Introduction
I tillegg til den kjernefysiske genom, inneholder hver eukaryot celle også tusenvis av kopier av små sirkulære DNA i den mitokondrielle matriks. Mens mitokondrie DNA (mtDNA) koder essensielle subenheter av elektrontransportkjeden, er de fleste av mitokondrie proteomet, inkludert alle faktorer for replikasjon og transkripsjon av mtDNA kodet av atom genom. I motsetning til den kjernefysiske genomet som følger mendelsk arvelovene, er dyret mitokondrielle genom arvet utelukkende gjennom mors avstamning. Derfor forstå hvordan mtDNA er proliferated og overføres fra en generasjon til den neste gjennom den kvinnelige eggcelle er fundamentalt viktig. Men det er fortsatt debatt om hvordan mtDNA replikering er regulert i den kvinnelige germline. I tillegg er allment akseptert mtDNA flaskehals teorien for mtDNA overføring tyder på at bestanden av mtDNA i primordial kjønnsceller er delutvalgt til et relativt lite antall During utvikling en 2. Det innebærer også at mtDNA replikering er timelig og romlig regulert under oogenesen. Derfor vil in situ deteksjon av mtDNA replikering under germline utvikling lette forståelsen av mekanismen av mtDNA arv.
Drosophila oogenesen gir en genetisk medgjørlig system for å studere mtDNA replikering og overføring. I hver av de to Drosophila eggstokkene, er det 16-20 selvstendige strenger av egg kamre kalt ovarioles 3, som er de funksjonelle enheter av eggproduksjon (se figur 1A). Hver ovariole inneholder en progressiv lineær organisering av oogenesen, hvor den fremre spissen er sammensatt av en struktur som kalles germarium. Den germarium er videre delt inn i fire områder som inneholder bakterieceller på forskjellige utviklingsstadier. I region 1, germline stamceller gå gjennom asymmetrisk divisjon for å produsere datter celler som kalles cystoblasts. Region 2a inneholder cystoblasts som har fullført sin siste divisjon. Cystoblasts gjennomgå fire runder divisjon produsere 16-cellegrupper. De 16 cellene forblir koblet til hverandre ved hjelp av broer cytoplasmatiske kalt kanalringer. Bare én av cellene forplikter seg til differensiering som eggcelle, mens den andre 15 utvikle seg som polyploide sykepleier celler. Et vesentlig cytoplasmatiske struktur, kjent som fusome, er foreslått for å lette med dannelsen av kanalringer, bestemme cyste polaritet og sykepleieren celle-interaksjoner oocytten 4,5. Som cyster bevege seg mot region 2b, cysten strukturene spenner over hele bredden av germarium, og blir mer forbundet med follicle celler. De germarium strukturer ende med region 3 inneholder den første spirende egg kammer. Deretter blir egg kamre montert på bakre enden av germarium, som avanserer gjennom ovariole i 14 morfologisk forskjellige stadier. Veksten av eggcelle avhenger av sykepleier celler, which transportproteiner, mRNA og endomembransystemet strukturer (f.eks Golgi) via kanalringer i eggcelle. Under Drosophila oogenesen, ble det funnet at en brøkdel av mitokondrier i hver 16 celle-cyste ble forbundet med fusome, beveget gjennom kanalringer og ble levert inn i det eneste eggcelle i en stor masse som kalles Balbiani legeme 6. Dette fenomenet ble foreslått å bidra til kvalitetssikring av mitokondriell arv gjennom hunn eggstokkene.
Påvisning av mtDNA-syntese er avhengig av inkorporeringen av merkede DNA-forløpere i cellulært DNA. Tradisjonelt ble en nukleosid-analog av tymidin 5-brom-2'-deoksyuridin (BrdU) brukes til å merke det mtDNA-replikasjon i vevskulturceller 7,8. Imidlertid viser antistoff-baserte BrdU merking flere begrensninger, spesielt for hel-mount vev flekker. En stor ulempe med BrdU-merkingen er at den krever DNA-denaturering for å eksponereden BrdU epitop, slik at det kan påvises ved anti-BrdU-antistoff. Prøven er som skal behandles under tøffe denaturerende betingelser som for eksempel kjemikalier (for eksempel saltsyre eller blandinger av metanol og eddiksyre), varme, eller fordøyelse med DNase, som kan forstyrre strukturen i prøven og vanskeliggjør følgende fargeprosedyre 9, 10.
Her er et alternativ tymidin analog 5-etynyl-2'-deoxyuridine (Edu) brukes til å merke den replikere mitokondrie-DNA i Drosophila voksen eggstokkene. Denne metoden er raskere og svært følsom. Edu er lett innlemmes i cellulær DNA under DNA replikasjon. Den følgende deteksjon er basert på et "klikk" reaksjon, en Cu (I) -catalyzed kovalent reaksjon mellom terminal alkyn gruppe og et fluoriserende azid 10. På grunn av at reaksjonen ikke krever denaturering av prøven, gir det god strukturell konservering. Videre, størrelsen av fargestoffet enzide er bare 1/500 av den til et antistoffmolekyl 10, som muliggjør hurtig og effektiv gjennomtrengning av hel-typen vev. Vi har brukt denne metoden for å oppdage mtDNA replikering under Drosophila oogenesen og fant en slående romlig mønster i germarium regionen Drosophila eggstokk 11, som fører oss til å foreslå en replikering avhengig mtDNA selektiv arv mekanisme. Vi presenterer her en detaljert protokoll om Edu merking av mtDNA replikering i Drosophila eggstokkene. For å demonstrere anvendelsen av protokollen, vi også testet mtDNA replikasjon i en mtDNA mutant Drosophila (mt: COI T300I) 11, så vel som med diverse behandling av mitokondrie uncouplers, som sprer den mitokondriemembranpotensialet og potensielt forstyrre mtDNA replikasjon.
Protocol
1. Tissue Collection og Dissection
- I hvert hetteglass med tørrgjær, fluer kultur 10 voksen kvinne med 10 menn i 2-3 dager.
Merk: Opprettholde velfødde kvinnelige fluer vil forbedre den generelle kvaliteten og utbytte av eggstokk produksjon og tilrettelegge disseksjon. - Anesthetize kvinnelige flyr på en karbondioksid (CO 2) fly pad.
- Under stereoskop, plassere flere dråper RT medium (Schneider Drosophila medium supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS)) på en dissekere pute. Gjennomføre alle disseksjon prosedyrer i mediet for å holde vevet i live og frisk.
- Grab gjøk kvinnelig fly med skarpe fin-nosed tang på sitt nedre thorax. Bruk et annet sett med pinsett til å slite forsiktig på den ekstreme bakre av flua til vevet i magen er utsatt. Ta de to eggstokkene fra andre vev (f.eks tarmer).
Merk: hver eggstokk viser en ugjennomsiktig struktur som er komponered av 16-20 vedlagte ovarioles. - For å øke utbredelsen av reagenser, åpne eggstokkene ved å trekke dem fra hverandre og passerer tuppen av tang i mellom hver ovariole et par ganger. Hold ovarioles er koblet i en eggstokk for å minimalisere tap av vev i løpet av de følgende fremgangsmåter.
- Overfør eggstokkene umiddelbart til et 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholdt 500 ul av Schneider Drosophila medium med 10% FBS.
- Gjenta disseksjon og samle 10-15 eggstokkene i hvert mikrosentrifugerør.
2. Edu Merking
- Aspirer medium i hvert rør, og erstatte med 500 mL av Schneider Drosophila medium med 10% FBS inneholder syv um aphidicholin.
Merk: aphidicholin brukes til å blokkere nukleær DNA-syntese ved å inhibere DNA-polymerase α uten å påvirke mtDNA replikering 7, 12. Det er mulig å øke aphidicholin konsentrering til segtil 70 uM for å oppnå bedre inhibering. Stamoppløsningen av 3-30 mM aphidicholin i DMSO kan lagres i mørke ved -20 ° C i opptil 6 uker. - For å holde eggstokkene sunt, sørge for at de er midt i henhold til løsninger når du skifter medium. Bruk Schneider Drosophila medium med 10% FBS og med trinn 2.6.
- Inkuber eggstokkene i 3 timer ved RT på en benk-topp rocker med forsiktig rotasjon.
- For behandling, f.eks mitokondrie uncoupler karbonyl cyanid 4-trifluormetoksy phenylhydrazone (FCCP), tilsett passende konsentrasjon av stoffet (for eksempel 10 mm FCCP) inn i mediet etter 2 timer av aphidicholin behandling. Fortsett å inkubere i ytterligere 1 time.
- Fjern det medium inneholdende aphidicholin med eller uten medikament. Kort renset eggstokkene med medium (aphidicholin er ikke nødvendig) to ganger.
- Tilsett 1 ml medium som inneholder 10 mikrometer Edu og 7 mikrometer aphidicholin og fortsette å inkubereg ved romtemperatur i 2 timer. Oppbevar 10 mM Edu stamløsning (i DMSO) ved -20 ° C.
- Fjern mediet inneholder Edu og aphidicholin. Vask med medium (uten aphidicholin) to ganger i 3 minutter hver.
3. Tissue Fiksering og Permeabilization
- Fremstille en 4% paraformaldehydløsning i fosfatbufret saltvann (PBS, pH 7,4).
Merk: Vi brukte kommersielt tilgjengelig paraformaldehyde lagret i forhånds scoret ampuller. Åpne en ny ampulle og fortynnet til 4% før bruk.
FORSIKTIG: Formaldehyd er giftig; det skal håndteres i et avtrekksskap med hud og vernebriller. - Løs eggstokkene med 4% paraformaldehyd i 20 minutter ved romtemperatur med forsiktig rotasjon.
- Fjern det bindemiddel og vaskes eggstokker to ganger i 1 ml 3% BSA i PBS i 5 min hver gang.
- For å permeabilisere vev, fjerner vaskeoppløsningen og tilsett 1 ml 0,5% Triton X-100 i PBS. Inkuber ved RT i 20 min.
- Fjern det permeabiliseringen løsningen og vask to ganger i 1 mlav 3% BSA i PBS.
4. Edu Detection
Merk: Edu deteksjon er basert på "klikk" kjemi, en Cu (I) -catalyzed [3 + 2] cykloaddisjon 13, som legger fluorescerende azider til terminalen alkyn gruppen av Edu, og fluorescerende molekyl utsettes for påfølgende deteksjon. Siden Cu (I), som er lett oksyderes til de ikke-katalytiske Cu (II) arter, er nødvendig for å katalysere reaksjonen, er det anbefalt å redusere Cu (II) sulfat in situ for å oppnå Cu (I). Det vil si, Cu (II) sulfat anvendes i nærvær av et reduksjonsmiddel, slik som askorbinsyre (heri "buffer additivet") for å generere kobber (I).
- Før eksperimentet, utarbeide arbeids løsning av Alexa Fluor azidet (Alexa Fluor 488 azid, Alexa Fluor 555 azid eller andre, avhengig av den foretrukne fluorophore, som er navngitt som "dye azide" heretter), Edu reaksjonsbuffer og Edu buffer additive i henhold til produsentensbruksanvisning.
- Rekonstituere fargestoff azidet i 70 mL DMSO. Oppbevar arbeidsløsning ved -20 ° C i opp til ett år.
- Forbered fersk Edu reaksjon buffer ved å fortynne 10x Edu reaksjonsbuffer med avionisert vann.
Merk: Etter bruk lagre eventuelle gjenværende 1x løsning ved 4 ° C. Den 1x løsningen er stabil i inntil 6 måneder. - Lag en 10x stamløsning av Edu buffer additive ved fullt oppløsning av tørrstoff 2 ml avionisert vann.
Merk: Dette lager løsningen er stabil i inntil ett år ved -20 ° C. Hvis løsningen utvikler en brun farge, har det degradert og må kasseres.
- Klargjør EDU reaksjon cocktail frisk hver gang, og bruk innen 15 min med forberedelser. For å oppnå reproduserbare resultater, sørg for reaksjonskomponentene er opprettholdt på samme forholdstall.
- Gjøre fersk 1x EDU bufre tilsetningsløsningen ved å fortynne den 10x stamløsning (fremstilt i trinn 4.1.3) 1:10 i avionisert vann. Bruk denne solution på samme dag.
- Forbered 1 ml Edu reaksjon cocktail ved å kombinere følgende ingredienser i rekkefølge: 860 mL 1x Edu reaksjonsbuffer, 40 ul CuSO4, 2,5 mL fargestoff azid, 100 mL 1x Edu buffer additiv.
Merk: Det er viktig at ingrediensene er lagt for å sikre optimal ytelse.
- Fjern PBS med 3% BSA og tilsett 0,5 ml av den EDU reaksjon cocktail til hvert rør. Inkuber ved RT i 30 min med forsiktig rotasjon. Hold prøvene beskyttet mot lys.
- Fjern det EDU reaksjonen cocktail og vask en gang med 1 ml 3% BSA i PBS.
- Vask prøvene en gang med 1 ml PBS.
5. Antistoff Merking
Merk: Utfør antistoff merking etter Edu farging. Hvis ingen ytterligere farging er ønskelig, kan man gå videre til montering og avbildning direkte. Det er viktig at prøvene må beskyttes mot lys i alle de følgende prosedyrer.
- Fjern vaskeløsningen. Blokk eggstokkene i 1 ml blokkeringsoppløsning inneholdende 0,2% BSA og 0,1% Triton X-100 i PBS i 30 min.
- Fjern blokkeringsløsningen og erstatte med primært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning (for eksempel mus ATP-syntase-subenhet α antistoff, 1: 1000 fortynning). Inkuber i mørke ved 4 ° CO / N.
- Vask prøvene med 1 ml blokkeringsoppløsning 3 ganger, 10 minutter hver gang. For å minimalisere bakgrunnen, vaskes to ganger i 30 minutter hver. Fjern blokkeringsløsningen.
- Inkuber med sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning (for eksempel geit anti-mus Alexa Fluor 568 sekundært antistoff, 1: 200 fortynning) i 2 timer ved RT.
Merk: Bruk en annen farge enn den koblet til Edu. - Gjenta vasketrinn som utføres i trinn 5.3.
- Skyll med 1 ml PBS en gang for å fjerne detergenten.
6. Montering og bildebehandling
- Fjern forsiktig all PBS og immediately dekke eggstokkene med 50 mL montering medium (med eller uten DAPI).
Merk: Bruk en monteringsmedium som ikke stivne mens ovarioles blir skilt fra hverandre. Eggstokkene kan lagres i monteringsmedium ved 4 ° C i opp til en uke. - Skjær enden av en pipette tips og bruke den til å overføre eggstokkene nøye på et objektglass.
- Helt egen hver ovariole med skarpe fin-nosed tang under stereomikroskop. Fjern forbindelses vev på bakre enden og scenen 14 eller modne egg kamre. De unge egg kamre er ved den fremre ende og gjennomsiktig.
- Rett inn egg kamre med tang slik at de ikke overlapper med hverandre.
- Sakte senke en # 1,5 glass dekkglass på toppen av prøvene. Tillat monteringsmedium for å polymerisere i flere timer ved RT. Tett med gjennomsiktig neglelakk.
- Bildet glir neste dag, eller oppbevar ved 4 ° C før bildebehandling.
- Visualiser under en confocal microscope med en 63X olje nedsenking målsetting. Capture tredimensjonale z-stabler bilder.
Merk: Det er sterk Edu signal i senere stadium egg kamre og bakgrunn fluorescens i epiteliale sliren. Når behandlingen Edu merking i et bestemt germarium, bør man unngå germariums som er overlappet av eller i nærheten av andre vev eller senere stadium egg kamre.
Representative Results
Ovennevnte protokollen tillater visualisering av punctate strukturer knyttet til mitokondriene (Figur 1B-C), noe som indikerer mitokondriell DNA replikasjon i løpet av Drosophila oogenesen. EDU puncta lokalisert med mitokondrier merket ved farging for ATP syntase alfa subenheten (figur 2). De observerte signaler som var fraværende i eggstokkene ble behandlet med etidiumbromid 11, en inhibitor for mtDNA replikasjon 14, validering at disse puncta faktisk etikett replikerende mtDNA.Aphidicolin ble anvendt for å inhibere nukleær DNA-farging uten å påvirke mtDNA-replikasjon (figur 2). Uten aphidicholin behandling, intense Edu signaler merke kjerner, og mtDNA puncta ble knapt registrert (figur 3). Imidlertid, i nærvær av aphidicholin, kjerne inkorporering ble dramatisk redusert, og mange puncta forbundet med mitokondrier ble observert.
(Figur 1b). Men spesielt, viste mtDNA replikering et romlig mønster i germarium. Som indikert av antall Edu puncta, det er et moderat nivå av mtDNA replikering i region 1 av germarium, men nesten ingen Edu innlemmelse i regionen 2A (figur 1C). Som cyste beveger seg ned til region 2B i germarium, mtDNA replikering gjenopptatt og antall Edu puncta i bakre cyste i region 2B var mye høyere enn i regionen 2A (figur 1C). Spesielt ble intensiv Edu innlemmelse konsentrert rundt kanalringer og fusome strukturer, som farget av hu li tai Shao (HTS) protein. mtDNA holdt replikerende på et høyt nivå i området 3 til germarium (figur 1C)
For å demonstrere foreningen av specific gener eller behandling med mtDNA spredning, kunne Drosophila eggstokkene bli utsatt for genmanipulering eller medikamentell behandling. Vi behandlet eggstokkene med ulike konsentrasjoner av FCCP, en klassisk mitokondrie protonophore, som avleder mitokondriemembranen potensial. Som en kontroll ble DMSO ikke hadde noen effekt på mtDNA replikasjonen (figur 4A). Høye doser av FCCP (10 mm) nesten oppbrukt mtDNA replikering helt gjennom germarium (figur 4D). Ikke desto mindre, lavere konsentrasjon av FCCP (2 eller 5 uM) hadde en mindre effekt på mtDNA-replikasjon i region 1, men inhiberes replikasjon i områdene 2B og 3 (figur 4B-C), noe som tyder regioner 2B og 3 er mer følsomme for mitokondriell avbrudd, eller de opprettholde relative tregere replikering kinetikk. De ovenfor angitte resultater indikerer at mtDNA replikasjon er forbundet med mitokondriell aktivitet. Spesielt ulike regioner av germarium reagerte forskjellig på mitokondrie impairment.
Figur 1. mtDNA replikering under Drosophila oogenesen. (A) Diagram av et Drosophila ovariole og et forstørret bilde av den germarium. Den ovariole viser fra venstre til høyre, fremre til bakre, påfølgende utviklingsstadier av egg kamre. I germarium, er det fusome (rød), germline stamceller (blå), mitokondrier (grønn), fremtidig oocytten (stiplet linje, anerkjent av posisjonering, fusome struktur og mitokondrie klynger), utvikling av cyster (fersken) og fire utviklings regioner vist . (B) Representant z-stack projeksjon av en villtype ovariole merket av Edu og antistoff mot Hts-RC, en markør for kanalringer og fusome. I nærvær av aphidicholin, ble EDU innlemmet i mtDNA (pilhoder) og kjerner (piler). Scale bar, 10 mikrometer.(C) Forstørret visning av germaria skissert i eske regionen i B. De fire utviklingsområdene er angitt. Scale bar, fem mikrometer 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. mtDNA replikering i Drosophila germarium visualisert ved Edu inkorporering med aphidicholin behandling (A) -. (D) Representant konfokal delen av en villtype germarium viser Edu inkorporering (grønn, b), mitokondrier, preget av ATP syntase alfa subenheten farging (red, C), og kjerner, merket med DAPI farging (blå, D) med pre-inkubering med DNA-polymerase-inhibitor α aphidicholin. (A &# 39 -D ') Et forstørret bilde av eske området (A) som viser EDU inkorporering (B'), mitokondrier (C ') og kjerner (D'). I nærvær av aphidicholin, er atom inkorporering (piler) redusert og mange puncta ble lokalisert innenfor mitokondrier (pilspisser). Skala barer, 10 mikrometer. Figuren er modifisert fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. mtDNA replikering knapt påvist i Drosophila germarium uten aphidicholin behandling (A) -. (D) Representant konfokal delen av en villtype germarium viser Edu inkorporering (grønn), mitokondrier, preget avATP-syntase alfa-underenhet-farging (rød), og kjerner, merket med DAPI farging (blå) i fravær av DNA-polymerase-inhibitor α aphidicholin. (A'-D ') Et forstørret bilde av eske området (A) som viser EDU inkorporering (B'), mitokondrier (C ') og kjerner (D'). Uten aphidicholin, ble intense Edu signaler etiketten atomkjerner (piler), og mtDNA puncta knapt oppdaget. Skala barer, 10 mikrometer. Figuren er modifisert fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Mitokondrie uncoupler svekker mtDNA replikering. Representative z-stack prosjekter som viser villtype germarium behandlet med DMSO(A) eller den mitokondrielle uncoupler FCCP ved konsentrasjoner på 2 um (B), 5 uM (C), 10 pM (D) i løpet av EDU inkorporering. Legg merke til svekket Edu merking i region 2B behandlet med 2 mikrometer FCCP (B), og i både region 2B og 3 behandlet med 5 mikrometer FCCP (skissert i boksene). Fire utviklings regionene vises. Piler, kjerne-DNA; pilspisser, mtDNA. Scale bar, 10 mikrometer. Figuren er modifisert fra 11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
EDU merking er en ny og effektiv metode for å påvise DNA-syntese i prolifererende celler, som er basert på inkorporering og farging av nukleosidanaloger i nylig syntetisert DNA. Denne metode er overlegen i forhold til den BrdU merking metode ved at den er raskere og svært følsom. Enda viktigere, gir det mulighet for god strukturell bevaring og effektiv Edu-dye penetrasjon av hel-mount vev 9, 10. Historisk sett som et godt alternativ til BrdU merking, Edu merking ble brukt for å studere atom DNA replikasjon i S-fasen av cellesyklusen. Aphidicholin er en inhibitor for DNA-polymerase α, som er den viktigste polymerase for nukleær DNA-replikasjon i S-fase 12 15. mtDNA replikasjon utføres ved DNA-polymerase γ, som er ufølsom for aphidicholin behandling. Derfor behandling med aphidicholin før og under Edu inkubasjon betydelig hemmet Edu innlemmelse i kjerne-DNA. Det burdebemerkes at aphidicholin kan være stabile i flere uker hvis hensiktsmessig lagres, og effekten av aphidicholin i inhibering av nukleær DNA-replikasjon var variabel i våre hender. De ovarioles eller egg kamre med sterke kjerne DNA merking bør utelukkes fra videre dataanalyser.
mtDNA replikering kan lett visualiseres som puncta i cytoplasma, noe som også gir en enkel måte for å kvantifisere nivået av mtDNA-replikasjon ved å telle antall EDU puncta, normalisert til det totale volumet av cytoplasma. Imaging-programvaren kan brukes til å automatisk identifisere Edu puncta i mikroskopiske bilder, noe som er spesielt nyttig for beregnings analyser av store datasett. Men forholdsregler bør tas, fordi ufullstendig hemming av nukleært DNA replikasjon kan føre til at Edu innlemmelse i tydelig loci på kromosom og vise som puncta inne i kjernen. Også i andre tilfeller, intensiteten av Edu innlemmelse i Replicating mtDNA kan være svak, mens bakgrunnen og støy kan være høy. Derfor bør de enkelte parametre for automatiske bildeanalyser være nøye definert. Det anbefales også at bildene bør undersøkes med trente øyne å sørge for at riktig Edu puncta er identifisert.
Visualisering av nylig syntetisert mtDNA under Drosophila oogenesen gir en mulighet til å undersøke hvordan mtDNA replikering er regulert under fysiologiske eller patologiske tilstander, ved å utføre eksperimentet i fluer utsatt for en rekke farmakologiske eller genetiske forstyrrelser. I en tidligere studie ble Edu innlemmelse analyse utført i en mtDNA mutant Drosophila mt: COI T300I 11. Videre, for å forstyrre mitokondriemembranen potensial, ble eggstokkene ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av mitokondriell uncoupler FCCP eller 2,4-dinitrofenol (DNP) før EDU inkorporering. Avhengig av eksperimentelle formålog narkotika kjennetegn, kan ulike metoder tas i bruk for effektiv levering. For voksne fluer, kan medikamenter bli presentert som en damp (for eksempel etanol og kokain) 16,17 eller medikamenter kan bli injisert inn i abdomen, hvor det raskt diffunderer i hele kroppen 18. Den mest vanlige praksis er at medikamenter ble tilsatt til fly mat eller et sukrose / medikament-mettet filtrerpapir. For eksempel hemmer av mikrotubuli montering, colchicin, ble matet til fluer i 2-3 dager før eggstokk disseksjon 19. Derfor er det viktig å vurdere medikamenttilførselsmetoden og velge passende konsentrasjoner.
For å sikre en vellykket avbildning av mtDNA replikering i Drosophila eggstokkene, må flere kritiske trinn nøye henrettet. Fremst, bevare levedyktigheten og helse av eggstokkene under disseksjon og Edu innlemmelse er essensielle (trinn 1 og 2). Den Schneider Drosophila medium med FBS behov for å bli varmet opp til romtemperaturfør bruk. Man bør redusere kontakt mellom egg kamre og dissecting verktøy eller pipetter. Eggstokkene bør være nedsenket i henhold løsninger hele tiden for å unngå dehydrering. Mishandling vev kan lett føre til svak eller ingen fluorescerende signaler. Under vev monteringstrinnet, bør ovarioles skilles fra hverandre og spredt ut på objektglass. Pass på at egg kamrene er ikke stablet oppå hverandre. Vi la merke til at egg kamre utover scenen 14 vises litt Edu innlemmelse. I tillegg, på grunn av den store størrelsen, sent stadium egg kamre ofte føre til nabo yngre egg kamre å være ute av fokus. Dermed er det anbefalt at de sent stadium egg kamre kastes.
Her gir vi en detaljert protokoll for merking replikere mtDNA i Drosophila voksen eggstokkene. Denne metoden gjør det mulig for enkel kvantifisering av mtDNA replikering under ulike genetiske og farmakologiske forstyrrelser,og vil være nyttig for å dissekere mekanismene bak utviklings mitokondrie biogenesis og mtDNA arv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 21720-024 | |
| FBS | Invitrogen | 10100-147 | |
| Pair of Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Aphidicolin | Sigma | A0781 | Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving. |
| FCCP | Sigma | C2920 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Paraformaldehyde, 16% EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection. |
| PBS | KD Medical | RGF-3190 | |
| BSA | Sigma | A7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | EdU, CuSO4, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included |
| Mouse ATP synthase subunit α antibody, (15H4C4) | MitoSciences | Ab14748 | 1:1,000 dilution |
| Mouse Hts antibody (clone RC) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | hts RC | 1:1,000 dilution |
| Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody | Invitrogen | A-11004 | 1:200 dilution |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Microscope slide | Fisher Scientific | 22-038-103 | |
| Nail polish | Elf | Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used. |
References
- Taylor, R. W., Turnbull, D. M. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 6 (5), 389-402 (2005).
- Wallace, D. C., Chalkia, D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (11), a021220 (2013).
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Lab. Press. (1993).
- Riechmann, V., Ephrussi, A. Axis formation during Drosophila oogenesis. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 374-383 (2001).
- Lin, H., Yue, L., Spradling, A. C. The Drosophila fusome, a germline-specific organelle, contains membrane skeletal proteins and functions in cyst formation. Development. 120 (4), 947-956 (1994).
- Cox, R. T., Spradling, A. C. A Balbiani body and the fusome mediate mitochondrial inheritance during Drosophila oogenesis. Development. 130 (8), 1579-1590 (2003).
- Davis, A. F., Clayton, D. A. In situ localization of mitochondrial DNA replication in intact mammalian cells. J Cell Biol. 135 (4), 883-893 (1996).
- Iborra, F. J., Kimura, H., Cook, P. R. The functional organization of mitochondrial genomes in human cells. BMC Biol. 2, (2004).
- Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci. 3 (1), 65-71 (2002).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Hill, J. H., Chen, Z., Xu, H. Selective propagation of functional mitochondrial DNA during oogenesis restricts the transmission of a deleterious mitochondrial variant. Nat Genet. 46 (4), 389-392 (2014).
- Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (2), 207-218 (2010).
- Tornoe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(i)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides. J Org Chem. 67 (9), 3057-3064 (2002).
- Horwitz, H. B., Holt, C. E. Specific inhibition by ethidium bromide of mitochondrial DNA synthesis in physarum polycephalum. J. Cell Biol. 49, 546-553 (1971).
- Huberman, J. A. New views of the biochemistry of eucaryotic DNA replication revealed by aphidicolin, an unusual inhibitor of DNA polymerase alpha. Cell. 23 (3), 647-648 (1981).
- McClung, C., Hirsh, J. Stereotypic behavioral responses to free-base cocaine and the development of behavioral sensitization in Drosophila. Curr Biol. 8 (2), 109-112 (1998).
- Moore, M. S., et al. Ethanol intoxication in Drosophila: Genetic and pharmacological evidence for regulation by the cAMP signaling pathway. Cell. 93 (6), 997-1007 (1998).
- Dzitoyeva, S., Dimitrijevic, N., Manev, H. Gamma-aminobutyric acid B receptor 1 mediates behavior-impairing actions of alcohol in Drosophila: adult RNA interference and pharmacological evidence. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5485-5490 (2003).
- Koch, E. A., Spitzer, R. H. Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway. Cell Tissue Res. 228 (1), 21-32 (1983).
