Methodenartikel

Kolorimetrischen Nachweis von Bakterien mit Lackmus-Test

DOI:

10.3791/54546

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17. September 2016

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1Department of Biochemistry and Biomedical Sciences, McMaster University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University, 3Department of Medicine, McMaster University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir beschreiben ein Protokoll zum kolorimetrischen Nachweis von E. coli unter Verwendung eines modifizierten Lackmustests, der ein RNA-spaltendes DNAzym, Urease und magnetische Beads nutzt.

Zusammenfassung

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Es gibt eine steigende Nachfrage nach einfachen, aber dennoch effektiven Methoden, die zum Nachweis spezifischer Krankheitserreger für Point-of-Care- oder Feldanwendungen verwendet werden können. Solche Methoden müssen benutzerfreundlich sein und zuverlässige Ergebnisse liefern, die sowohl von Fachleuten als auch von Laien leicht interpretiert werden können. Der Lackmustest für den pH-Wert ist einfach, schnell und effektiv, da er den pH-Wert einer Testprobe über eine einfache Farbänderung anzeigt. Wir haben einen Ansatz entwickelt, um den Lackmustest für den Bakteriennachweis zu nutzen. Die Methode nutzt ein bakteriumspezifisches RNA-spaltendes DNAzym, um zwei Funktionen zu erreichen: die Erkennung eines interessierenden Bakteriums und die Bereitstellung eines Mechanismus zur Steuerung der Urease-Aktivität. Durch die Verwendung von magnetischen Kügelchen, die mit einem DNAzym-Urease-Konjugat immobilisiert sind, wird das Vorhandensein von Bakterien in einer Testprobe auf die Freisetzung von Urease aus den Kügelchen in die Lösung übertragen. Die freigesetzte Urease wird in eine Testlösung überführt, um Harnstoff zu Ammoniak zu hydrolysieren, was zu einer Erhöhung des pH-Werts führt, die mit dem klassischen Lackmustest sichtbar gemacht werden kann.

Einleitung

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Bakterielle Krankheitserreger sind eine der Hauptursachen für weltweite Morbidität und Mortalität. Ausbrüche von Krankenhausinfektionen, durch Lebensmittel übertragene Krankheitserreger und bakterielle Schadstoffe in der Umwelt stellen eine ernsthafte und anhaltende Bedrohung für die öffentliche Gesundheit und Sicherheit dar. Um diese Ausbrüche zu verhindern, sind wirksame Instrumente erforderlich, die einen rechtzeitigen Nachweis von Krankheitserregern unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichen. Einfache, aber dennoch effektive Tests, die tragbar und kostengünstig sind, sind sehr begehrt, insbesondere in Regionen, die anfällig für Ausbrüche sind, sich aber kein....

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Reagenzien und Puffer

  1. 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
    1. In einem 2 - Liter - Becher, fügen 186,1 g EDTA zu 800 ml entionisiertem destilliertem Wasser (ddH 2 O). Der pH-Wert der Lösung auf 8,0 unter Verwendung von NaOH-Pellets. In ddH 2 O auf ein Endvolumen von 1,0 l und die Lösung in einem autoklavierbaren Glasflasche für Autoklaven und lagern bei 4 ° C.
  2. 10 × Tris-Borat-EDTA (10x TBE)
    1. In einem 4 L - Plastikbecher, fügen Sie 432 g Tris-Base, 200 g Borsäure, 80 ml ​​0,5 M EDTA (pH 8,0) und ddH 2 O auf ein Endvolumen von 4 L. Mix mit einem Rührstab , bis alle Ko....

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Ergebnisse

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Das Prinzip des bakteriellen Lackmus - Test ist in Abbildung 1 erläutert Der Test verwendet drei Schlüsselmaterialien. Ein RNA - spaltender DNAzyme die von einem bestimmten Bakterium, Urease und magnetische Kügelchen aktiviert. Die DNAzyme wird als molekulares Erkennungselement verwendet hochspezifischen Nachweis eines Bakteriums von Interesse zu erreichen. Urease und magnetische Kügelchen verwendet werden Signaltransduktion der RNA-Spaltungsaktivität der DNAzyme zu erre.......

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Diskussion

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Die Übersetzung von der Wirkung der RNA - Spaltungsaktivität eines Bakteriums-responsive DNAzyme zu einer Lackmus - Test wird möglich gemacht durch die Verwendung von Urease und magnetische Trennung, wie 1 durch veranschaulicht ist . Obwohl der Nachweis des modifizierten Lackmus - Test für Bakteriendetektion mit einem E. getan coli -abhängigen RNA-Spaltung DNAzyme, 5,19,20 das Design im Allgemeinen für jede RNA-Spaltung DNAzyme erweitert werden kann. Angesic.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Finanzierung für dieses Forschungsprojekt wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) über einen Discovery Grant an YL bereitgestellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)VWR AMRESCO0105
Natriumhydroxid (NaOH) PelletsBIO BASIC CANADA INC.SB6789
Tris-BaseVWR AMRESCO0497
BorsäureAMRESCO0588
HarnstoffVWR AMRESCOM123
40% Acrylamid / Bisacrylamid (29:1) LösungBIO BASIC CANADA INC.A0007
SaccharoseBioshop Kanada Inc.SUC507
Bromphenol blauBioshop Canada inc.BRO777
Xylolcyanol FFSIGMA-ALDRICHX-4126
10% NatriumdodecylsulfatBioshop Canada Inc.SDS001
Salzsäure (HCl)CALEDON LABORATORIES LTD6026
Natriumchlorid (NaCl)Bioshop Canada Inc.SOD001
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES)Bioshop Canada inc.HEP001
Magnesiumchlorid (II)-hexahydratVWR AMRESCO0288
Tween 20Bioshop Canada inc.TW508
Adenosin-Triphospahte (ATP)AMRESCO0220
Natriumacetat-Trihydrat (NaOAc)SIGMA-ALDRICHS8625
Ethanol Kommerzielle AlkoholeP016EAAN
Tetramethylenethylendiamin (TEMED)AMRESCO0761
10% Ammoniumpersulfat (APS)BIO BASIC CANADA INC.AB0072
Succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC)ThermoFisher SCIENTIFIC22360
Dimethylsulfoxid (DMSO)CALEDON LABORATORIES803540
UreaseSIGMA-ALDRICHU0251
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)ThermoFisher SCIENTIFIC70011-069
0,04% PhenolrotSIGMA-ALDRICHP3532
10x T4 Polynukleotidkinase ReaktionspufferLucigen30061-1
10x T4 DNA-Ligase-ReaktionspufferBio Basics KanadaB1122-B
T4 DNA-Ligase (5 U/μ l)Thermo Fischer ScientificB1122
Luria Bertani (LB) BouillonAMRESCOJ106
AgarAMRESCOJ637
T4 Polynukleotidkinase (10 U/μ l)Lucigen30061-1
E. coli K12 (MG1655)ATCCATCC700926
ZentrifugeBeckman Coulter, Inc.
GlasplattenCBS scientificngp-250nr
0,75 mm dicke AbstandhalterCBS scientificVGS-0725r
12-Well-KammCBS scientificVGC-7512
UV-LampeUVP95-0017-09
Spektralphotometer (NanoVue)GE HealthcareN/A
MetallplatteCBS wissenschaftlichCPA165-250
VortexVWR International58816-123
GelelektrophoresegerätCBS wissenschaftlichASG-250
PetrischalenVWR International25384-342
100 kDa MWCO ZentrifugalfilterEMD MilliporeUFC510024
Magnetische Kugel (BioMag)Bangs Laboratories IncBM568
Magnetisches TrenngestellNew England BioLabsS1506S
Mikrofuge-RöhrchenSarstedt72.69
Spritzenvorsatzfilter (0,22 μ m)VWR International28145-501
14 ml KulturröhrchenVWR International60818-725
Zellkultur-InkubatorEppendorf ScientificM13520000
Branson UltraschallreinigerBransonN/A
Kamera (Canon Powershot G11)CanonN/A
50 ml konisches RöhrchenVWR DeutschlandTel.: 89004-364
392187

Referenzen

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  1. Daar, A. S., et al. Top ten biotechnologies for improving health in developing countries. Nat. Genet. 32, 229-232 (2002).
  2. Newman, J. D., Turner, A. P. Home blood glucose biosensors: a commercial perspective. Biosens. Bioelectron. 20, 2435-2453 (20....

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Schlagwörter

Kolorimetrischer BakteriennachweisRNA spaltendes DNAzymUrease Aktivit tMagnetbeadsE coli NachweispH IndikatorHarnstoffhydrolysePathogennachweisPr fung von Umweltwasser

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