik farklı aşamalarında ovaryol yoluyla ilerleme germarium, arka ucunda monte edilir. oosit büyüme, WH hemşire hücreleri bağlıdırich taşıyıcı proteinler, mRNA ve oosit içine halka kanallarla hücreiçi yapılar (örneğin, Golgi). Drosophila oogenez sırasında, her 16 hücre kist içinde mitokondri bir kısmı fusome ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir, halka kanallarından taşındı ve Balbiani gövdesi 6 olarak adlandırılan büyük bir kitle tek oosit içine teslim edildi. Bu olgu kadın yumurtalıkların yoluyla mitokondriyal kalıtım kalite kontrolüne katkıda önerilmiştir.
mtDNA sentezi algılama hücresel DNA'ya işaretli DNA öncülerinin dahil dayanır. Geleneksel olarak, timidin, 5-bromo-2'-deoksiüridin bir nükleosit analoğunun (BrdU), doku kültürü hücreleri 7,8 mtDNA çoğaltma etiketlemek için kullanıldı. Ancak, antikor bazlı BrdU etiketleme özellikle tüm montaj doku boyama, çeşitli sınırlamalar sergiler. BrdU etiketleme bir büyük dezavantajı ortaya çıkarmak için, DNA denatürasyon gerektirmesidirBrdU epitopu, anti-BrdU antikoru ile tespit edilebilir, böylece. Numune, numune yapısını bozar ve boyamanın ardından, Yöntem 9 karmaşıklaştırır gibi kimyasal maddeler (örneğin, hidroklorik asit ya da metanol ve asetik asit karışımı) DNaz ile, ısı ya da sindirim gibi sert denatüre edici şartlar altında muamele edilecek olan 10.
Burada, alternatif bir timidin analog 5-etinil-2'-deoksiüridin (edu), Drosophila ergin yumurtalıklarda replike mitokondriyal DNA etiketlemek için kullanılır. Bu yöntem daha hızlı ve son derece hassastır. Edu hali hazırda DNA replikasyonu sırasında hücresel DNA'ya dahil edilir. Aşağıdaki algılama bir "klik" reaksiyona dayanır, bir Cu (I) 'e, terminal alkin grubu ve bir flüoresan azid 10 ile kovalent reaksiyona, paladyum. Reaksiyon numunenin denatürasyon gerektirmez, çünkü iyi yapısal koruma sağlar. Boya a Ayrıca, boyutzide yalnızca 1/500 tüm montaj dokuların hızlı ve etkili nüfuz eder ve bir antikor molekülünün 10, bu göstermektedir. Biz Drosophila oogenez sırasında mtDNA çoğaltma tespit etmek için bu yöntem kullanılır ve bir çoğaltma bağımlı mtDNA'sının seçici kalıtım mekanizması önermektir bize yol Drosophila yumurtalık 11 germarium bölgede çarpıcı bir mekansal desen, bulduk. Biz burada Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma edu etiketlenmesi konusunda ayrıntılı bir protokol mevcut. (: Col T300I mt) 11, yanı sıra potansiyel mitokondriyal membran dağıtmak ve potansiyel mtDNA çoğaltma bozmak mitokondriyal eşleşmeyenler, farklı tedavi protokolünün uygulanmasını göstermek için, biz de mtDNA bir mtDNA mutant Drosophila çoğaltma test edilmiştir.
Protocol
1. Doku Toplama ve Diseksiyon
- kuru maya içeren her flakon, kültür 10 yetişkin dişi 2-3 gün 10 erkek ile uçar.
Not: besili erkek sineklerin bakımı genel kalitesini ve yumurtalık verimini artırmak ve diseksiyon kolaylaştıracaktır. - Kadın bir karbondioksit (CO 2) pad sinek uçar uyutmak.
- Stereoskop altında RT ortamı bir kesme yastığı (% 10 fetal bovin serumu (FBS) ile desteklenmiş Schneider Drosophila ortamı) birkaç damla yerleştirin. canlı ve sağlıklı dokuları korumak için orta tüm diseksiyon işlemleri yürütmek.
- Bir besili kadın alt toraks keskin ince burunlu forseps ile uçmak tut. Karında dokular maruz kadar sinek aşırı posterior hafifçe römorkör forseps başka bir set kullanın. Diğer dokularda (örneğin bağırsaklar) iki yumurtalıklar ayırın.
Not: Her yumurtalık görüntüler oluşturma olan bir opak bir yapı16-20 ekli ovaryolden, d. - Reaktiflerin penetrasyonunu artırmak birbirinden çekerek ve birkaç kez ovaryol her arasında forseps ipuçları ileterek yumurtalıkların açın. Aşağıdaki işlemleri sırasında dokuların kaybını en aza indirmek için bir yumurtalık içinde bağlı ovaryolden tutun.
- % 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamında 500 ul ihtiva eden bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü hemen yumurtalıkların aktarın.
- diseksiyon tekrarlayın ve her mikrosantrifüj tüp 10-15 yumurtalıklar toplamak.
2. Edu Etiketleme
- Her bir tüp içinde orta aspire ve 7 uM afidikolin ihtiva eden,% 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamında 500 ul ile değiştirin.
Not: afidikolin mtDNA çoğaltma 7, 12 etkilemeden DNA polimerazı a'yı inhibe nükleer DNA sentezini engellemek için kullanılır. Afidikolin konsantrasyonunu kadar arttırmak mümkündür70 uM daha inhibisyonunu elde etmek için. DMSO içinde 3-30 mM aphidicolin stok çözeltisi en fazla 6 hafta -20 ° C'de karanlıkta saklanabilir. - orta değiştirirken onlar çözümleri altındaki batırma emin olun, sağlıklı yumurtalıkların tutmak için. Adım 2.6 ile% 10 FBS ile Schneider Drosophila ortamı kullanın.
- yavaşça döndürülerek bir tezgah üstü rocker oda sıcaklığında 3 saat boyunca yumurtalıkları inkübe edin.
- Ilaç tedavisi, örneğin, mitokondriyal uncoupler karbonil siyanit 4-triflorometoksi fenilhidrazon (FCCP) için, afidikolin tedaviden 2 saat sonra ortam içine ilacın uygun bir konsantrasyona (örneğin, 10 uM FCCP) ekleyin. 1 saat daha inkübe devam edin.
- veya ilaçsız orta içeren aphidicolin çıkarın. Kısaca iki kez orta yumurtalıkların (afidikolin gerekli değildir) durulayın.
- 1 ml orta içeren 10 mM edu ve 7 mcM aphidicolin ekleyin ve incubatin devam2 st için oda sıcaklığında örn. -20 ° C'de (DMSO içinde), 10 mM stok çözeltisi edu saklayın.
- Edu ve aphidicolin içeren orta kaldırmak. 3 dakika her biri için iki kez (aphidicolin olmadan) orta ile yıkayın.
3. Doku Fiksasyon ve Permeabilization
- fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, pH 7.4) içinde% 4 paraformaldehit çözeltisi hazırlayın.
Not: önceden attı ampullerde saklanır ticari olarak temin edilebilen paraformaldehid kullanılmıştır. Yeni bir ampul açın ve kullanımdan önce% 4 sulandırmak.
DİKKAT: Formaldehit zehirlidir; cilt ve göz koruması ile bir davlumbaz ele alınmalıdır. - yavaşça döndürülerek oda sıcaklığında 20 dakika süreyle% 4 paraformaldehid ile yumurtalıkları düzeltildi.
- Fiksatif çıkarın ve 5 dakika, her seferinde, PBS içinde% 3 BSA, 1 ml iki kez yumurtalık yıkayın.
- dokuların geçirgenliği, yıkama solüsyonu çıkarın ve PBS içinde% 0.5 Triton X-100 1 ml. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- permeabilizasyon çözeltisini çıkarın ve 1 ml iki kez yıkayınPBS içinde% 3 BSA.
4. Edu Algılama
Not: edu algılama "klik" kimyası dayanan, bir Cu (I) 'in edu terminal alkin grubu flüoresan azidler ekler [3 + 2] siklo-13, paladyum, ve flüoresan molekülü daha sonra tespit edilebilmesi tabi tutulur. Kolayca katalitik olmayan Cu (II) türüne oksitlenir Cu (I), bu yana, reaksiyonu katalize etmek için gerekli olan, Cu (I) 'in elde edilmesi için in situ Cu (II) sülfat azaltılması önerilir. Bu Cu (II) sülfat, örneğin askorbik asit (bundan sonra "katkı maddesi" tampon) bakır oluşturmak için (I) 'in bir indirgeyici varlığında kullanılır vardır.
- Deneyden önce, (Alexa Fluor 488 azid, Alexa Fluor "dye azid" ahiret olarak adlandırılan tercih fluorofor bağlı olarak 555 azid veya başkaları,), Edu reaksiyon tamponu ve edu tampon katkı Alexa Fluor azidin çalışma çözeltisi hazırlamak üreticinin uyguntalimatlar.
- 70 ul DMSO içinde boya azid sulandırın. 1 yıla kadar -20 ° C de çalışan bir çözüm saklayın.
- deiyonize su ile 10x edu reaksiyon tamponu sulandırarak taze edu reaksiyon tamponu hazırlayın.
NOT: sonra, 4 ° C 'de kalan 1x çözelti saklayın. 1x çözeltisi en fazla 6 ay süreyle stabildir. - Tamamen su deiyonize 2 ml tozu eriterek edu tampon katkı 10x stok solüsyonu olun.
Not: Bu stok çözeltisi, 1 yıla kadar -20 ° C'de stabildir. Çözelti kahverengi bir renk oluşursa, o bozulmuş ve atılmalıdır.
- Taze her zaman edu reaksiyon kokteyl hazırlayın ve hazırlık 15 dakika içinde kullanın. tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, reaksiyon bileşenleri aynı oranda muhafaza emin olun.
- Taze 1x edu deiyonize su içinde (adım 4.1.3 hazırlandı) 10x stok çözeltisi 1:10 oranında seyreltilmesiyle ilave çözelti tampon sağlayın. Bu s kullanınAynı gün ların çözüme.
- Amacıyla aşağıdaki bileşenlerin bir araya EGT Reaksiyon kokteyli 1 ml hazırlayın: 860 ul 1x edu reaksiyon tamponu, 40 ul CuSO 4, 2.5 ul boya azid, 100 ul 1 x edu tamponu katkı maddesi.
Not: maddeler en iyi performansı sağlamak için ilave edilir önemlidir.
- % 3 BSA ile PBS çıkarın ve her bir tüpe edu Reaksiyon kokteyl 0.5 ilave edin. yavaşça döndürülerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. ışıktan koruyarak örnekleri tutun.
- Edu Reaksiyon kokteyl çıkarın ve PBS içinde% 3 BSA, 1 ml ile bir kez yıkanır.
- 1 ml PBS ile bir kez numune yıkanır.
5. Antikor etiketleme
Not: Edu boyamadan sonra antikor etiketleme yapın. hiçbir ek boyama isteniyorsa, biri doğrudan montaj ve görüntüleme geçebilirsiniz. Örnekler tüm işlemler ve ışıktan korunması önemlidir.
- yıkama solüsyonu çıkarın. 30 dakika boyunca PBS içinde% 0.2 BSA ve% 0.1 Triton X-100 ihtiva eden bloke çözeltisi 1 ml yumurtalık bloke eder.
- Engelleme çözüm çıkarın ve çözümü engelleme seyreltilmiş primer antikor (antikor α örneğin, fare ATP sentaz alt birimi, 1: 1000 seyreltme) ile değiştirin. 4 ° CO / N karanlıkta inkübe edin.
- Çözelti 3 kere 10 dakika her bloke 1 ml numune yıkanır. arka plan en aza indirmek için, 30 dakika her biri için iki kez daha yıkanır. Engelleme çözüm çıkarın.
- Oda sıcaklığında 2 saat boyunca (200 seyreltme, örneğin, keçi anti-fare Alexa Fluor 568 ikincil antikor, 1) çözeltisi engelleme seyreltilmiş sekonder antikor ile inkübe edin.
Not: Edu bağlanmış olandan farklı bir renk kullanın. - Adım 5.3 gerçekleştirilen yıkama adımları tekrarlayın.
- 1 ml PBS ile durulayın kez deterjanı çıkarmak için.
6. Montaj ve Görüntüleme
- Dikkatlice PBS ve imm kaldırmakediately 50 ul (veya DAPI olmadan) orta montaj yumurtalıkların kapsamaktadır.
Not: ovaryolden birbirinden ayrılır ise sertleşme olmayan bir montaj ortamı kullanın. Yumurtalıklar bir hafta kadar 4 ° C 'de, montaj ortamında saklanabilir. - Bir pipet ucunu kesin ve bir mikroskop lamı üzerine dikkatlice yumurtalıkların aktarmak için kullanabilirsiniz.
- stereomicroscope altında keskin ince burunlu forseps ile tamamen ayrı her ovaryol. arka ucunda ve sahne 14 veya olgun yumurta odalarındaki bağlantı dokuları çıkarın. Genç yumurta odaları ön ucunda ve şeffaf altındadır.
- birbirleri ile örtüşmeyen böylece forseps ile yumurta odaları aynı hizaya getirin.
- Yavaşça numune üstünde # 1.5 cam lamel indirin. montaj orta oda sıcaklığında birkaç saat boyunca polimerize olmaya bırakın. şeffaf tırnak cilası ile mühür.
- Görüntü görüntüleme öncesinde 4 ° C'de ertesi gün, ya da mağaza slaytlar.
- Konfokal mi altında görselleştirmekBir 63X yağ daldırma amacı ile croscope. üç boyutlu z yığınlarının görüntüler çekin.
Not: Edu epitel kılıf daha sonra aşamalı yumurta odaları ve arka plan floresan in sinyal güçlü vardır. Belirli bir germarium Edu etiketleme incelerken, bir tarafından üst üste ya da diğer dokularda veya daha sonra aşamalı yumurta odalarına yakın olan germariums kaçınmalısınız.
Representative Results
Yukarıdaki protokol Drosophila oogenez sırasında mitokondrial DNA replikasyonu göstermektedir mitokondri (Şekil 1B-C) ile ilişkili noktalı yapıların, görselleştirme sağlar. ATP sentaz alfa alt birimi (Şekil 2) için boyama ile işaretlenmiş mitokondri ile lokalize edu puncta. Gözlenen işaretler doğrulama, etidyum bromid 11 mtDNA çoğaltma 14 inhibitörü ile muamele edilmiş yumurtalıklarda mevcut olduğu bu puncta mtDNA.Aphidicolin mtDNA çoğaltma (Şekil 2) etkilemeden nükleer DNA boyama inhibe etmek için kullanılmıştır kopyalayan Gerçekten etiketi. Afidikolin tedavi olmadan, yoğun edu sinyalleri çekirdekleri etiket ve mtDNA puncta zorlukla (Şekil 3) tespit edildi. Bununla birlikte, aphidicolin mevcudiyetinde, nükleer dahil önemli ölçüde azalmıştır ve mitokondri ile ilgili birçok puncta gözlenmiştir.
(Şekil 1B) mtDNA çoğaltma yüksek düzeyde bulunmaktadır. Bununla birlikte, özellikle, mtDNA çoğaltma germarium bir uzamsal desen görüntülenir. Edu puncta sayısı ile belirtildiği gibi orada germarium bölgesinde 1 mtDNA replikasyon orta düzeyde olan, ancak neredeyse bölgesi 2A'da Resim edu dahil (Şekil 1C). Kist germarium bölge 2B aşağı hareket ettikçe, mtDNA çoğaltma devam ve bölge 2B arka kist edu puncta sayısı bölgesi 2A (Şekil 1C) içinde çok daha yüksek oldu. hu li tai Shao (HTS) proteini ile boyanmış Spesifik olarak, yoğun edu şirketleşme, halka kanalları ve fusome yapıların çevresinde yoğunlaştırıldı. mtDNA germarium bölgesinde 3'te yüksek bir seviyede replike tutulur (Şekil 1C)
Belir arasındaki ilişkiyi göstermek içinIC genler veya mitokondriyal DNA çoğalması ile muamele Drosophila yumurtalıkları gen manipülasyonu ya da ilaç tedavisi için tabi tutulabilir. Biz FCCP mitokondriyal membran potansiyelini dağıtır klasik mitokondriyal protonophore, farklı konsantrasyonları ile yumurtalıkları işlemden geçirildi. Bir kontrol olarak, DMSO mtDNA çoğaltma (Şekil 4A) üzerinde herhangi bir etki. FCCP yüksek dozda (10 uM) hemen hemen tamamen germarium (Şekil 4D) boyunca mtDNA çoğaltma tükenmiş. Bununla birlikte, FCCP (2 veya 5 mcM) alt konsantrasyon bölgeleri 2B ve 3 mitokondriyal bozulma karşı daha duyarlıdır düşündüren, bölgeler 2B ve 3 (Şekil 4B-C) bir bölgede 1 mtDNA çoğaltma küçük bir etkisi ama inhibe çoğaltma vardı, ya da onlar göreceli yavaş çoğaltma kinetiği korumak. Yukarıdaki sonuçlar, mitokondriyal DNA replikasyon mitokondriyal aktivite ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Özellikle germarium farklı bölgelerinde mitokondriyal imp farklı cevapairment.
Şekil 1. mtDNA Drosophila oogenez sırasında çoğaltma. Bir Drosophila ovaryol (A) Diyagram ve germarium büyütülmüş görünümü. Yumurta odaları, ardışık gelişim aşamalarını posterior doğru, anterior soldan ovaryol göstermektedir. germarium olarak, fusome (kırmızı), germ kök hücreler (mavi), mitokondri (yeşil), (konumlandırma, fusome yapısı ve mitokondriyal kümeleri tarafından tanınan kırık çizgi) gelecek oosit, kistler (şeftali) ve dört gelişim bölgeleri gelişmekte gösterilir . (B) HTS-RC, kanaldan ve fusome için bir marker karşı vahşi tip edu etiketli ovaryol antikorun Örnek z yığın projeksiyon. aphidicolin varlığında, Edu mtDNA (ok başları) ve çekirdekler (oklar) dahil edildi. Ölçek çubuğu, 10 mikron.(C) B kutulu bölgede özetlenen germaria arasında Büyütülmüş görünüm. Dört gelişim bölgeleri gösterilir. Ölçek çubuğu, 5 mikron 11. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Afidikolin tedavi ile edu dahil tarafından görüntülendi Drosophila germarium Şekil 2. mtDNA çoğaltma (A) -. (D) edu dahil edilmesini gösteren bir vahşi tip germarium Temsilcisi konfokal bölümü (yeşil, b) mitokondri, ATP Sentaz alfa alt birimi boyama ile işaretlenmiş DNA polimeraz-α inhibitörü aphidicolin ile ön inkübasyon DAPI lekelemesi (mavi, D) ile etiketlenmiş (kırmızı, C) ve çekirdekler. (A39. ;-D ')' de kutulu alanın büyütülmüş bir fotoğraf (A) edu birleşmesini (B gösteren '), mitokondri (C') ve çekirdekler (D '). aphidicolin varlığında, nükleer birleşme (oklar) azalır ve birçok puncta mitokondri (ok başları) içinde lokalize edildi. Ölçek çubukları, 10 um. Şekil 11'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. mtDNA çoğaltma ancak afidikolin muamelesi olmadan Drosophila germarium tespit edilir (A) -. (D) edu birleşme (yeşil) gösteren bir vahşi tip germarium temsili konfokal bölümü, mitokondri, işaretlenmişDNA polimeraz-α inhibitörü aphidicolin yokluğunda DAPI boyama (mavi) ile etiketlenmiş ATP Sentaz alfa alt birimi boyama (kırmızı) ve çekirdekler. (A'-D ') büyütülmüş (A) kutulu alanın görüntü edu birleşme (B gösteren'), mitokondri (C ') ve çekirdekler (D'). aphidicolin olmadan, yoğun edu sinyalleri etiket çekirdekleri (oklar) ve mtDNA puncta zorlukla tespit edildi. Ölçek çubukları, 10 um. Şekil 11'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Mitokondriyal uncoupler mtDNA çoğaltma bozar. Yabani tip germarium gösteren Temsilcisi z yığın projeleri DMSO ile tedavi(A) ya da 2 uM (B), 5 uM (C), edu birleştirme esnasında 10 uM (D) konsantrasyonlarda mitokondriyal uncoupler FCCP. 2 uM FCCP (B) ile muamele edilmiş bölüm 2b bozulmuş edu etiketleme Not ve bölgesi 2B ve 5 uM FCCP ile işlemden geçirildi, 3, hem de (kutular belirtilen). Dört gelişim bölgeleri gösterilmektedir. Oklar, nükleer DNA; ok uçları, mtDNA. Ölçek çubuğu, 10 mikron. Şekil 11'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Edu markalama yeni sentezlenmiş DNA içine dahil edilmek ve nükleosid analoglarının boyama dayanır çoğalan hücrelere DNA sentezini algılamak için yeni ve etkili bir yöntemdir. Bu yöntem daha hızlı ve çok hassas olduğu BrdU etiketleme yöntemine göre daha üstündür. Daha da önemlisi, 10. Tarihsel olarak, BrdU etiketleme üstün bir alternatif olarak, Edu etiketleme S-fazında nükleer DNA replikasyonu çalışmak için kullanılan, dokular 9-montaj tüm iyi yapısal korunması ve verimli Edu-boya penetrasyonu sağlar Hücre döngüsü. Afidikolin S-fazı 12 ila 15 nükleer DNA replikasyonu için başlıca polimerazdır DNA polimeraz a bir inhibitörüdür. mtDNA çoğaltma tedavi afidikolin hassas olmayan bir DNA polimeraz y, ile gerçekleştirilir. Bu nedenle, öncesinde ve edu inkübasyon sırasında aphidicolin tedavisi önemli ölçüde nükleer DNA'ya edu birleşmesini engellemiştir. Olması gerekiyoruygun depolanmış, ve nükleer DNA replikasyonunu inhibe aphidicolin etkinliği bizim elimizde değişken ise afidikolin birkaç hafta stabil olabilir unutulmamalıdır. Daha fazla veri analizleri gelen güçlü nükleer DNA etiketleme ile ovaryolden veya yumurta odaları ekarte edilmelidir.
mtDNA çoğaltma hali hazırda, aynı zamanda sitoplazma toplam hacmine normalize edu puncta sayısını sayarak mtDNA çoğaltma seviyesini ölçmek için basit bir şekilde elde edilir sitoplazmasmda puncta olarak görselleştirilebilir. Görüntüleme yazılımı otomatik olarak büyük veri kümelerinin hesaplama analizler için özellikle yararlıdır mikroskobik görüntüleri, Edu puncta tanımlamak için uygulanabilir. Nükleer DNA replikasyonu eksik inhibisyonu kromozomu üzerindeki farklı loci Edu dahil yol ve çekirdeğin içinde puncta olarak görüntüleyebilir Ancak, önlemler, önlemler alınmalıdır. Ayrıca diğer durumlarda, Edu yoğunluğu repli katılmadanArka plan ve gürültü yüksek olabilir iken cating mtDNA, zayıf olabilir. Bu nedenle, otomatik görüntü analizleri için, bireysel parametrelerin dikkatle tanımlanmalıdır. Ayrıca görüntülerin doğru edu puncta tanımlanır emin olmak için eğitimli gözlerle ele alınması gerektiğini tavsiye edilir.
Drosophila oogenez sırasında yeni sentezlenmiş mtDNA Görselleştirme mtDNA çoğaltma farmakolojik veya genetik düzensizliklerin çeşitli maruz sinekler deneyi yaparak, fizyolojik veya patolojik koşullar altında düzenlenir nasıl araştırmak için bir fırsat sağlar. Col T300I 11: Daha önceki bir çalışmada, Edu birleşme deneyi bir mtDNA mutant Drosophila mt gerçekleştirildi. Ayrıca, mitokondriyal membran potansiyelini bozmaya, yumurtalık mitokondriyal uncoupler FCCP ya da 2,4-dinitrofenol (DNP) Önceki EDU'ya dahil çeşitli konsantrasyonları ile muamele edildi. deneysel amaçlarla bağlıve ilaç özellikleri, farklı yöntemler etkin verilme için kabul edilebilir. Yetişkin sinekler, ilaç bir buhar (örn, etanol ve kokain) halinde sunulabilir 16,17 ya da ilaçlar hızlı bir şekilde gövde 18 boyunca yayılır karın içine enjekte edilebilir. En yaygın uygulama ilaçlar sinek yiyecek ya da sakaroz / ilaç doymuş filtre kağıdı eklenir olmasıdır. Örneğin, mikrotübül montaj, kolşisin önleyicisi, yumurtalık diseksiyon 19 önce 2-3 gün sinekler beslenmiştir. Bu nedenle, ilaç dağıtım yöntemini değerlendirmek ve uygun konsantrasyonları seçmek önemlidir.
Drosophila yumurtalıklarda mtDNA çoğaltma başarılı görüntüleme sağlamak için, birkaç kritik adımlar dikkatle yürütülmelidir. En önemlisi, diseksiyon ve edu kuruluş sırasında yumurtalıkların canlılığını ve sağlığını korumak esastır (Adım 1 ve 2). FBS ile Schneider Drosophila ortamı oda sıcaklığına ısıtıldı gerekenkullanmadan önce. Bir yumurta odaları ve kesme aletleri veya pipet uçları arasında doğrudan teması en aza indirmek gerekir. Yumurtalıklar dehidratasyonu önlemek için çözümleri altındaki tüm kere dalmış olmalıdır. dokular kolaylıkla yol açabilir ilgilenmedikleri soluk veya floresan sinyalleri. Doku montaj aşaması sırasında, ovaryolden birbirinden ayrılmalıdır ve bir mikroskop lamı üzerine yayılır. Yumurta odasının her biri üst üste yığılırlar ve emin olun. Biz sahnede 14 ötesine yumurta odaları küçük edu dahil edilmesini gösterdiğini fark ettim. Buna ek olarak, çünkü büyük boyutlu, geç dönem yumurta odaları sık sık komşu genç yumurta odaları odak dışına çıkmasına neden. Böylece geç dönem yumurta odaları atılmalıdır tavsiye edilir.
Burada Drosophila yetişkin yumurtalıklarda mtDNA kopyalayan etiketleme için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu yöntem çeşitli genetik ve farmakolojik perturbations altında mtDNA çoğaltma basit ölçümü için izin verir,ve gelişimsel mitokondriyal biyogenezi ve mtDNA miras yatan mekanizmaları diseksiyon için yararlı olacaktır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1,000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1,000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
