Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Hochdurchsatz-Multiplex, und gezielte proteomic Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) -Assay mit Potential für klinische Umsetzung entwickelt. Der Test kann für Neurodegeneration, wie Apolipoprotein E-Varianten (E2, E3 und E4), und messen deren allelische Expression potentielle Marker und Risikofaktoren zu quantifizieren.

Zusammenfassung

Viele neurodegenerative Erkrankungen fehlen noch wirksame Behandlungen. Zuverlässige Biomarker für die Identifizierung und Klassifizierung dieser Krankheiten wird in der Entwicklung zukünftiger neuer Therapien wichtig sein. Oft potentielle neue Biomarker machen es nicht in die Klinik wegen der Beschränkungen in ihrer Entwicklung und hohen Kosten verbunden. Allerdings gezielte Proteomik Multiple Reaction Monitoring-Flüssigchromatographie-Tandem / Massenspektrometrie (MRM LC-MS / MS) unter Verwendung, insbesondere Triple-Quadrupol-Massenspektrometer verwendet wird, ist ein Verfahren, das verwendet werden kann, um schnell auszuwerten und zu bestätigen Biomarker für die klinische Umsetzung in diagnostische Laboratorien . Traditionell wurde diese Plattform extensiv für die Messung von kleinen Molekülen in klinischen Laboratorien verwendet worden, aber es ist das Potential Proteine ​​zu analysieren, dass es eine attraktive Alternative zu ELISA (enzyme-linked Immunosor machtgebogen Assay) -basierte Methoden. Wir beschreiben hier, wie gezielte Proteomik eingesetzt werden können Multiplex-Marker der Demenz zu messen, einschließlich der Nachweis und die Quantifizierung des bekannten Risikofaktor Apolipoprotein E-Isoform 4 (ApoE4).

Um den Test geeignet für die Übersetzung zu machen, ist es entworfen, schnelle, einfach zu sein, hochspezifische und kosteneffektiv. Um dies zu erreichen, muss jeder Schritt in der Entwicklung des Assays für die einzelnen Proteine ​​und Gewebe optimiert werden sie analysiert werden. Diese Methode beschreibt ein typischer Arbeitsablauf, einschließlich verschiedener Tips und Tricks zu entwickeln für die Translation eine gezielte Proteomik MRM LC-MS / MS .

Die Methodenentwicklung wird unter Verwendung von optimierten benutzerdefinierten synthetisierten Versionen von tryptischen quantotypic Peptide, die die MS zur Detektion kalibrieren und dann versetzt in CSF korrekte Identifizierung des endogenen Peptid in der chromatographischen Trennung vor der Analyse in den MS zu bestimmen. Um das zu erreichen absolute Quantifizierung, stabilen Isotopen-markierten internen Standard-Versionen der Peptide mit kurzen Aminosäuresequenz-Tags und eine Trypsinspaltstelle enthalten, werden in dem Test enthalten.

Einleitung

Die zunehmende Bedeutung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit, Lewy - Körperchen - Demenz und Parkinson-Krankheit, wird zu einer sozio - ökonomischen Problem in vielen Ländern ^1. Es besteht ein Bedarf an zusätzlichen Biomarkern, die verwendet werden können, um Patienten in den frühen Stadien der Krankheit zu identifizieren und zu klassifizieren, und mögliche neue Behandlungen zu überwachen. Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine generische Pipeline für eine schlanke, wirtschaftliche und schnelleren Weg der Validierung Potential CSF-Marker der Neurodegeneration zu erstellen. Der Grund dafür ist, gezielte Proteomik oder Peptid MRM LC-MS / MS als leicht abänderbar Methode zu verwenden, um mehrere potentielle Protein-Biomarkern von der Entdeckung Experimente beurteilen. Diese können weiter über einen schnellen chromatographischen Trennung gemultiplext werden (<10 min) und bewertet. In diesem Multiplex-Bildschirm für neurodegenerative Biomarkern haben wir die bekannten Demenz Risikofaktor Apolipoprotein E4-Isoform (ApoE4) enthalten, so ca wirn bestimmen gleichzeitig ihren Status und Umfang der Expression, durch das ² die Notwendigkeit für separate Genotypisierungstests beseitigen. LC MS / MS wird routinemäßig als Methode der Wahl verwendet zur genauen Quantifizierung kleine Moleküle gegenüber anderen Methoden, wie ELISA oder Radioimmuntest (RIA). Diese Verschiebung in der Verwendung von MS-Technologie zur Analyse Proteine ​​wurde hauptsächlich durch Probleme mit der immuno-basierten Technologien angetrieben. Dazu gehören Kreuzspezifität, Chargenstreuung, begrenzte Haltbarkeit und hohe Kosten. Daher wird gezielt Proteomik schnell eine wachsende Alternative zu Antikörpern basierende Verfahren wie Western-Blot, RIA und ELISA werden. Um jedoch die Fähigkeit , viele Markierungen in einem Assay multiplexen ist der große Vorteil dieser Technik gegenüber immuno-basierten Verfahren ^3. Die Technik ist anwendbar auf viele Gewebe und wurde als eine Validierungsstrategie für viele Proteomstudien einschließlich Plasma und Urin - ^{4 5,6} verwendet.

Die technique kann zu jedem Labor angewendet werden, die sich mit der Triple-Quadrupol-Massenspektrometer Zugang und Know-how verfügt. Peptid-Design ist relativ einfach mit dem wachsenden Einsatz von Open-Source-Datenbanken. Der Wettbewerb geprägten Markt der kundenspezifischen Peptiden Synthese macht sie viel günstiger. Schwere Peptide, sind jedoch teuer und daher sind die Marker sollten in einem größeren Maßstab, bevor er auf einen kleinen Kohorte beurteilt werden. Es gibt immer mehr Potenzial für die Technik, die in den klinischen Diagnoseeinstellungen verwendet werden, wobei die meisten großen Krankenhäuser Triple-Quadrupol-basierten Plattformen, die die leicht angepasst werden kann, um gezielt Proteom-Assays laufen. Eine solche Anwendung des Verfahrens wird es in die Routinediagnostik Einstellung vornehmen, ist die jüngste Anwendung Neugeborenen Blutfleck - Screening für Sichelzellenanämie ^7.

Protokoll

. HINWEIS: Ein Schema des hier beschriebenen allgemeinen Protokoll in Bild 1 angegeben Alle Proben für die Entwicklung dieser Methode verwendeten Überschuss klinischen diagnostischen Proben und haben ethische Genehmigung von der Londoner Bloomsbury Ethikkommission.

Abbildung 1. Schema , den Gesamtprozess der Erstellung eines Targeted CSF MRM LC-MS / MS - Assay. Kandidatenmarkerpeptide für die Bewertung werden von Protein - Targets ausgewählt. Durch den Einsatz von kundenspezifischen synthetisierten Peptide eine gezielte LC-MS / MS Multiplexverfahren erzeugt. Nach der Auswertung kann der Test der Wirksamkeit von potentiellen Marker der Neurodegeneration zu beurteilen, verwendet werden.

1. Peptid Auswahl und Gestaltung

HINWEIS: Kriterien für einen Marker - Peptid ist , dass es eindeutig sein muss (proteo (quantotypic). Um zu bestimmen, ob ein Peptid eindeutig ist oder nicht, die 'Explosion' Suchwerkzeug auf der Uniprot Website (http://www.uniprot.org/blast/) verwendet werden.

1. Definieren Sie eine Liste von Zielproteinen (Marker), dh ApoE (siehe Tabelle 2).
   HINWEIS: Wenn die Markierung ⁸ aus früheren Proteomanalyse Experimenten identifiziert wurde, dann wählen Sie das Peptid, das die beste Antwort von diesem Datensatz gibt.
2. Wenn diese Informationen nicht verfügbar ist, nutzen Open - Source - Websites, wie in silico Trypsinverdaus von Zielproteinen, ein Software - Tool , wie zB MS-Digest verwenden.
3. Wählen Sie das Peptid, das tryptische und nicht anfällig für translationale Modifikationen schreiben.
   Hinweis: Diese Informationen finden Sie auf der Website Uniprot www.uniprot.org geprüft werden. Vermeiden Peptide anfällig für chemische Modifikation während LC-MS Probenvorbereitung.
4. die kundenspezifische Synthese der ausgewählten Peptide bestellen.
   HINWEIS: Marker-Peptide können benutzerdefinierte von verschiedenen kommerziellen Unternehmen synthetisiert werden. Für ApoE das quantotypic Peptid wurde zur Messung der Gesamt ApoE Ebenen verwendet wird, bestimmt AATVGSLAGQPLQER zu sein. Die proteoPeptidSequenzen verwendet, um die E2 und E4 Varianten bestimmen, sind die tryptischen Peptide zur Position 158 (RLAVYQAGAR und CLAVYQAGAR) und Position 112 (LGADMEDVCGR und LGADMEDVR), respectively.

2. Herstellung des Standard Peptides

HINWEIS: Um die besten quantitative Übergänge zur Auswahl, die Erfassung der Matrix (CSF) muss optimiert werden. Der effizienteste Weg gemultiplexten Peptide optimieren ist Pools der Peptide in bekannten Konzentrationen zu erzeugen. Diese Pools können dann für die Methodenentwicklung und Standardkurven verwendet werden.

1. Resuspendieren synthetische Peptide auf 1 mg / ml Stamm (Peptid Details in Tabelle 2 angegeben sind)Konzentration nach Herstelleranweisungen. In der Standardeinstellung , wenn die Anweisungen nicht verfügbar sind , Resuspensierbereich Peptide in 50:50 (v / v) Acetonitril (ACN) / H ₂ O.
2. Bereiten Sie die 01.10 Verdünnungen des Peptids aus der Stoffkonzentration und Pool 1000 pmol jedes Peptids in eine niedrige Bindungsreaktionsgefäß. Trocknen Sie unten in einem Speed-Vac-Konzentrator die endgültige Pool und bei -20 ° C. Bereiten Sie mehrere Pools für die zukünftige Verwendung.
3. Aliquot 100 ul CSF in geringen Bindungs ​​Rohre. Gefriertrocknungs die CSF.
4. Resuspendieren eine aliquote Menge von gepoolten 1000 pmol Peptide in Verdauungspuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,8, 6 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% ASB14) auf Konzentrationen von 10 und 1 pmol / ul erhalten.
5. Spike der vereinigten Peptide in den gefriergetrockneten 100 ul Aliquots von CSF bei 0, 1, 2, 5, 10 und 15 pM-Konzentrationen. Hinzufügen, 20 ng von intaktem nicht verwandtes Protein, wie Hefe-Enolase als interner Standard und Kontrolle für die Verdauung Effizienz tr handelnypsin.
6. Ganz oben auf der CSF-Aliquots mit Puffer bis zu einer endgültigen Höhe von 20 & mgr; l zu verdauen. Wirbel.
7. Hinzufügen, 1,5 ul Dithiothreit (30 mg in 1 ml von 100 mM Tris HCl, pH 7,8) und schüttelt bei Raumtemperatur für 1 Std.
8. Hinzufügen 3 ul Iodacetamid (35 mg in 1 ml von 100 mM Tris HCl, pH 7,8) und schüttelt bei Raumtemperatur für 45 min im Dunkeln.
9. In 165 ul ddH ₂ O.
10. In 10 ul 0,1 ug / ul Sequenziergrad modifizierte Trypsin-Lösung in 50 mM Ammoniumbicarbonat-Puffer, pH-Wert 7,8. Inkubieren in einem Wasserbad bei 37 ° CO / N und die Verdauung zu stoppen Proben durch Gefrieren. Shop verdaut bei -20 ° C bis bereit zu analysieren.

3. Optimierung von MS Peptiderkennung

1. Kopieren Sie die Sequenz des Peptids optimiert werden, in eine entsprechende Software, zB Skyline ^9. Klicken Sie auf das Peptidsequenz die Informationen zu erhaltender erwarteten Vorläuferionenmasse und Produkt-Ionen.
2. Verdünnen Sie die Peptide von Stammkonzentration weiter auf 1 ng / ml-Konzentration für MS-Methode Entwicklung (siehe Abschnitt 2.1).
3. Direkt um die Peptide in dem bei optimierten Strömungsgeschwindigkeit Massenspektrometer ziehen lassen (in der Regel 0,1 bis 0,8 ml / min) und mit 0 - 5% Kollisionsenergie.
4. Erwerben Sie MS - Spektrum , um die experimentellen mehrfach geladenen Vorläuferionen ⁸ zu identifizieren. Wählen Sie den Vorläufer-Ion (m / z), die die meiste Intensität (doubly- oder dreifach geladenen Vorläuferionen wird empfohlen) gibt.
5. Reinfundieren das Peptid und anwenden Kollisionsenergie, die das Peptid durch stoßinduzierte Dissoziation (CID) zu fragmentieren. die Kegel und Kollisionsenergien Optimieren Sie die besten Fragmentierungsmuster (Fragmentionen ein- oder zweifach geladen, und die Masse der Fragmentionen vorzugsweise größer als Elternionen, wird empfohlen) zu erhalten.
6. Stellen Sie sicher , dass die experimentell ermittelten Übergänge Übergänge in silico erzeugt entsprechen </ Em> (wie in Schritt 3.1 beschrieben). Speichern Sie die Übergangsliste in der MRM-Methode Datei mindestens 2 intensivsten Übergänge pro Vorläuferionen verwendet wird. Fügen Sie zwei Übergänge: 1 für die Quantifizierung und 1 für die Bestätigung im letzten Test.
   HINWEIS: Einige MS - Hersteller haben eine Funktion (dh Waters Intellistart) für die automatisierte MRM oder SRM - Analyse - Optimierung. Wenn möglich ziehen lassen Peptide mit kombinierten mobilen Phasen bei 50-70% ACN mit 0,1% FA.

4. LC-MRM-Methodenentwicklung

HINWEIS: Analysieren Sie die Mischung aus synthetischen Peptiden durch eine Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) -System gekoppelt Triple-Quadrupol-Massenspektrometer. Achten Sie darauf, die Quelle sauber ist. Lösungsmittel A ist ddH ₂ 0 mit 0,1% FA; Lösungsmittel B wird mit 0,1% FA ACN.

1. Verwenden, um die LC-MS-System, ausgestattet mit einem UPLC Säule, die mit C-18-Phase (1,6 & mgr; m Durchmesser, 90 Å Poren, 2,1 mm x 50 mm Länge) und an einer Vorsäule der gleichen Phase.
2. Defrost CSF verdaut , auf Eis, Zentrifuge bei 16.000 g für 10 Minuten und Transfer 60 ul in 300 ul Glaseinsatz Fläschchen und den Rest bei -20 ^° C lagern zurück
3. Injizieren Sie die höchste Konzentration von Standardkurve Punkt unter Verwendung von 10 min 1-40% ACN linearen Gradienten (siehe Tabelle 1 für Gradienten - Einstellungen)
4. Öffnen Sie das resultierende Chromatogramm und Mitteilungsretentionszeit und oben zwei intensivsten (quantitative) Übergänge pro Peptid alle bestehenden Übergänge in Schritt 3.
5. Basierend auf diesen Informationen aktualisieren 10 min MRM - Methode (erstellt in Schritt 3.6) mit zeitlich Kanäle Peptide zu messen (siehe Abbildung 2 für ein Beispiel). Um die Empfindlichkeit beizubehalten, halten jeden Kanal mit Punkten pro Peak größer als 8 und für jedes Peptid Zeit größer als 0,01 sec für mindestens einen Übergang wohnen.
6. Fügen Sie "Lösungsmittel Verzögerungen" im MRM-Methode: eine am Anfang, bis 10 Sekunden vor dem ersten Peak der Elution undein anderer am Ende des Verfahrens 20 Sekunden nach dem letzten Peak Elution. Tun Sie dies durch "Lösungsmittel Verzögerungen" in Verfahren Ereignisse in MS-Methode Datei auswählen.
7. Führen Sie die Standardkurve durch die MRM Verfahren zeitlich und sicherzustellen, dass es keine störenden unspezifische Spitzen mit Übergängen (erzeugt in Schritt 3.6) von Linearität zu überprüfen.
8. Bestimmen Sie, ob die Peptide nachweisbar läuft nicht mit Spikes gepoolten Kontrolle und Krankheit CSF durch die Methode.
9. Entfernen der Peptide, die unterhalb der Nachweisgrenze des Assays sind.

Abbildung 2 Beispiel einer dynamischen MRM MS Methode. Timed Kanäle von Peptidübergänge können nach etablierten Retentionszeiten gruppiert werden. Aktivieren MRMs in einer zeitlich abgestimmten Art und Weise eingebracht werden, da die ausgewählten Marker-Peptide aus der Chromatographiesäule eluieren, minimiert die Anzahl der transitions über einen Zeitraum und erhöht die Empfindlichkeit des Tests. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

5. Die Zugabe von internen Standards

HINWEIS: Wie bereits ^10, stabilen isotopenmarkierten internen Standards beschrieben sind, können in dem Assay eingeschlossen werden. Aufgrund der Kosten dieser Standards, ist es ratsam, zuerst die Peptide in der Matrix zu bewerten.

1. Bestimmen Sie die ideale Peptide zur Erkennung in CSF optimiert: Wählen Sie die Peptide, die die wiederkehrenden sind, mit der höchsten Intensität und ohne Störspitzen.
2. Design - Peptide entsprechend schwere ¹³ C ¹⁵ N Aminosäure - Etiketten enthalten, die die Masse des Peptids durch mindestens 6 Da in Bezug auf endogene Peptid erhöhen. Fügen Sie außerdem ein Tag von 4 - 6 zusätzliche Aminosäuren entweder an den N- oder C-Terminus der schweren peptide für tryptische Verdauung zu steuern.
3. Verdünnen stabilen isotopenmarkierten internen Standards in Verdauungspuffer (siehe Schritt 2.4). Bestimmen Sie die ideale Menge an stabilen Isotopen-markierten internen Standard, der in CSF versetzt werden, indem in verschiedenen Ebenen Spick in Abhängigkeit von den Abundanzen zuvor während der Entwicklung beobachtet. Ziel ist etwa 1 zu erreichen: 1-Verhältnis von stabilen isotopenmarkierten Standard endogene Peptid.
   HINWEIS: Stabil isotopenmarkierten internen Standards kann durch verschiedene Handelsgesellschaften synthetisiert werden.

6. LC-MRM-Test der CSF Patientenproben

1. Spike optimierte Menge von stabilen isotopenmarkierten Standards in 100 ul CSF und gefrier trocknen Sie die Mischung.
2. Resuspendieren CSF in 20 ul-Digest-Puffer und die Verdauung durchführen wie in den Punkten beschrieben 2,7-2,10.
3. Analysieren Sie die Proben LC-MRM-Methode in Schritt entwickelt unter Verwendung von 4.
4. Für die quantitative Analyse, führen Sie den Standard-pepEbbe und Flut in Konzentrationen von 0 -15 pmol in einer Standardkurve. Siehe Schritt 2.5 zur Herstellung von Standardkurve.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Quantitative Daten basiert auf dem Intensitätsverhältnis von Basisspitzen internen Standards (schwere markierte Peptide). Detaillierte Informationen zu SRM / MRM Datenanalyse wurde zuvor beschrieben ^10. Verhältnisdaten können dann in einer Standardkurve verwendet werden absolute Ebenen zu bestimmen oder sie von der zusätzlichen Konzentration an Schwer-markiertem Peptid berechnen.

1. Analysieren LC-MRM Daten der Massenspektrometern Hersteller Standardsoftware ¹⁰ verwendet wird . Alternativ können Sie Skyline Software ¹⁰ quantitative MRM Daten zu analysieren.
2. Überprüfen Sie die Empfindlichkeit des Laufs durch die Reaktion eines internen Standards überprüft, wie die Stachel Hefe Enolase oder einem stabilen isotopenmarkierten Standard in jedem Lauf. Sicherzustellen, dass der Variationskoeffizient (CV) nicht größer ist als25%.
3. Sie manuell die Daten Anmerkung überprüfen Genauigkeit zu gewährleisten. Analysieren jedes Peptid und das Verhältnis zu einem geeigneten stabilen isotopenmarkierten internen Standards, das heißt, verwenden Sie das stabile Isotop-markierte Version des Peptids , falls verfügbar.
4. Zur Erzielung absoluten Werte von pmol pro 100 ul CSF, führen Sie das Verhältnisdaten durch geeignete Standardkurven, die zur gleichen Zeit ausgeführt wurden.
5. Berechnen der Variationskoeffizient (CV). CV für jedes Peptid sollte unter 25% und unter 15% für hohe reichlich Peptide sein.
   HINWEIS: Absolutwert pmol pro 100 ul CSF-Werte können in den nachfolgenden Downstream statistische Analyse verwendet.

8. Apolipoprotein E Isoform-Status

HINWEIS: ApoE Isoform-Status zu bestimmen, kann die Anwesenheit der entsprechenden Peptide durch die Bestimmung der Anwesenheit jeder Isoform durchgeführt werden.

1. Betrachten Sie die ApoE in 100 ul CSF Schwelle von> 1.000 Signal-zu-Rauschen als positiv für das Peptid. Siehe Abbildung 5 für die Peptide erforderlich / abwesend eines Patienten Isoform - Status zu bestimmen. Bestimmen Sie die Allel-Expression durch die% jeder Isoform Berechnung ApoE-Expression insgesamt.

Ergebnisse

Unter Verwendung des oben beschriebenen Verfahrens, ein hoher Durchsatz 10 min Multiplex - Assay bestehend aus 74 Peptiden , die aus 54 - Proteine entwickelt wurde, als ein Assay für Marker der neurodegenerative Erkrankungen Alzheimer-Krankheit und Lewy - Körperchen - Demenz (LBD) ^8. 3 zeigt eine Multiplex - Chromatogramm erschienen zuvor ⁸ der signifikanten Peptidmarker aus dem Assay. Die Peptide in dem Assay und deren quantitative Übergänge enthal...

Diskussion

Wie bei allen MS basierenden Assays sind die kritischen Schritte in dem Verfahren der Bestimmung der geeigneten und genauen Mengen von internen Standards. Wenn absolute Quantifizierung verwendet wird, dann sind die richtigen Mengen an Stachel Peptide in der Standardkurve sind ebenfalls entscheidend.

Unser Test erfordert nicht die Fällung des CSF oder die Verwendung von jeder Art von Sanierung oder Entsalzen Schritte vor der MS-Analyse - es ist eine völlig Eintopfreaktion Verfahren. Aufgrund ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Acetonitril (ACN), LC-MS-Qualität	Fisher	A955-1
Ameisensäure, LC-MS-Qualität,	Fisher	A117-50
Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D5545 - 5 g
Salzsäure, 37 Gew.-%	VWR	BDH3028 - 2,5 LG
Iodacetamid	Sigma	I1149 - 5 g
Natriumhydroxid (NaOH)	Fisher	S318-500
Trypsin, Sequenzierqualität, modifiziert	Promega	V5113
Trifluoressigsäure (TFA), LC-MS Qualität	Fisher	A116-50
Harnstoff	Sigma	U0631- 500 g
Wasser, LC-MS ULTRA Chromasolv	Fluka	14263
Benutzerdefinierte synthetisierte Peptide entsalzt 1-4 mg	Genscript	benutzerdefinierte
stark markierte Aminosäure [13C; 15N] benutzerdefinierte Peptide	Genscript	benutzerdefinierte
ASB 14	Merck Millipore	182750 - 25 g
Thioharnstoff	Sigma	T7875 - 500 g
Tris-Base	Sigma	T6066
VanGuard Vorsäule	Waters	186007125
Cortecs UPLC C18 + 1.6 μ M  2,1 x 50 mm Säule	Wasser	186007114
Hefe Enolase	Sigma	E6126
300 μ l klare Glasfläschchen mit Schraubverschluss	Fisher scientific	03-FISV
Y Schlitz-Schraubverschlüsse	Fisher scientific	9SCK-(B)-ST1X
Gefriertrockner	Edwards Mudulyo	Mudulyo system
Konzentrator/Drehzahlvakuum	Eppendof	Konzentrator  plus 5301
Xevo -TQ-S Massenspektrometer	Waters
Acquity UPLC System	Waters