Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

Gabrielle Lê-Bury; Chantal Deschamps; Audrey Dumas; Florence Niedergang

doi:10.3791/54568

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Methodenartikel

Phagosom Migration und Geschwindigkeit gemessen in Live-primären humanen Makrophagen mit HIV-1 infizierten

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DOI:

10.3791/54568

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5. September 2016

Gabrielle Lê-Bury¹ , Chantal Deschamps¹ , Audrey Dumas¹ , Florence Niedergang¹

¹Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Methode zur Messung der Geschwindigkeit von Phagosomen, die sich in lebenden Zellen in Richtung des Zellzentrums bewegen, die mit oder ohne das humane Immundefizienzvirus (HIV) Typ 1 infiziert sind, wobei die konfokale Fluoreszenzmikroskopie der Spinning-Disk zur Identifizierung fluoreszierender infizierter Zellen und die Hellfeldmikroskopie zum Nachweis von Phagosomen

verwendet wird.

Zusammenfassung

Makrophagen sind phagozytische Zellen, die eine wichtige Rolle an der Schnittstelle zwischen angeborener und spezifischer Immunität spielen. Sie können mit dem humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1 infiziert sein und können aufgrund ihrer Resistenz gegen dessen zytopathische Wirkung als persistente virale Reservoire angesehen werden. Darüber hinaus weisen HIV-infizierte Makrophagen defekte Funktionen auf, die zur Entstehung opportunistischer Krankheiten beitragen.

Der genaue Mechanismus, durch den HIV-1 die phagozytäre Reaktion von Makrophagen beeinträchtigt, war unbekannt. Wir hatten zuvor gezeigt, dass die Aufnahme verschiedener partikulärer Stoffe durch Makrophagen gehemmt wurde, wenn sie mit HIV-1 infiziert waren. Diese Hemmung war nur partiell und es bildeten sich Phagosomen in HIV-infizierten Makrophagen. Daher konzentrierten wir uns auf die Analyse des Schicksals dieser Phagosomen. Die Reifung der Phagosomen geht mit einer Wanderung dieser Kompartimente in Richtung des Zellzentrums einher, wo sie mit Lysosomen verschmelzen und Phagolysosomen erzeugen, die für den Abbau des aufgenommenen Materials verantwortlich sind. Wir verwendeten IgG-opsonisierte rote Blutkörperchen von Schafen als Ziel für die Phagozytose. Um die Geschwindigkeit der zentripetalen Bewegung von Phagosomen in einzelnen HIV-infizierten Makrophagen zu messen, verwendeten wir eine Kombination aus hellfeld- und fluoreszenzkonfokaler Mikroskopie. Wir haben eine Methode entwickelt, um den Abstand der Phagosomen zum Zellkern zu berechnen und dann die Geschwindigkeit der Phagosomen zu berechnen. HIV-infizierte Zellen wurden dank eines GFP-exprimierenden Virus identifiziert, aber die Methode ist auf nicht infizierte Zellen oder jede Art von Infektion oder Behandlung anwendbar.

Einleitung

Makrophagen spielen eine wichtige Rolle im angeborenen Immunsystem und in der Homöostase. Sie sind professionelle Fresszellen, die Krankheitserreger und Ablagerungen durch einen Prozess namens Phagozytose ^1,2 internalisieren und eliminieren. Das Phagosom, das geschlossene Kompartiment, das sich nach der Verschlingung von partikulärem Material bildet, durchläuft eine Reihe von Fusions- und Spaltungsereignissen mit endozytären Kompartimenten, die zu einem abbauenden Kompartiment führen, das als Phagolysosom bezeichnet wird. Dieses Kompartiment hat aufgrund des Erwerbs protonenpumpender v-ATPasen einen sauren pH-Wert, enthält hydrolytische Enzyme und ist mit l....