Generation of Two-color Antigen-Mikroarrays für den gleichzeitigen Nachweis von IgG und IgM-Autoantikörper

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine Methode zur Erzeugung anpassbarer Antigen-Microarrays, die für den gleichzeitigen Nachweis von Serum-IgG- und IgM-Autoantikörpern von Menschen und Mäusen verwendet werden können. Diese Arrays ermöglichen den quantitativen Hochdurchsatznachweis von Antikörpern gegen beliebige Antigene oder Epitope von Interesse.

Zusammenfassung

Autoantikörper, also Antikörper gegen Selbstantigene, sind in vielen Krankheitszuständen vorhanden und können als Marker für die Krankheitsaktivität dienen. Der Gehalt an Autoantikörpern gegen bestimmte Antigene wird in der Regel mit der ELISA-Technik (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) nachgewiesen. Das Screening auf mehrere Autoantikörper mit ELISA kann jedoch zeitaufwändig sein und erfordert eine große Menge an Patientenproben. Die Antigen-Microarray-Technik ist eine alternative Methode, mit der Multiplex-Verfahren auf Autoantikörper untersucht werden kann. Bei dieser Technik werden Antigene mit einem robotischen Microarrayer auf speziell beschichtete Objektträger aufgebracht. Die Objektträger werden mit Serumproben des Patienten untersucht und anschließend fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzugefügt, um die Bindung von Serum-Autoantikörpern an die Antigene nachzuweisen. Die Autoantikörper-Reaktivitäten werden durch Scannen der Objektträger mit einem Scanner, der Fluoreszenzsignale erkennen kann, aufgedeckt und quantifiziert. Hier beschreiben wir Methoden zur Generierung von benutzerdefinierten Antigen-Microarrays. Unsere aktuellen Arrays werden mit 9 massiven Pins gedruckt und können bis zu 162 Antigene enthalten, die in doppelter Ausführung entdeckt wurden. Die Arrays können leicht angepasst werden, indem die Antigene in der Quellplatte, die vom Microarrayer verwendet wird, geändert werden. Wir haben ein zweifarbiges Sekundärantikörper-Nachweisschema entwickelt, das IgG- und IgM-Reaktivitäten auf derselben Objektträgeroberfläche unterscheiden kann. Das Nachweissystem wurde optimiert, um die Bindung von humanen und murinen Autoantikörpern zu untersuchen.

Einleitung

Autoantikörper sind in vielen Krankheitszuständen vorhanden und können oft eine direkte pathogene Aktivität haben¹. Die Identifizierung von Autoantikörpern ist wichtig für die Diagnose bestimmter Krankheiten, für die Prognose des Krankheitsverlaufs und für die Klassifizierung von Patienten, die von spezifischen Therapien profitieren können². Autoantikörper werden in der Regel im Patientenserum mit der ELISA-Technik identifiziert; Das Screening auf mehrere Antigene mit dieser Technik ist jedoch mühsam und verbraucht eine große Menge an Patientenproben. Daher sind neue Technologien erforderlich, um Autoantikörper in größerem Maßstab zu profilieren.

Die Antigen-Microarray-Technik ist eine Proteom-Technologie, die es ermöglicht, Autoantikörper in einer Multiplex-Weise zu profilieren³. Im ersten Schritt dieses Prozesses wird eine Antigenbibliothek mit Hilfe eines robotischen Microarrayers auf eine Objektträgeroberfläche aufgeblasen. Die Objektträger werden mit verdünntem Serum untersucht und dann fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper hinzugefügt. Antikörperreaktivitäten werden durch Scannen der Objektträger mit einem Microarray-Scanner visualisiert und durch Fluoreszenzintensitäten quantifiziert. Antigen-Microarrays bieten gegenüber der ELISA-Technik mehrere Vorteile beim Screening auf Autoantikörper: 1) Sie benötigen nur Mikroliter Serum, um Autoantikörper gegen mehrere Antigene gleichzeitig zu profilieren, 2) sie verwenden Antigene sparsam, da nur Nanoliter des Antigens auf die Arrays aufgedeckt werden, 3) sie haben eine erhöhte Sensitivität³ im Vergleich zu ELISA und 4) sie ermöglichen die gleichzeitige, Separater Nachweis von mehr als einem Antikörper-Isotyp. Antigen-Microarrays wurden verwendet, um Autoantikörper bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose und systemischem Lupus erythematodes^4-6 zu profilieren. Bei allen drei Erkrankungen wurden neue Erkenntnisse über die Pathogenese der Krankheit gewonnen, indem Autoantikörper in großem Maßstab mit den Arrays profiliert wurden.

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von Antigen-Microarrays mit Nitrocellulose-beschichteten Objektträgern. Eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Proteinen, Peptiden und Zelllysaten, können mit dieser Technik auf den Objektträgern angeordnet werden. Die Arrays können leicht angepasst werden, indem Antigene von Interesse in die Quellplatte aufgenommen werden, die die Antigenbibliothek enthält. Darüber hinaus zeigen wir, wie ein Paar von Sekundärantikörpern verwendet werden kann, um IgG- und IgM-Reaktivitäten auf derselben Objektträgeroberfläche zu trennen. Wir haben diese Technik nun optimiert, um Autoantikörper sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen zu messen.

Protokoll

1. Diluting Antigene und Generierung von Antigen-Mikroarrays

1. Verdünnte Antigene in PBS auf eine Endkonzentration von 0,2 mg / ml. Drucken Sie bis zu 162 einzigartige Antigene in zweifacher Ausfertigung mit einer Microarrayers Konfiguration mit 9 Pins. Umfassen IgG- und IgM-Antigene in den Antigen-Bibliothek als positive Kontrollen. Umfassen PBS nur als negative Kontrolle.
2. In 20 ul jedes Antigen an die 384-Well-Source-Platte. In Antigene an der Source - Platte in Gruppen, die den Aufbau des Druckkopf spiegeln (zB ordnen Antigene in Gruppen von 9 , wenn 9 Pins für den Druck verwendet werden).
3. Abdeckung Source-Platte mit Folie und Einfrieren bei -80 ° C bis bereit Arrays zu drucken.
4. Reinigen Sie feste Microarrayers Stifte, indem sie in einem Ultraschallbad mit VE-Wasser für 3 x 1 min inkubiert. Platz Stifte in Rack zu trocknen und dann Stifte in Microarray-Druckkopf anordnen. Für 9-polig, mit einem 3 x 3-Konfiguration.
5. Programm Microarrayers für den Druck laufen nach Anzahl Pins auf Druckkopfeinstellung,Anzahl der Folien auf jeder Folie Anzahl der Kissen und die Anzahl der Wiederholungs spots für jedes Antigen zu drucken. Normalerweise verwenden 9-polig, 70 Rutschen, 2 Pads / Rutsche und zwei Wiederholungsspots für jedes Antigen. Programm Microarrayers zu beschallen pins in Wasser zwischen verschiedenen Gruppen von Antigenen.
6. Thaw Source-Platte und dann Zentrifuge Platte für 1 min bei 100 x g. Platzieren Sie Quellenplatte in dafür vorgesehenen Stelle in Microarrayers. Entfernen Sie den Abschnitt der Folie, die die erste Gruppe von Antigenen bedeckt gedruckt werden.
7. Vereinbaren ungedruckten gleitet auf Arrayers Oberfläche und Laufdruckprogramm. Drucken von Folien bei RT mit Feuchtigkeit setzen auf der Arrayers bei 55-60% mit dem eingebauten Luftbefeuchter der Array-Maschine.
8. Nachdem jede Gruppe von Antigenen auf alle Folien gedruckt wird, unterbrechen Sie die Microarrayers. Decken Sie die Antigene, die wurden nur mit Folie gedruckt (zur Verhinderung von Verdunstung) und entdecken die nächste Gruppe von Antigenen gedruckt werden. Weiter Druckprogramm.
9. Nachdem alle Antigene gedruckt wurden, decken Quelle plaß mit neuen Stück Folie und Einfrieren bei -80 ° C. Legen Sie gedruckte Folien in Gleitkastens und Vakuumdichtung. Die Objektträger können am nächsten Tag verwendet werden oder bis zu einen Monat später.

2. Probing Antigen-Mikroarrays mit verdünntem Sera

1. Die Objektträger in Rahmen mit Inkubationskammern. Hinzufügen, 700 & mgr; l Blockierungspuffer (2,5% [vol / vol] fötalem Kälberserum (FCS), 0,1% [v / v] Tween 20 in PBS) zu jeder Array-Oberfläche.
2. Platzieren Klebefolie über Rahmen und in einem verschlossenen Behälter mit einem Stück feuchten Tuchs. Inkubieren O / N bei 4 ° C auf einer Wippe.
3. Verdünnte Serumproben 1: 100 in Blockierungspuffer. Absaugen Blocking-Lösung von Arrays und 500 ul verdünnte Probe zu jedem Array-Oberfläche hinzuzufügen.
4. Mit Klebefolie abdecken und Inkubation für 1 Stunde bei 4 ° C mit Schaukeln.
5. Verdünnen Sekundärantikörper in Blocking-Puffer. Für Humanstudien, verdünntem eine Cy3 markiertes Ziegen anti-human IgG-Antikörpers auf 0,33 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-human IgM-Antikörper 0,25 ug / ml. Für Maus-Studien, verdünntem a Cy3 Ziege-anti-Maus-IgG-Antikörper auf 0,38 & mgr; g / ml und einem Cy5 markierten Ziege-anti-Maus IgM Antikörper auf 0,7 & mgr; g / ml markiert.
6. Aspirat Proben von Arrays und Array spülen Oberflächen 4mal mit Spülpuffer (0,1% Tween 20 in PBS). Gieße auf, um Dias Puffer und schnell wegwedeln.
7. In 700 l Blocking-Puffer jedes Array-Oberfläche zu waschen und 10 min bei RT inkubieren mit Schaukeln. Wiederholen Waschschritt zwei weitere Male.
8. In 500 ul verdünnt sekundären Antikörper zu jeder Gleitfläche und Abdeckung mit Klebefolie. Inkubiere 45 Minuten bei 4 ° C unter Schütteln.
9. Absaugen sekundären Antikörper Mischung aus Dias und 4 mal spülen, wie oben. Wasch gleitet 3-mal mit 700 & mgr; l Blockierungs / Verdünnungspuffer wie oben.
10. Die Objektträger aus Rahmen und in Metallschlitten-Rack, das in PBS eingetaucht ist. Inkubieren 20 min bei RT mit orbitalen Schütteln. Der Platz im neuen Container von PBS und Inkubation weitere 20 min unter Schütteln.
11. Den Objektträger-Rack in Behälter von entsalztem Wasser 15 sec. Legen Sie Rack in einem neuen Behälter mit Wasser und Inkubation weitere 15 sec.
12. Um trockene Rutschen, Platz Dia-Rack auf einem ELISA-Plattenadapter in Zentrifuge und Spin bei 220 × g für 5 min bei RT.
13. Die Objektträger in lichtdichten Box bis zum Scannen bereit.

3. Scannen Antigen-Mikroarrays und Exportieren von Daten

1. Scannen von Dias einen Microarray-Scanner verwenden, die Cy3 und Cy5 Fluoreszenzsignale erkennen kann. Um die Fotovervielfacherröhre (PMT) Ebenen des Scanners, Pre-Scan eine Folie einzustellen, die nur mit sekundären Antikörpern sondiert wurde.
   Hinweis: Diese Folie, um das vollständige Antigen-Bibliothek auf sie einschließlich positiv (IgG und IgM) sowie negative (PBS) Kontrollen gedruckt haben sollte. Die Pre-Scan ist eine niedrige Auflösung scannen, die dem Benutzer ermöglicht, schnell die optimale PMT-Einstellungen zu finden.
2. Stellen Sie die PMT-Werte, so dass die menschliche IgG-Features (auf dem Cy3-Kanal) und das Brummenein IgM-Features (auf dem Cy5-Kanal) haben eine ähnliche mittlere Fluoreszenzintensität minus Hintergrund (MFI-B) (typischerweise 40.000). Die PMT Ebenen werden durch Drücken der "Hardware" Taste eingestellt. Einmal eingestellt, halten Sie diese PMT-Einstellungen konstant.
3. Scannen Sie die experimentellen Dias auf den beiden Kanälen durch die "Scan" -Taste drücken. Speichern Sie die Dia-Bilder (beide Kanäle) nach jedem Scan.
4. Legen Sie die Folie werden in der Microarray-Software analysiert, indem die "Datei" Taste.
5. Laden Sie die Gen-Array-Liste (GAL) Datei, indem Sie die "Datei" Taste. Die GAL-Datei hat das Layout des Arrays mit den Identitäten der Array-Funktionen.
6. Platzieren des Arrays Schablone über dem gescannten Bild so, dass die Arrays Merkmale der Vorlage möglichst genau übereinstimmen.
7. Richten Sie Funktionen in allen Blöcken mit der Vorlage durch die "align" Taste drücken. Das Programm wird im allgemeinen die Kontur der Kreis Merkmale finden aber einige manuelle Anpassungen erforderlich sein können,. Diese Einstellungen können durch Eingabe der Feature-Modus vorgenommen werden. Die Software wird dann eine MFI-B für jedes der Antigene berechnen.
8. Verwenden Sie die "Datei", um diese Ergebnisse als eine Textdatei zu exportieren.

4. Analysieren Array Daten Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM)

1. Legen Sie einzelne Textdateien in Excel und identifizieren Sie die Spalten, die MFI-B für die Cy3 und Cy5-Kanälen.
2. Berechnen Sie den Durchschnitt der doppelten Funktionen.
3. Für jede negative MFI-B, ersetzen die negative Zahl mit 10 Daten-Transformation von rohen MFI-B durch 100 dividiert und dann durch log Basis 2 berechnet wird.
4. Analysieren Sie log transformierten Daten mit Bedeutung Analyse von Microarrays (SAM) , wie zuvor ⁷ beschrieben.
5. Für eine Studie mit zwei Gruppen (zB gesunde Kontrollen vs. Patienten), Etikett einer Gruppe "1" und die Gruppe "2." Verwenden Sie eine Zwei-Klassen, ungepaarten Analyse in SAM auf Antigene zu identifizieren, die Reaktivitäten significantly unterschiedlich zwischen den beiden Gruppen (q-Wert <0,05).
6. Verwenden Sie Clustering und Wärme-Kartenerzeugungs Software machen Bilder für die Präsentation ^8.

Ergebnisse

Antigene werden in einer 384 - Well - Platte und auf Objektträger gedruckt von einem Roboter Microarrayers angeordnet , wie in 1 gezeigt ist , Fig . 2 gleitet in einem Rahmen mit Inkubationskammern und einem abgetasteten Objektträger nach der Verarbeitung plaziert zeigt, Fig . 3 zeigt , positive und negative Kontrollobjektträger. Der negative Schieber nur mit sekundären Antikörpern sondiert, und die posi...

Diskussion

Das hier beschriebene Protokoll ermöglicht die Quantifizierung der Autoantikörper, die das Antigen Microarray-Technik verwendet wird. Antigen-Mikroarrays bieten mehrere Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISA in für Autoantikörper-Screening. Zunächst einmal eine Vielzahl von Antigenen, einschließlich Nukleinsäuren, Proteine, Peptide und Zelllysate können auf die Nitrocellulose beschichtete Objektträger angeordnet werden, so dass für gemultiplexte Screening von Autoantikörpern ermöglicht. Darüber hinaus sind nur Mikrogram...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Ribosomales P0	Diarect	14100	verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS
humanem IgG	Jackson Immuno	009-000-003	verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS
human IgM	Jackson Immuno	009-000-012	verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS
Maus IgG	Sigma-Aldrich	I5381	verdünnt auf 0,2 mg/ml in PBS
Maus IgM	Biolegend	401601	Verdünnung auf 0,2 mg/ml in
doppelsträngiger PBS-DNA	Sigma-Aldrich	D1626	Verdünnung auf 0,2 mg/ml in
einzelsträngiger PBS-DNA	Sigma-Aldrich	D8899	Verdünnung auf 0,2 mg/ml in PBS-Microarrayer
	Virtek	VersArray Chipwriter Pro	Viele Arten von Arrayern eignen sich für
feste Druckstifte	Arrayit Corporation	SSP015
Software für den robotischen Microarrayer	Virtek	Chipwriter Pro
FAST Objektträger (2 Pads)	GVS Northa America	10485317
FAST Rahmen	GVS Northa America	10486001
FAST Inkubationskammern (2 Pads)	GVS Northa America	10486242
384 Well Platten	Whatman	7701-5101
Plattenversiegeler	VWR	60941-062
Folienplattenabdeckungen	VWR	60941-124
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-500
Fötales Kälberserum	Invitrogen	12483020
Cy3 Ziege anti-human IgG	Jackson Immuno	109-165-096	verwenden Arbeitsmaterial in 50% Glyercol
Cy5 Ziege anti-human IgM	Jackson Immuno	109-175-129	verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol
Cy3 Ziege Anti-Maus IgG	Jackson Immuno	115-165-071	verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol
Cy5 Ziege Anti-Maus IgM	Jackson Immuno	115-175-075	verwenden Arbeitsmaterial in 50% glyercol
Microarray Scanner	Molecular Devices	Axon 4200A
Microarray Software	Molecular Devices	Genepix 6.1
Clustering Software	eisenlab.org	Cluster 3.0
Heatmap-Software	eisenlab.org	Treeview 1.60
Microarray-Statistiksoftware	Stanford University	SAM 4.0 (Signifikanzanalyse von Microarrays)