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Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

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DOI:

10.3791/54546

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17. September 2016

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.

Zusammenfassung

Es gibt eine steigende Nachfrage nach einfachen, aber dennoch effektiven Methoden, die zum Nachweis spezifischer Krankheitserreger für Point-of-Care- oder Feldanwendungen verwendet werden können. Solche Methoden müssen benutzerfreundlich sein und zuverlässige Ergebnisse liefern, die sowohl von Fachleuten als auch von Laien leicht interpretiert werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv, da er den pH-Wert einer Testprobe über eine einfache Farbänderung anzeigt. Wir haben einen Ansatz entwickelt, um den Lackmustest für den Bakteriennachweis zu nutzen. Die Methode nutzt ein bakteriumspezifisches RNA-spaltendes DNAzym, um zwei Funktionen zu erreichen: die Erkennung eines interessierenden Bakteriums und die Bereitstellung eines Mechanismus zur Steuerung der Urease-Aktivität. Durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit einem DNAzym-Urease-Konjugat immobilisiert sind, wird das Vorhandensein von Bakterien in einer Testprobe auf die Freisetzung von Urease aus den Kügelchen in die Lösung übertragen. Die freigesetzte Urease wird in eine Testlösung überführt, um Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt, die mit dem klassischen Lackmustest sichtbar gemacht werden kann.

Einleitung

Bakterielle Krankheitserreger sind eine der Hauptursachen für weltweite Morbidität und Mortalität. Ausbrüche von Krankenhausinfektionen, durch Lebensmittel übertragene Krankheitserreger und bakterielle Schadstoffe in der Umwelt stellen eine ernsthafte und anhaltende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit dar. Um diese Ausbrüche zu verhindern, sind wirksame Instrumente erforderlich, die einen rechtzeitigen Nachweis von Krankheitserregern unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen. Einfache, aber dennoch effektive Tests, die tragbar und kostengünstig sind, sind sehr begehrt, insbesondere in Regionen, die anfällig für Ausbrüche sind, sich aber keine teuren Testeinrichtungen leisten können. 1-3 Obwohl es eine Vielzahl von Methoden zum Nachweis von Bakterien gibt, eignen sich viele von ihnen nicht als Screening- oder Vor-Ort-Testwerkzeuge, da sie lange Testzeiten, teure Instrumente und komplizierte Testverfahren erfordern.

Kolorimetrische Tests sind besonders attraktiv für Point-of-Care- oder Feldanwendungen, da Farbveränderungen mit bloßem Auge leicht erkannt werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv. Obwohl es sich um eine sehr alte Technologie handelt, ist sie aufgrund ihrer Einfachheit und Wirksamkeit auch heute noch weit verbreitet. Überraschenderweise war dieser einfache Test noch nie modifiziert worden, um den Nachweis anderer Analyten zu erreichen, bevor wir kürzlich einen Ansatz entwickelt haben, diesen Test für E. coli-Tests zu modifizieren. 4

Der erweiterte Lackmustest für E. coli verwendet drei zusätzliche Komponenten: ein E. coli-aktiviertes RNA-spaltendes DNAzym (EC1), 5 Urease und magnetische Kügelchen. DNAzyme beziehen sich auf synthetische einzelsträngige DNA-Moleküle mit katalytischer Aktivität. 6 Sie können mittels In-vitro-Selektion aus DNA-Pools mit Zufallssequenz isoliert werden. 7,8 Sie sind sehr stabil und können durch hocheffiziente automatisierte DNA-Synthese kostengünstig hergestellt werden. 9 Aus diesen Gründen wurden DNAzyme, insbesondere RNA-spaltende DNAzyme, umfassend für Biosensorik-Anwendungen untersucht. 6,10,11 RNA-spaltende DNAzyme-Sensoren wurden entwickelt, um Metallionen,12-16 kleine Moleküle,17,18 bakterielle Krankheitserreger5,19-21 und Krebszellen zu detektieren. 22 Angesichts der großen Verfügbarkeit von zielinduzierten RNA-spaltenden DNAzymen kann jeder Assay, der ein DNAzym verwendet, potenziell erweitert werden, um eine Vielzahl von Analyten zu detektieren.

Urease wird aufgrund seiner Fähigkeit ausgewählt, Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren,23,24, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt. Urease ist außerdem hocheffizient, stabil und für die Konjugation mit anderen Biomolekülen geeignet. Daher postulierten wir, dass ein Konjugat eines RNA-Spaltungs-DNAzyms mit Urease die Verwendung von Lackmustests zum Nachweis anderer Ziele ermöglichen würde. 5

Die Wirkung des RNA-spaltenden DNAzyms wird auf eine Urease-vermittelte Erhöhung des pH-Werts durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen übertragen, die mit dem DNAzyme-Urease-Konjugat immobilisiert sind. Da die Aktivität des untersuchten DNAzyms streng von E. coli abhängt, führt das Vorhandensein dieses Bakteriums in der Testlösung zur Freisetzung von Urease aus den magnetischen Kügelchen an die Lösung, die dann entnommen und zur Hydrolyse von Harnstoff in einer Reporterlösung verwendet wird, die einen pH-empfindlichen Farbstoff enthält. Das Endergebnis dieses Verfahrens ist eine Farbveränderung, die bequem durch den Farbstoff oder das pH-Papier gemeldet werden kann.

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Protokoll

1. Vorbereitung der Reagenzien und Puffer

  1. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
    1. In einem 2 - Liter - Becher, fügen 186,1 g EDTA zu 800 ml entionisiertem destilliertem Wasser (ddH 2 O). Der pH-Wert der Lösung auf 8,0 unter Verwendung von NaOH-Pellets. In ddH 2 O auf ein Endvolumen von 1,0 l und die Lösung in einem autoklavierbaren Glasflasche für Autoklaven und lagern bei 4 ° C.
  2. 10 × Tris-Borat-EDTA (10x TBE)
    1. In einem 4 L - Plastikbecher, fügen Sie 432 g Tris-Base, 200 g Borsäure, 80 ml ​​0,5 M EDTA (pH 8,0) und ddH 2 O auf ein Endvolumen von 4 L. Mix mit einem Rührstab , bis alle Komponenten gelöst. Die Lösung wird auf 1 Liter Glasflaschen für Autoklaven und lagern bei 4 ° C.
  3. 10% denaturierende Polyacrylamid-Auf
    1. In einem 4 L - Plastikbecher, fügen 1681,7 g Harnstoff, 400 ml 10x TBE, 1 l 40% Acrylamid / Bisacrylamid (29: 1) Lösung und ddH 2 O bis final Volumen 4 L. Mix einen Rührstab mit bis sich der Harnstoff gelöst ist. Die Lösung wird auf 1 Liter Braunglasflaschen und lagern bei 4 ° C.
  4. 2x Gelladepuffer (2x GLB)
    1. In einem 200 ml Becherglas, fügen 44 g Harnstoff, 8 g Saccharose, 10 mg Bromphenolblau, 10 mg Xylolcyanol FF, 400 ul 10% Natriumdodecylsulfat, und 4 ml 10 x TBE. Hinzufügen ddH 2 O auf ein Endvolumen von 40 ml und lösen sich die Komponenten unter gelindem Erwärmen auf 50 ° C unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab gemischt wird . 1 ml aliquoten bis 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und lagern bei 4 ° C.
      HINWEIS: Vor Gebrauch erfordert kurzes Erhitzen bei 90 ° C keine Feststoffe wieder zu lösen.
  5. 1 M Tris-Hydrochlorid (Tris-HCl) (pH 7,5)
    1. In einer Glasflasche, fügen 12,1 g Tris-Base und 70 ml ddH 2 O und mischen , bis der Feststoff gelöst ist. Einstellung des pH auf 7,5 mit 1 M Salzsäure (HCl). Hinzufügen ddH 2 O auf ein Endvolumen von 100 ml, Autoklaven und store bei 4 ° C
  6. 5 M Natriumchlorid (NaCl)
    1. In eine Glasflasche, lösen sich 58,4 g NaCl in 150 ml ddH 2 O. Stellen Sie die Lautstärke auf 200 ml mit ddH 2 O. Lagerung bei 4 ° C.
  7. DNA Elution Buffer
    1. In eine Glasflasche wurden 2,0 ml von 1 M Tris-HCl (pH 7,5) mischen, 8,0 ml 5 M NaCl und 0,4 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0). Stellen Sie die Lautstärke auf 200 ml mit ddH 2 O, Autoklaven und lagern bei 4 ° C.
  8. 1 M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,4)
    1. In einer Glasflasche, lösen sich 2,38 g HEPES in 80 ml ​​ddH 2 O. Den pH - Wert auf 7,4 unter Verwendung von 5 N NaOH und fügen ddH 2 O auf ein Endvolumen von 100 ml.
  9. 1 M Magnesiumchlorid (MgCl 2)
    1. In einer Glasflasche, fügen 2,03 g MgCl 2 · 6H 2 O und bringen das Volumen auf 100 ml mit ddH 2 O.
  10. Reaktionspuffer (RB)
    1. In einem 50 ml konischen Röhrchen wurden 50 ul 1 M HEPES (pH 7,4), 1,5 ml 5 M NaCl, 0,75 ml 1 M MgCl 2 und 5 & mgr; l Tween-20 hinzu. Hinzufügen ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 ml. Mischen Sie die Lösung und den Filter in eine andere konische Röhrchen mit einer Spritze gesteuerten Filter (0,22 & mgr; m) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  11. Binding Buffer (BB)
    1. In einem 50 ml konischen Röhrchen, 500 ul 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 8,8 g NaCl, 50 ul 1 M MgCl 2 und 5 & mgr; l Tween 20. In ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 ml. Mischen Sie die Lösung und den Filter in eine andere konische Röhrchen mit einer Spritze gesteuerten Filter (0,22 & mgr; m) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  12. Substratlösung (SS)
    1. In einem 50 ml konischen Röhrchen, fügen Sie 5,8 g NaCl, 3 ml 1 M MgCl 2, 1,5 g Harnstoff und 40 ml ddH 2 O. Der pH-Wert der Lösung auf 5,0 unter Verwendung von 10 mM HCl. Da die Lösung nicht gepuffert ist, pH-Einstellung mit HClvorsichtig durch die Zugabe von kleinen Aliquots HCl. Hinzufügen ddH 2 O auf ein Endvolumen von 50 ml.
    2. Mischen Sie die Lösung und den Filter in eine andere konische Röhrchen mit einer Spritze gesteuerten Filter (0,22 & mgr; m) und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
  13. Luria Bertani (LB) Broth
    1. In einem Becherglas löst man 20,0 g LB - Pulver in 1 l ddH 2 O. Übertragung auf eine Glasflasche, Autoklaven und lagern bei 4 ° C.
  14. 1,5% LB-Agar
    1. In einem 250 ml Kolben, fügen 1,5 g Agar und 100 ml LB-Brühe. Autoklav und lagern bei 4 ° C.
  15. Agar-Platten
    1. Abgeblasen, und der LB-Agar in einer Mikrowelle und die Lösung auf ~ 50 ° C. Füllen Sie die Lösung in Petrischalen, so dass ~ 5 Platten und es ihnen ermöglichen, sich zu verfestigen.

2. Synthese und Reinigung von E. Colireaktions DNAzyms EC1

  1. Synthese von EC1 durch Vorlage Mediated enzymatische Ligation
    1. Reinige commercially synthetisierte Oligonukleotide BS1, DE1 und T1 (Sequenzen in Tabelle 1) , um 10% denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (DPAGE) nach Standardprotokollen.
    2. Bereiten Sie eine 100 & mgr; M Lager von BS1, DE1 und T1. Lagerung bei -20 ° C bis zur Verwendung.
    3. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen 38,5 & mgr; l ddH 2 O, 5 ul DE1 und 5 ul 10fach T4 Polynucleotidkinase - Reaktionspuffer durch Enzym - Lieferanten zur Verfügung gestellt (500 mM Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM MgCl 2, 50 mM Dithiothreitol (DTT), 1,0 mM Spermidin).
    4. 1 & mgr; l von Adenosintriphosphat (ATP) (100 mM). Werden 5 Einheiten T4-Polynukleotidkinase (10 U / ul). Mischen Sie durch sorgfältig die Reaktionsmischung Pipettieren.
    5. Inkubieren der Reaktion bei 37 ° C für 30 min.
    6. Quenche die Reaktion durch Erhitzen auf 90 ° C für 5 min.
    7. Hinzufügen , 118 & mgr; l ddH 2 O, 5 ul BS1, und 5 ul T1. Die Reaktion wird auf 90 ° C für 2 min und dann auf Raumtemperatur abkühlen über 10 min.
    8. Geben Sie 20 & mgr; l von 10 × T4 - DNA - Ligase - Reaktionspuffer durch das Enzym Lieferanten zur Verfügung gestellt (400 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgCl 2, 100 mM DTT, 5 mM ATP). In 10 Einheiten T4-DNA-Ligase (5 U / ul) und vorsichtig durch Pipettieren mischen.
    9. Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Std.
    10. Geben Sie 20 & mgr; l 3 M Natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2), 500 ul kaltem 100% Ethanol. Mischen Sie die Lösung durch Verwirbelung und legen Sie den Schlauch in einem -20 ° C Gefrierschrank für 30 min.
    11. Zentrifugieren Sie die Mikrofuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Pipettieren.
    12. Waschen des Pellets mit kaltem 70% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Wieder den Überstand zu entfernen, und das Pellet unter Vakuum für 10 min trocknen.
    13. Resuspendieren der DNA mit 15 ul ddH 2 O und dann 15 ul 2x GLB hinzufügen.
    14. Kräftig vortexen und Hitze auf 90 ° C für2 Minuten. Reinige den Volllängen-DNA um 10% DPAGE wie unten beschrieben.
  2. Einrichten 10% DPAGE
    1. Reinigen Sie zwei Glasplatten (eine volle Platte und einem gekerbten), zwei 0,75 mm dicken Abstandshalter und eine 12-Well-Kamm. Legen Sie eine Glasplatte auf einer ebenen Fläche mit zwei Abstandshalter auf jeder Seite und der gekerbten Platte an der Spitze. Clip die beiden Platten zusammen mit den vier Clips vom Lieferanten zur Verfügung gestellt.
    2. In einem 150 ml Kunststoffbecher, gieße 40 ml 10% DPAGE, 40 ul Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 400 ul 10% Ammoniumpersulfat (APS). Die Komponenten mischen und gießen Sie die Lösung zwischen den Platten langsam.
    3. Setzen Sie den Kamm und dann lassen Sie das Gel über 10 Minuten zu polymerisieren. Sobald das Gel polymerisiert wird, langsam den Kamm zu entfernen und die Vertiefungen mit ddH 2 O spülen
    4. Montieren Sie die Platten auf das Gel Elektrophorese-Vorrichtung. Verwenden Sie eine Metallplatte zu leiten Wärme erzeugt eine Überhitzung zu vermeiden.
    5. Gießen 1x TBE auf den oberen und unteren Kammernund sicherzustellen, dass die Vertiefungen werden auch in den Puffer eingetaucht. Spülen Sie die Brunnen mit 1x TBE mit einer Pipette oder Spritze.
    6. Stellen Sie das Gerät bei 35 mA und Vorlauf für 15 Minuten vor dem Laden der Proben zu laufen.
  3. Die Elution von ligierte EC1 von 10% DPAGE
    1. Nach dem Schritt 2.2.6, führen Sie das Gel bei 35 mA, bis der Boden Farbstoff (Bromphenolblau) erreicht den Boden der Glasplatte. Dies sollte etwa 1,5 Stunden dauern. Schalten Sie das Gerät aus und entfernen Sie die Platten aus dem Gerät.
    2. Legen Sie die Platten auf ein paar Blatt Papier Handtücher und sorgfältig die Abstandshalter von den Glasplatten zu entfernen. Entfernen Sie vorsichtig die obere Glasplatte und wickeln Sie das Gel mit Plastikfolie.
    3. Drehen Sie das Gel auf die zweite Glasplatte entfernen und die Abdeckung mit Plastikfolie wieder. Achten Sie darauf, Falten der Plastikfolie zu vermeiden.
    4. Visualisieren Sie die ligierte Produkt durch UV-Shadowing (260 nm) verwendet, die vier verschiedene DNA-Banden produzieren wird (Fully ligierten EC1, DE1, BS1, und T1).
    5. Verbrauch das obere Band (EC1) mit einer sterilen Rasierklinge und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Crush das Gel mit einer sterilen Pipettenspitze (200 ul Spitze Größe), bis er in einer feinen Paste verwandelt. In 550 & mgr; l DNA-Elutionspuffer, decken Sie das Rohr mit Aluminiumfolie des eingebetteten Fluorophors zu schützen, und schütteln für 15 min.
    6. Zentrifugieren Sie die Gel-Lösung bei 20.000 xg für 5 min und transferieren es vorsichtig 400 ul des Überstandes auf einen anderen 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Vermeiden Sie Gelstücke beim Pipettieren zurückzog.
    7. An den Mikrozentrifugenröhrchen mit dem übertragenen Überstand werden 40 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) und 1,0 ml kaltem 100% Ethanol. Mischen Sie die Lösung durch Verwirbelung und legen Sie den Schlauch in einem -20 ° C Gefrierschrank für 30 min.
    8. Zentrifugieren Sie die Mikrofuge bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Pipettieren.
    9. Waschen des Pellets mit kaltem 70% Ethanol und zentrifugiere wieder bei 20.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Wieder einmal, entfernen Sie dieÜberstand und das Pellet unter Vakuum für 10 min trocknen.
    10. Bestimmung der Konzentration der EC1 durch UV-Absorption bei 260 nm gemessen wird. Machen Sie eine 10 uM Lager und lagern Sie die Probe bei -20 ° C bis zur Verwendung.

3. Konjugation von Urease zu DNA

  1. Herstellung von Succinimidyl-4- (N-maleimidomethyl) cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) Stock
    1. Man löst 1 mg SMCC in 676 ul DMSO. Vortex und auf Eis bis zum Gebrauch.
  2. Herstellung von Urease Auf
    1. Man löst 1 mg Urease in 1 ml 1 × PBS (ohne Mg 2+ oder Ca 2+). Auf Eis bis zum Gebrauch.
      HINWEIS: Crystallized Urease ist langsam aufzulösen und schonendes Mischen ist erforderlich, eine Denaturierung zu vermeiden.
  3. Synthese von Urease-DNA (UrDNA)
    1. Zugabe von 10 ul 100 uM LD1 zu einem 2,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. In 140 ul ddH 2 O, 40 ul 10x PBS und Wirbel.
    2. In 80,5 ul SMCC stock, 159,5 ul DMSO, Wirbel, und kurz Zentrifuge ein Benchtop-Zentrifuge.
    3. für 60 min bei 37 ° C inkubieren. Vermeiden Sie Kondensation unter der Mikrofuge Kappe.
    4. Mit 200 & mgr; l 1x PBS, 60 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) und 1,5 ml kaltem 100% Ethanol. Mischen Sie die Lösung durch Vortexen und Inkubation bei -20 ° C für 30 min.
    5. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 20.000 × g für 20 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet unter Vakuum. Vermeiden Sie Übertrocknung.
    6. Zu dem getrockneten Pellet 400 ul Urease Lager hinzufügen und bei Raumtemperatur für 5 Stunden inkubiert.
    7. Übertragung von 200 ul rohem Konjugat zu einem vorgewaschenen 100k MWCO Zentrifugalfilter Säule. Zentrifugieren Sie die Säule bei 14.000 xg für 5 min.
    8. Übertragen, um die verbleibenden 200 ul Rohkonjugat auf die Säule und Zentrifugieren bei 14.000 xg für 5 min. Entfernen Sie die Spalte und legen Sie es auf den Kopf in einem neuen 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen ( "Sammelröhrchen").
    9. Zentri- fugalkruge das Sammelrohr (mit der invertierten Spalte) bei 1000 × g für 2 min. Entfernen Sie die Sammelröhrchen und fügen Sie 30 ul 1x PBS auf die zentrifugalen Spalte die Membran für zusätzlichen Gewinnung von Konjugate zu waschen.
    10. Wieder einmal die Spalte umkehren und wieder in das Sammelrohr platzieren. Zentrifugieren Sie das Sammelrohr (mit der invertierten Spalte) bei 1000 × g für 2 min. Entfernen Sie die Spalte zu entsorgen.
    11. Lagern Sie die UrDNA bei 4 ° C bis zur Verwendung.

4. Montage von EC1 und UrDNA auf Magnetic Beads

  1. Mischen Sie die magnetischen Kügelchen (MB) Lager gut und Transfer 100 ul MB Suspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Magnethalterahmen für den MB zu isolieren.
  2. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren und fügen 150 ul Bindungspuffer (BB) an das Rohr. Entfernen Sie den Schlauch aus dem Halter und vorsichtig den Schlauch tippen Sie auf die MB zu einer homogenen Lösung zu suspendieren. Vermeiden Sie die Suspension auf die t spritztop des Rohres oder Kappen. Wenn dies der Fall ist, verwenden Sie einen Tischzentrifuge kurz um den Rückstand zu drehen zurück in die Suspension.
  3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 zwei weitere Male.
  4. Zu dieser Suspension 10 ul von 10 uM EC1 hinzuzufügen. sorgfältig mischen, indem Sie auf das Rohr klopfen.
  5. Inkubieren Sie die Lösung mit milden Schütteln für 30 min. Tippen Sie das Röhrchen alle 2-3 Minuten, um die Fällung des MB zu vermeiden.
  6. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen wieder auf dem Magnet Rack mit dem MB zu isolieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen. Waschen Sie die MB dreimal mit 150 ul BB (wie in Schritt 4.2 beschrieben).
  7. Sobald das Waschen abgeschlossen ist, setzt sie die MB in insgesamt 150 ul BB. Zu dieser Lösung werden 15 ul UrDNA und die Lösung auf 45 ° C für 2 min erwärmt. Die Lösung wird auf Raumtemperatur und Inkubation für 2 Stunden.
  8. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen wieder auf dem Magnet Rack mit dem MB zu isolieren und den Überstand mit einer Pipette entfernen.
  9. 100 l Reaktionspuffer (RB). entfernen ter Mikrozentrifugenröhrchen aus dem magnetischen Rack und sorgfältig die MB resuspendieren.
  10. Waschen Sie die MB noch drei Mal für Schritt 4.9 wiederholen.
    HINWEIS: Der gewaschene Überstand schnell getestet werden können, um festzustellen, ob unhybridisiert UrDNA noch vorhanden ist, was zu einem falsch-positiven Signal führen kann. Der Test kann durch Zugabe von 10 ul 50 mM Harnstoff und 10 ul 0,04% Phenolrot in die Waschlösung durchgeführt werden. Fortsetzung der MB zu waschen, bis die Waschlösung nicht um eine Farbänderung verursacht. Die 100 & mgr; l Suspension wird bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert.

5. Herstellung von Bakterienzellen 20

  1. Die Anzucht E. coli aus Aktien
    1. Platte E. coli K12 (MG1655) auf LB - Agar - Platten aus einem Glycerin - Stamm unter einer Flamme oder in einem biologischen Sicherheitsschrank.
    2. Mit einer sterilen Pipettenspitze, sanft berühren die Glycerolstammlösung und leicht Streifen die Oberfläche einer Agarplatte Punktierung des LB-Agar zu vermeiden.
    3. Kehren Sie die strichenenPlatte und für 14 Stunden bei 37 ° C inkubiert.
    4. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm und lagern bei 4 ° C für maximal 3 Wochen.
  2. Die Anzucht E. coli für Zellzählung
    1. In einem sterilen Kulturröhrchen 14 ml, verzichtet werden 2 ml LB-Brühe.
    2. Mit einer sterilen Pipettenspitze, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der Agarplatte ausgestrichen, hergestellt in Schritt 5.1 und überträgt es auf dem Kulturröhrchen.
    3. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C und Schütteln bei 230 Umdrehungen pro Minute für 14 Stunden.
    4. Abwechselnd verdünnen, um die Bakterienkultur in 10-fach-Intervallen.
    5. Für jede verdünnte Probe, die Platte gleichmäßig fünf 100 ul Aliquots auf separaten LB-Agarplatten. Kehren Sie die Platten und Inkubation bei 37 ° C für 14 Stunden.
    6. Zählen Sie die Zellen jeder Probe die durchschnittliche Zellkonzentration von jeder Verdünnung zu erhalten.
      HINWEIS: 10 7 Zellen werden häufig eine Referenz Lackmustest einzurichten für E. verwendet coli als dieser Ebene von E. coli kann eine schnelle Farb chan auslösenge. Allerdings kann ein ordnungsgemäß ausgeführt Lackmus-Test so günstig wie 500 Zellen erkennen, wie im Abschnitt Ergebnisse diskutiert.
  3. Vorbereiten E. coli - Zellen für die Prüfung
    1. Für eine gewünschte Zellsuspension, 1 ml der gezüchteten Lager in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
    2. Zentrifugieren der Zellen bei 6000 × g für 10 min bei 4 ° C. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne das Zellpellet zu stören.
    3. Zugabe von 10 & mgr; l Reaktionspuffer zu dem Zellpellet und Resuspendieren der Zellen. Beschallen die Zellsuspension für 5 min. Übertragen Sie die Zellsuspension für 5 min auf einen Eisschrank.
    4. Beschallen die Zellsuspension für weitere 5 min.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 13.000 × g für 10 min bei 4 ° C. Verwenden Sie den Überstand für die Prüfung (10 ul).

6. Lackmus-Test

  1. In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Vorwäsche das Röhrchen durch Zugabe und Vortexen 100 & mgr; l Reaktionspuffer (RB) in dem Mikrozentrifugenröhrchen undVerwerfen des Puffers.
  2. Transfer 15 ul montiert EC1 (Protokoll 4) mit dem Mikrozentrifugenröhrchen gewaschen.
  3. Waschen Sie die magnetischen Kügelchen durch das Mikrozentrifugenröhrchen auf einem magnetischen Rack platzieren. Entfernen Sie den Überstand durch Pipettieren. Entfernen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Rack, 100 & mgr; l von RB und resuspendieren sorgfältig die magnetischen Kügelchen.
  4. Waschen Sie die MB noch zwei Mal für Schritt 6.3 wiederholen.
  5. Setzen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen wieder auf dem Magnetträger, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie die 10 & mgr; l E. coli Probe aus Schritt 5.3 vorbereitet.
  6. Mischen Sie die Probe und magnetische Kügelchen vorsichtig durch leichtes Klopfen auf den Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 1 Std.
  8. Zu der Reaktion werden 90 & mgr; l ddH 2 O und legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen auf einem Magnethalter.
  9. Nach ca. 3 min magnetischer Trennung, übertragen vorsichtig 85 ul des Überstandes auf eine 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Ziehen Sie den Überstand langsam aufvermeiden alle magnetischen Kügelchen zu sammeln.
  10. Zu der obigen Mikrozentrifugenröhrchen 15 ul 0,04% Phenolrot hinzuzufügen, und 100 ul Substratlösung.
  11. Machen Sie ein Foto in bestimmten Zeitintervallen Farbwechsel aufzeichnen.
    HINWEIS: Der pH-Änderung kann auch mit einer Mikroelektrode mit einem pH-Meter überwacht werden. Der Start pH-Wert sollte etwa 5,2-5,5 sein (die Lösung ist gelb). Wenn nicht, kann die Lösung durch Zugabe von 1 mM Acetatpuffer pH 5,0) eingestellt werden.

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Ergebnisse

Das Prinzip des bakteriellen Lackmus - Test ist in Abbildung 1 erläutert Der Test verwendet drei Schlüsselmaterialien. Ein RNA - spaltender DNAzyme die von einem bestimmten Bakterium, Urease und magnetische Kügelchen aktiviert. Die DNAzyme wird als molekulares Erkennungselement verwendet hochspezifischen Nachweis eines Bakteriums von Interesse zu erreichen. Urease und magnetische Kügelchen verwendet werden Signaltransduktion der RNA-Spaltungsaktivität der DNAzyme zu erre...

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Diskussion

Die Übersetzung von der Wirkung der RNA - Spaltungsaktivität eines Bakteriums-responsive DNAzyme zu einer Lackmus - Test wird möglich gemacht durch die Verwendung von Urease und magnetische Trennung, wie 1 durch veranschaulicht ist . Obwohl der Nachweis des modifizierten Lackmus - Test für Bakteriendetektion mit einem E. getan coli -abhängigen RNA-Spaltung DNAzyme, 5,19,20 das Design im Allgemeinen für jede RNA-Spaltung DNAzyme erweitert werden kann. Angesic...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Finanzierung für dieses Forschungsprojekt wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) über einen Discovery Grant an YL bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
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Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)VWR AMRESCO0105
Natriumhydroxid (NaOH) PelletsBIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-BaseVWR AMRESCO0497
BorsäureAMRESCO0588
HarnstoffVWR AMRESCOM123
40% Acrylamid / Bisacrylamid (29:1) LösungBIO BASIC CANADA INC.A0007
SaccharoseBioshop Kanada Inc.SUC507
Bromphenol blauBioshop Canada inc.BRO777
Xylolcyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% NatriumdodecylsulfatBioshop Canada Inc.SDS001
Salzsäure (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Natriumchlorid (NaCl)Bioshop Canada Inc.SOD001
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Magnesiumchlorid (II)-hexahydratVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenosin-Triphospahte (ATP)AMRESCO0220
Natriumacetat-Trihydrat (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
Ethanol Kommerzielle AlkoholeP016EAAN
Tetramethylenethylendiamin (TEMED)AMRESCO0761
10% Ammoniumpersulfat (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimethylsulfoxid (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% PhenolrotSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 Polynukleotidkinase ReaktionspufferLucigen30061-1
10x T4 DNA-Ligase-ReaktionspufferBio Basics KanadaB1122-B
T4 DNA-Ligase (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BouillonAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 Polynukleotidkinase (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
ZentrifugeBeckman Coulter, Inc.
GlasplattenCBS scientificngp-250nr
0,75 mm dicke AbstandhalterCBS scientificVGS-0725r
12-Well-KammCBS scientificVGC-7512
UV-LampeUVP95-0017-09
Spektralphotometer (NanoVue)GE HealthcareN/A
MetallplatteCBS wissenschaftlichCPA165-250
VortexVWR International58816-123
GelelektrophoresegerätCBS wissenschaftlichASG-250
PetrischalenVWR International25384-342
100 kDa MWCO ZentrifugalfilterEMD MilliporeUFC510024
Magnetische Kugel (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Magnetisches TrenngestellNew England BioLabsS1506S
Mikrofuge-RöhrchenSarstedt72.69
Spritzenvorsatzfilter (0,22 μ m)VWR International28145-501
14 ml KulturröhrchenVWR International60818-725
Zellkultur-InkubatorEppendorf ScientificM13520000
Branson UltraschallreinigerBransonN/A
Kamera (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml konisches RöhrchenVWR DeutschlandTel.: 89004-364
392187

Referenzen

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