Methodenartikel

Antikörpermarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen unter Verwendung von magnetischen Protein A und Protein G-Kügelchen

11.6K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/54545

⸱

15. September 2016

 ,  , 
1Promega Corporation

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die on-bead-Verfahren zum Nachweis von Antikörpern mit kleinen Molekülen Kennzeichnung ermöglicht die Kennzeichnung von einer geringen Menge an Antikörper direkt aus Zellmedien. Dieses Verfahren ist kompatibel mit Amin und Thiolchemie und kann mehrere Proben parallel, manuell oder mit automatisierten Systemen verarbeiten.

Zusammenfassung

Antikörper, markiert mit kleinen Molekülen, wie fluoreszierende Farbstoffe, Zytostatika, und radioaktive Tracer sind wesentliche Instrumente in der biomedizinischen Forschung, der Immundiagnostik und in jüngerer Zeit als therapeutische Wirkstoffe. Herkömmliche Verfahren zur Markierung von Antikörpern mit kleinen Molekülen erfordern Antikörper in relativ hoher Konzentration, beinhalten mehrere Dialyseschritte gereinigt und haben eine begrenzte Durchsatz. Jedoch mehrere Anwendungen, einschließlich dem Gebiet der Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs), werden von den neuen Methoden profitieren, die Markierung von Antikörpern direkt von Zellmedien ermöglicht. in biologisch relevanten Assays gescreent werden, beispielsweise der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper-Assay im Falle von ADCs Solche Verfahren können Antikörper ermöglichen. Hier beschreiben wir ein Verfahren (on-bead-Methode), die Etikettierung von kleinen Mengen von Antikörpern direkt aus Zellmedien ermöglicht. Dieser Ansatz nutzt hohe Kapazität magnetischen Protein A und Protein G Affinitätsbeads Antikörper zu erfassenaus den Zellmedien durch Markierung mit kleinen Molekülen, gefolgt entweder Amin- oder Thiol-Chemie und anschließende Elution der markierten Antikörper verwendet. Unter Fluoreszenzfarbstoffe als Surrogate für kleine Moleküle, zeigen wir die On-Bead-Kennzeichnung von drei verschiedenen Maus-Antikörper direkt aus Zellmedien sowohl Amin und Thiol Markierungschemie verwendet wird. Die hohe Bindungsaffinität von Antikörpern an Protein A und Protein G sorgt für eine hohe Wiederfindungsraten sowie hoher Reinheit der markierten Antikörper. Darüber hinaus ermöglicht die Verwendung von magnetischen Kügelchen mehrere Proben manuell, wodurch deutlich Kennzeichnungs Durchsatz verbessert behandelt werden.

Einleitung

Antikörper , markiert mit kleinen Molekülen sind vielleicht die am häufigsten verwendeten Reagenzien in der Biologie 1,2. Antikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte und Biotin werden in großem Umfang in der Bildgebung, Immunoassays, Durchflusszytometrie, Western - Blots und Immunpräzipitation unter anderen Anwendungen 3-6. Radioaktiv markierte Antikörper 3,7 finden umfangreiche Verwendung in der Bildgebung und Therapie, markierte Antikörper mit Zytostatika (ADCs) bieten neue Möglichkeiten für die Behandlung von Krebs und zwei ADCs wurden bereits für den therapeutischen Einsatz 8 genehmigt. Trotz einer umfassenden Nutzung haben sich die Verfahren zur Markierung von Antikörpern blieb überraschenderweise unverändert und beinhalten typischerweise mehrere Reaktionen und Entsalzung Schritte 9-12. Lösungsmethoden arbeiten sehr gut in Fällen, in denen nur wenige Antikörper müssen gekennzeichnet werden und in gereinigter Form zur Verfügung stehen hoch in hoher Konzentration und in ausreichender Menge. Jedoch für neuere Anwendungen wie ADCs gibt es einAntikörper müssen in der frühen Stufe Hybridom zu etikettieren , so dass sie für biologisch relevante Eigenschaften gescreent werden, beispielsweise rezeptorvermittelte Internalisierung Antikörper 13-16. Bei dem Hybridom Stadium sind Probenvolumina begrenzt, Antikörper werden in niedrigen Konzentrationen exprimiert und eine Anzahl von Proben sind groß, daher Lösung auf Basis Markierungsmethoden sind nicht geeignet.

Zur Vereinfachung und den Durchsatz der traditionellen Antikörpermarkierung Methoden zu verbessern, einige alternative Ansätze wurden 17,18 vorgeschlagen. Ein Ansatz ist es nicht magnetischen Protein-A-Affinitätskügelchen in kleine Säulen gepackt zu verwenden, um Antikörper, gefolgt von der Markierungsreaktion und Elution von markiertem und gereinigtem Protein erfassen. Dieses Verfahren verwendet werden, die Antikörper direkt aus Zellmedien zu beschriften, jedoch kann die Verwendung von Säulen umständlich sein. Ein magnetisches bead basierte Methode wurde kürzlich berichtet worden , 19 daß die Verwendung von Spalten eliminiert und verbessert den Durchsatz , aber wegender begrenzten Antikörperkapazität der Beads Bindung nur Nanogramm bis niedrigen Mikrogramm-Mengen der Antikörper markiert werden.

Wir haben vor kurzem entwickelt und verwendet hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen (> 20 mg Human - IgG / ml des abgesetzten Kügelchen) 20 - Antikörpern in Zellmedien mit kleinen Molekülen zu markieren. Die hohe Kapazität der Kügelchen ermöglicht zehn bis hundert Mikrogramm Antikörper bequem gekennzeichnet werden und die schnelle magnetische Reaktion der Kügelchen vereinfacht die Handhabung und Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben in parallel. Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen als Surrogate für kleine Moleküle zeigen wir, dass das Verfahren mit dem Amin und Thiol Markierungschemie kompatibel und bietet eine hohe Gewinnungsraten von markierten und sehr reine Antikörper.

Dieses Protokoll und die zugehörigen Video beschreiben On-Bead-Kennzeichnung von Maus-Antikörper, die in den Zellmedien Magnetic Protein A und Protein G-Kügelchen verwendet wird. Das Protokoll istgliedert sich in vier Abschnitte: Abschnitt 1 beschreibt die Erfassung von Antikörpern auf den Wulst aus biologischen Proben. Nach Erfassung der Markierung von Antikörpern mit Fluoreszenzfarbstoff Aminchemie oder Thiolchemie verwendet, ist in den Abschnitten 2 und Abschnitt 3 beschrieben sind. Schließlich Abschnitt 4 beschreibt das Verfahren zur Berechnung der Antikörperkonzentration und der Farbstoff-Antikörper-Verhältnis.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

1. Antikörper-Capture auf High Capacity Magnetic Protein A oder Protein G Magnetic Beads

  1. Einheitlich resuspendieren magnetische Kügelchen durch leichtes Schütteln. Halten Sie die Suspension gleichmäßig, wenn Aliquotierung Perlen.
  2. Je 50 ul Kügelchenaufschlämmung in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Sie vorsichtig den Speicherpuffer zu entfernen.
  3. In 250 ul Antikörper-Bindungspuffer.
  4. Mischen Sie und legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Sie vorsichtig den Bindungspuffer zu entfernen.
  5. 1,0 ml der Probe, die 50-100 ug Antikörper an die Kügelchen. Die Proben können Antikörper oder Antikörper in Zellmedien gereinigt werden.
  6. Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer.
  7. Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
  8. In 250 ul Antikörper-Bindungs ​​/ Waschpuffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Bindung / Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Vorgang step für insgesamt zwei Waschungen.
  9. Fahren Sie mit Abschnitt 2 Etikett unter Verwendung von Antikörpern Aminchemie oder in Abschnitt 3 zur Kennzeichnung von Antikörpern Thiolchemie.

2. Antikörpermarkierung Mit Amine Chemie

  1. Konjugatantikörper
    1. 100 l Amin Konjugationspuffer an die Kügelchen.
    2. Lösen die aminreaktive Fluoreszenzfarbstoffe (AlexaFluor 532-SE) bei 10 mg / ml durch Zugabe von 100 & mgr; l Dimethylsulfoxid (DMSO) bis 1,0 mg Farbstoff. Mix von Verwirbelung. Machen Sie diese Lösung kurz vor dem Gebrauch.
    3. Hinzufügen, 2,5 ul aminreaktiven Farbstoff für 100 ug Antikörper.
      Anmerkung: In der Regel eine 5-20 molarer Überschuß an Reaktivfarbstoff empfohlen. Jedoch zugegebene Menge an Reaktivfarbstoff auf die Reaktions empirisch optimiert werden muss, je nach gewünschten Farbstoff-Antikörper-Verhältnis und intrinsische Antikörpereigenschaften.
    4. Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in suspensio bleibenn.
    5. Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
    6. In 250 ul Antikörper-Bindungs ​​/ Waschpuffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen und entsorgen Bindung / Waschpuffer. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen.
  2. Antikörper Rettung
    1. In 50 ul Elutionspuffer an die Kügelchen.
    2. Mischen Sie für 5 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben.
    3. Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen eluierten Probe und Transfer in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, die 5 & mgr; l Neutralisationspuffer.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal und bündeln die eluierten Proben.
    5. Quantifizieren der Antikörperkonzentration und Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis, wie in Abschnitt 4 beschrieben.

3. Antikörpermarkierung Mit Thiolchemie

  1. Antikörper Reduction
    1. In 250 ulvon Thiolkonjugation Puffer und Mix. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie den Puffer zu verwerfen. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
    2. 100 l Thiolkonjugation Puffer.
    3. Hinzufügen, Dithiothreitol (DTT) auf eine Endkonzentration von 2,5 mM.
    4. Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben.
    5. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und den Puffer zu verwerfen.
    6. In 250 ul Thiolkonjugation Puffer und mischen. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie den Puffer zu verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen.
    7. 100 l Thiolkonjugation Puffer.
  2. Konjugatantikörper
    1. Man löst den Thiol-reaktiven Farbstoff bei 10 mg / ml durch Zugabe von 100 & mgr; l DMSO zu 1,0 mg Farbstoff. Mix von Verwirbelung. Machen Sie diese Lösung kurz vor dem Gebrauch.
    2. Hinzufügen, 2,5 ul thiol-Reaktivfarbstoff für 100 ug antiKörper.
      Anmerkung: In der Regel eine 5-20 molarer Überschuß an Reaktivfarbstoff empfohlen. Jedoch zugegebene Menge an Reaktivfarbstoff auf die Reaktions empirisch optimiert werden muss, je nach gewünschten Farbstoff-Antikörper-Verhältnis und intrinsische Antikörpereigenschaften.
    3. Mix Probe für 60 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben.
    4. Das Röhrchen wird in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und entfernen Sie den Überstand.
    5. In 250 ul Thiolkonjugation Puffer und mischen. Legen Sie in dem magnetischen Ständer für 10 Sekunden und den Puffer zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt für insgesamt zwei Wäschen.
  3. Eluieren Antikörper
    1. In 50 ul Elutionspuffer an die Kügelchen.
    2. Mischen Sie für 5 min bei RT mit einem Vortex-Mischer oder End-Over-End-Mixer. Stellen Sie sicher, dass die Perlen in Suspension bleiben.
    3. Das Röhrchen in den magnetischen Ständer für 10 Sekunden. Entfernen Sie eluierten Probe und in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen, das 5 ul neutralization Puffer.
    4. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal und bündeln die eluierten Proben.
    5. Quantifizieren der Antikörperkonzentration und Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis, wie in Abschnitt 4 beschrieben.

4. Berechnen Dye-zu-Antikörper-Verhältnis

  1. Messen der Extinktion des Antikörper-Farbstoff-Konjugat bei 280 nm (A280) und an der & lambda; max für den Farbstoff (Amax).
  2. Berechnen Sie die Antikörperkonzentration:
    Antikörper - Konzentration (mg / ml) = A280 - (A max × CF) / 1,4
    wo CF = Korrekturfaktor des Farbstoffes (vom Hersteller zur Verfügung gestellt).
  3. Berechnen Sie den Farbstoff-zu-Antikörper-Verhältnis:
    Farbstoff-zu-Antikörper - Verhältnis (DAR) = (a max × 150.000) / Ab - Konzentration (mg / ml) × ε Farbstoff
    wobei ε = Farbstoff der Extinktionskoeffizient des Farbstoffs an seinem Absorptionsmaximum und das Molekulargewicht des Antikörpers = 150000 Da.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Eine schematische für Antikörper mit kleinen Molekülen unter Verwendung von hoher Kapazität magnetischen Protein A und Protein G - Kügelchen Kennzeichnung ist in Abbildung 1 dargestellt. Antibodies auf dem magnetischen Protein G - Kügelchen eingefangen kann mit kleinen Molekülen markiert werden, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe, entweder Aminchemie , die Etiketten primäre Amine der Lysin Aminosäuren oder unter Verwendung von Thiol-Chemie, die bei den reduzierten Thio...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Das Ziel dieser Studie war es, ein Verfahren zu entwickeln, Antikörper, die in dem Zellmedium in geringen Konzentrationen, mit einer Vielzahl von kleinen Molekülen zu markieren. Ein derartiges Verfahren, eine große Anzahl von Antikörpern, während der frühen Phasen der Antikörper Entdeckung ermöglicht, mit kleinen Molekülen und gesiebt unter Verwendung eines biologisch relevanten Test gekennzeichnet werden. Ein solcher Assay ist der Rezeptor-vermittelten Internalisierung Antikörper Assay wo Internalisierung zwischen Anti...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren sind Mitarbeiter der Promega Corporation.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Magne Protein A PerlenPromega Corporation  G8781
Magne Protein G PerlenPromega Corporation   G7471
AlexaFluor 532-SE (Succinimidylester)Life TechnologiesA20001
AlexaFluor 532-ME (Malemid)Life TechnologiesA10255
AlexaFluor 647-ME (Maleimid)Life TechnologiesA20347
Fluorescein-ME (Maleimid)Life TechnologiesF-150
Magnetisches StativPromegaNr. Z5332

Referenzen

  1. Colwill, K., Graslund, S. Renewable Binder Working Group. A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome. Nat Methods. 8 (7), 551-558 (2011).
  2. Silverstein, A. M. Labeled antigens and antibodies: the evolution of magic markers and magic bullets. Nat Immunol. 5 (12), 1211-1217 (2004).
  3. Day, J. J., et al. Chemically modified antibodies as diagnostic imaging agents. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 803-809 (2010).
  4. Cunningham, R. E. Overview of flow cytometry and fluorescent probes for flow cytometry. Methods Mol Biol. 588, 319-326 (2010).
  5. Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. J Vis Exp. (93), e52099(2014).
  6. Dundas, C. M., Demonte, D., Park, S. Streptavidin-biotin technology: improvements and innovations in chemical and biological applications. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (21), 9343-9353 (2013).
  7. Kraeber-Bodere, F., et al. Radioimmunoconjugates for the treatment of cancer. Semin Oncol. 41 (5), 613-622 (2014).
  8. Leal, M., et al. Antibody-drug conjugates: an emerging modality for the treatment of cancer. Ann N Y Acad Sci. 1321, 41-54 (2014).
  9. Drachman, J. G., Senter, P. D. Antibody-drug conjugates: the chemistry behind empowering antibodies to fight cancer. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2013, 306-310 (2013).
  10. Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques. , Academic Press. 380-382 (1996).
  11. Shrestha, D., Bagosi, A., Szollosi, J., Jenei, A. Comparative study of the three different fluorophore antibody conjugation strategies. Anal Bioanal Chem. 404 (5), 1449-1463 (2012).
  12. Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
  13. Isa, M., et al. High-throughput screening system to identify small molecules that induce internalization and degradation of HER2. ACS Chem Biol. 9 (10), 2237-2241 (2014).
  14. Liao-Chan, S., et al. Quantitative assessment of antibody internalization with novel monoclonal antibodies against Alexa fluorophores. PLoS One. 10 (4), e0124708(2015).
  15. Riedl, T., van Boxtel, E., Bosch, M., Parren, P. W., Gerritsen, A. F. High-Throughput Screening for Internalizing Antibodies by Homogeneous Fluorescence Imaging of a pH-Activated Probe. J Biomol Screen. 21 (1), 12-23 (2016).
  16. Nath, N., et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye. J Immunol Methods. 431, 11-21 (2016).
  17. Lundberg, E., Sundberg, M., Graslund, T., Uhlen, M., Svahn, H. A. A novel method for reproducible fluorescent labeling of small amounts of antibodies on solid phase. J Immunol Methods. 322 (1-2), 40-49 (2007).
  18. Strachan, E., et al. Solid-phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit. 17 (3), 268-276 (2004).
  19. Dezfouli, M., et al. Magnetic bead assisted labeling of antibodies at nanogram scale. Proteomics. 14 (1), 14-18 (2014).
  20. Nath, N., Godat, B., Benink, H., Urh, M. On-bead antibody-small molecule conjugation using high-capacity magnetic beads. J Immunol Methods. 426, 95-103 (2015).
  21. Lund, L. N., et al. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry. J Mol Recognit. 24 (6), 945-952 (2011).
  22. Safarik, I., Safarikova, M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides. Biomagn Res Technol. 2 (1), 7(2004).
  23. Flygare, J. A., Pillow, T. H., Aristoff, P. Antibody-drug conjugates for the treatment of cancer. Chem Biol Drug Des. 81 (1), 113-121 (2013).
  24. Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
  25. Acchione, M., Kwon, H., Jochheim, C. M., Atkins, W. M. Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates. MAbs. 4 (3), 362-372 (2012).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

MagnetbeadsProtein A BeadsAminkonjugationThiolkonjugationZellmediumAntik rperreinigungBead Elution

Verwandte Artikel