Messung von In Vitro Integration Aktivität von HIV-1 Preintegration Komplexe

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt einen in vitro Assay zur Messung der mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) präintegrierten Komplex (PIC) assoziierten Integrationsaktivität in den zytoplasmatischen Extrakten akut infizierter Zellen. Die Integration von PIC-assoziierter HIV-1-DNA in heterologe Ziel-DNA wird mit Hilfe einer verschachtelten Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsstrategie quantifiziert.

Zusammenfassung

HIV-1-Hüllproteine ​​eingreifen verwandten Rezeptoren auf der Zielzellenoberfläche, die durch die Freisetzung des viralen Capsid (CA) Kern in das Cytoplasma, gefolgt viral-Zellmembranfusion führt. Anschließend bezeichnet der virale Reverse Transkriptase (RT), als Teil eines gleichnamigen Nukleoproteinkomplex der reversen Transkription Complex (RTC), wandelt den viralen einzelsträngige RNA-Genom in eine doppelsträngige DNA-Kopie (vDNA). Dies führt zur Biogenese von anderen Nukleoprotein-Komplex, bezeichnet als die Präintegrationskomplexes (PIC), der sich aus der vDNA und assoziierter Virus-Proteinen und Wirtsfaktoren. Der PIC-assoziierten viralen Integrase (IN) orchestriert die Integration der vDNA in die chromosomale Wirts-DNA in einer zeitlich und räumlich reguliert zweistufiger Prozess. Zunächst verarbeitet die in der 3'-Enden des vDNA im Zytoplasma und zweitens, nachdem der PIC an den Kern Verkehre, sie vermittelt Integration der verarbeiteten vDNA in die chromosomale DNA. Die PICs isoliertvon Zielzellen sind akut mit HIV-1 infiziert in vitro funktionell, da sie kompetent sind den zugehörigen vDNA in eine exogen zugesetztem heterologe Ziel - DNA zu integrieren. Solche PIC-basierte in vitro Integrationstests haben die mechanistischen Details der retroviralen Integration abgrenzen und zu entdecken IN Inhibitoren beigetragen. In diesem Bericht erarbeiten wir auf einem aktualisierten HIV-1 PIC Test, der zur Messung der in vitro Integration Aktivität von isolierten nativen PICs eine verschachtelte quantitative Echtzeit - Polymerase - Kettenreaktion (qPCR) -basierte Strategie beschäftigt.

Einleitung

HIV-1-Replikation in der Zielzelle umfasst mehrere Schritte, im Großen und Ganzen gruppiert in zwei Phasen: frühe und späte Ereignisse. Die frühen Ereignisse beginnen , wenn HIV-1 sequentiell an den Oberflächenrezeptor Zielzelle bindet , CD4 und einem der beiden Co-Rezeptoren (CCR5 oder CXCR4) ^1. Folglich wird die Virus-Zellmembranen verschmelzen, und das virale Capsid (CA) Kern in das Zytoplasma ² freigegeben. Die CA Kern enthält die virale genomische einzelsträngige RNA (ssRNA) und mehrere Proteine, sowohl viralen und zellulären Ursprungs. Die CA-assoziierten viralen Proteine ​​umfassen Reverse Transkriptase (RT) und Integrase (IN), zwei Enzyme, die während der frühen Ereignisse in der viralen Replikation kritischen Schritte vermitteln. Die RT und IN - Funktion in Zusammenhang mit Nucleoprotein - Komplexe, nämlich die reverse Transkription Complex (RTC) und das Präintegrationskomplexes (PIC), die jeweils ^{3, 4, 5 , 6. Die Enden des viralen Genoms ssRNA Hafen terminal repeat (R) Elemente benachbart zu der einzigartigen Sequenzen U5 (am 5'-Ende) und U3 (am 3'-Ende). Die RTC wandelt das virale ssRNA-Genom in eine doppelsträngige (ds) DNA-Kopie (vDNA). Diese umgekehrte Transkriptionsprozess resultiert auch in Duplizierung der U5 und U3 - Sequenzen, so lange terminale Wiederholungen (LTR) an beiden Enden der vDNA 7, 8 zu erzeugen. Anschließend katalysiert das PIC-assoziiertes in zwei aufeinanderfolgenden biochemischen Reaktionen, die die Integration der vDNA in das Wirtschromosom 9, 10, 11 ermöglichen. Zuerst wird im Zytoplasma, IN Multimere Eingriff beide LTRs 12 und ein Dinukleotid aus jeder der 3'-terminalen Enden abzuspalten. Diese 3'-End - Verarbeitung erzeugt an jedem 3'-Ende (CA _OH) der vDNA eine Hydroxylgruppe.Als nächstes Verkehre PIC an den Kern, wobei in der vDNA CA _OH als Nucleophil verwendet beide Stränge der chromosomalen DNA in einer gestaffelten Art und Weise zu schneiden. Gleichzeitig Spleiße IN koordinativ an beiden Enden der vDNA der resultierenden Phosphodiesterbindungen auf gegenüberliegenden Stränge der chromosomalen DNA. Im Anschluss an diese Strangtransferschritt entfernt die Wirtszelle Maschinen die beiden ungepaarten Nukleotide am 5'-Enden der vDNA und repariert die folgenden einsträngige Lücken an der Kreuzung von der Integrationsstelle. Die frühen Ereignisse also mit der Einrichtung eines integrierten DNA-Kopie (Provirus) des HIV-1-Genoms gipfeln. Das Provirus stellt eine geeignete Umgebung für die effiziente virale Genexpression, die einschließlich der Expression der Virus-kodierten Proteinen spätere Ereignisse initiiert; Montage des unreifen Virus; und Knospung, Release und Reifung in infektiöse Virionen 13.}

Gereinigte rekombinante retrovirale IN ist zuständigdurchzuführen, in vitro, beide 3'-End - Verarbeitung und Strangtransferaktivitäten auf exogen zugeführt LTR artiges Substrat - DNA. Biochemische Untersuchungen so gereinigte rekombinante bei der Verwendung haben ergeben , kritische Aspekte der vDNA Integration ^{14, 15, 16, 17.} Jedoch anders als in natürlichen Infektion, diese in vitro biochemische Reaktion unterstützt nicht abgestimmten Integration beider Enden der Substrat - DNA in das Ziel - DNA. Im Gegensatz dazu integrieren Retrovirus PICs isoliert aus akut infizierten Zellen concertedly beide Enden des endogenen vDNA in heterologe Ziel-DNA. Dies führte zu der weit verbreiteten Annahme und nachfolgende Verfeinerungen von I n - vitro - Integration (IVI) Assays isoliert nativen PICs mit.

In der ersten berichteten retroviralen IVI-Assay, Zytoplasmaextrakte von Zellen mit einem rekombinanten Mäuse infiziertLeukemia Virus (MLV) , um das E. coli supF - Gen in seiner LTR beherberge diente als Quelle der IN - Aktivität und der DNA eines mutierten Lambda - Phagen - defekt in das lytische Wachstum wurde exogen als die Ziel - DNA zugeführt. Erfolgreiche Integration der rekombinanten DNA MLV Kopieren in die Phagen-DNA und die Expression supF anschließenden führte zur Wiederherstellung der Plaque-bildenden Fähigkeit der rekombinanten Phagen. Allerdings ist diese experimentellen Strategie ist mühsam und Maßnahmen Integration in indirekter Weise. Um solche Einschränkungen, ein Southern - Blot-basierte indirekte Endmarkierung Assay adressieren, die die PIC-assoziiertes IVI Aktivität als Maß für das endogene vDNA in exogene linearisierte Bakteriophage phiX174 - DNA integriert quantifiziert wurde ^{6 entwickelt, 7, 18.} Obwohl dieses Verfahren ein direktes Maß der Integrationsereignisse liefert, relativ hohe Mengen an PIC Herstellung erforderlich sind, was eine technisch anspruchsvolle bleibtbemühen. Um dies zu umgehen, Nested-PCR - basierte Assays erfordern nur geringe Mengen an PICs wurden ^{4, 5 entwickelt, 19.}

In diesem Bericht beschreiben wir eine aktualisierte Version von einer verschachtelten PCR-basierten In - vitro - Methode entwickelt , um die HIV-1 - PIC-vermittelte Integration Aktivität zu rekapitulieren während einer natürlichen Infektion auftreten. Diese Methode verwendet die zytoplasmatischen Extrakten von HIV-1-infizierten Zielzellen als eine Quelle für endogene PIC-Aktivität, die mit einem quantitativen Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) gemessen wird. Die Verfahren für die PICs zu isolieren und ihre Integrationsaktivitäten Messung angepasst sind, mit Modifikationen, von Protokollen , die vom Engelman Labor veröffentlicht ^20. In diesem Verfahren wird die PIC-assoziiertes Integrations Aktivität initiiert durch eine exogene lineare Ziel - DNA ²¹ bietet, und die DNA - Produkte ausDiese Integrationsreaktion werden gereinigt und als Ausgangsmaterial für die nachfolgende PCR-basierte Quantifizierung verwendet. In der ersten Runde konventionellen PCR, die viral-Ziel-DNA-Übergänge unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert. In der zweiten Runde qPCR, LTR-spezifische Primer verwendet werden, um spezifisch die vDNA Bevölkerung aus der ersten Runde der PCR-Produkte bereichern. Bitte beachten Sie die Protokollabschnitt für eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens.

In - vitro - Studien mit retroviralen PICs haben zu erheblichen Fortschritten im Verständnis des Mechanismus der retroviralen DNA - Integration und in der Entwicklung von IN Inhibitoren geführt. Basierend auf der jüngsten verstärkten Fokus auf Mapping-HIV-1-Integrationsstellen, die Rolle von viralen und Wirtsfaktoren in HIV-1-Integration zu bestimmen und die Entwicklung neuer antivirale Medikamente gegen Arzneimittelresistenz Bekämpfung erwarten wir ein verstärktes Interesse an und weit verbreiteten Einsatz von IVI-Assays , wie die in diesem Bericht beschrieben ein. Dies wiederum, führt zuZukunft Verfeinerungen bei dem Verfahren Diversifizierung dadurch den Umfang seiner Anwendungen.

Protokoll

1. Virus-Produktion

HINWEIS: Um die hohe Titer von infektiösen HIV-1 erzeugen, transfizieren die menschliche embryonale Nieren (HEK) Zelllinie 293T mit einem infektiösen HIV-1 molekularen Klon ein aktiviertes Dendrimer-basierten Transfektionsreagenz verwenden. Es wurde beobachtet, dass das Calciumphosphat-Transfektionsverfahren vergleichbare Ergebnisse ergibt.

1. In einer biologischen Sicherheitsstufe 2 (BSL2) lab, seed 3 x 10 ⁶ 293T - Zellen pro 10 cm - Schale in 8 ml Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) , ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), Penicillin und Streptomycin. Kultur die Zellen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO ₂ O / N.
2. Am nächsten Tag für Zellen in jeder 10 cm - Schale Transfizieren verdünnen 8 ug pNL4-3 Plasmid DNA (Materials Tabelle) bis zu einem Endvolumen von 300 & mgr; l DMEM fehlt Serum und Antibiotika. In 80 ul des Transfektionsreagenz, gut mischen durch Pipettieren, und Inkubation bei RTVon 5 bis 10 min für die Transfektion Komplexbildung.
3. Entfernen Sie das Medium aus den Schalen von Aspiration und 7 ml pro Schale mit frischem DMEM, das Serum und Antibiotika.
4. In 1 ml DMEM, das Serum und Antibiotika zur Transfektion komplex, mischen durch Pipettieren, und fügen Sie diese Mischung auf die Zellen. Vorsichtig schwenken die Schale gleichmäßige Verteilung der Transfektion Komplexe zu erleichtern.
5. Unmittelbar übertragen Sie die Zellen an die BSL3 - Labor, in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO _2, und die Kultur der Zellen für 48 h.
6. Sammeln Sie die virushaltige Gewebekulturüberstand mit einer Pipette und dann übertragen sie in ein Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren und Schutt, und filtern dann den Überstand durch ein 0,45 & mgr; m Porengröße Spritzenfilter.
7. Um jegliche Übertrags Plasmid-DNA in diesem zellfreien Viruspräparation zu beseitigen, Behandlung mit DNase 1 (20 ug / ml) bei 37 ° C für 1 h.
8. Zur Quantifizierung derHIV-1 - Titer, verwenden Sie die p24-spezifische Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA), da es eine schnelle und zugänglich Methode für den Routineeinsatz ²² ist.
   HINWEIS: Es sollte beachtet werden, dass die p24-ELISA die physikalische Titer (Anzahl der Viruspartikel) misst. Alternativ liefert das Virus-assoziierten RT-Aktivität messen (exogenen RT-Assay) oder Virus-Infektiosität (TZM-bl Indikatorzellleitungsbasierte Infektiosität-Assays) exclusive Auslesung von infektiösen Viruspartikeln.

2. Virus-Infektion von Sup-T1-Zellen (BSL3 Lab)

1. In einem BSL2 lab pflegen Sup-T1 - Zellen zwischen 1,0 x 10 ⁶ und 2,0 x 10 ⁶ Zellen / mL in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium , ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, Penicillin und Streptomycin (Aufteilungsverhältnis von 1 : 2 alle 2 - 3 d). Pool die Sup-T1-Zellen aus den Kulturflaschen, gut mischen durch Pipettieren und bestimmen die Lebendzellzahl durch eine Zählkammer und die Trypanblau staining Verfahren.
   1. Bereiten Sie die erforderliche Anzahl von Aliquoten von 80 x 10 ⁶ Zellen (pro Virusinfektion) in 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen.
   2. Zentrifugation der Zellen in einem Schwenkbecherrotor bei 500 xg und 25 ° C für 5 min. Ohne das Zellkulturmedium entfernt wird, übertragen die Röhrchen pelletierten Zellen zur BSL3 lab für die weitere Verarbeitung enthält. aspirieren vorsichtig das Zellkulturmedium aus dem Rohr, ohne das Zellpellet zu stören.
2. Fügen Sie eine angemessene Menge an DNase I behandelten Virusinokulum zu den Zellen in das Röhrchen und mischen Sie gut durch vorsichtiges Pipettieren. 80 x 10 ⁶ Zellen, verwendet werden 30 ml DNase I-behandelte Virus (50 & mgr; g p24-Äquivalent - Virus).
   HINWEIS: Isolation von funktionellen PICs erfordert die Zielzellen mit sehr hohen Multiplizitäten der Infektion zu infizieren (MOI).
3. Verteilen Sie die Mischung gleichmäßig zwischen zwei 6-Well - Gewebekulturplatten (dh 12 x 2,5-ml - Anteile; verwenden 2 Platten pro InfektIon).
4. Für spinoculation, legen Sie die Kulturplatten in Plattenträger und Zentrifuge eine Schwingbecherrotor bei 480 × g und 25 ° C für 2 h verwendet wird.
5. Inkubieren der spinoculated Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 5 Stunden.

3. Ernte und Lyse von infizierten Zellen (BSL3-Labor)

1. Pool der Zellen jeder Infektion entspricht, von den Kulturplatten in ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (ca. 30 ml insgesamt).
2. Ernte der Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg und 25 ° C für 10 min. Vorsichtig absaugen (verwenden Sie alternativ mit einer Pipette) den Überstand aus dem Rohr.
3. Um jegliche Restviruspartikel zu entfernen, Waschen jedes Zellpellet durch Zugabe von 2 ml Puffer K ^{- / -} (150 mM KCl, 20 mM HEPES, pH 7,6, 5 mM MgCl ₂₎ und Zentrifugieren der Probe bei 300 xg und 25 ° C für 10 Minuten. Dann, ohne das Pellet zu stören, entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Absaugen oder durch eine Pipette.
4. Repeat Schritt 3.3.
5. Entfernen Sie vorsichtig restliche Puffer von einer Mikropipette. Resuspendieren jedes Zellpellet in 2 ml eiskaltem Lysepuffer K ^{+ / +} (Puffer K ^- / ^- mit 0,025% Digitonin ergänzt, 1 mM DTT, 20 ug / ml Aprotinin), mischen Inhalt durch vorsichtiges Pipettieren, und in ein 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen.

4. Herstellung von Cytoplasma-PICs (BSL3-Labor)

1. Rock die Proben auf einem Rotationsschüttler bei RT für 10 min.
2. Zentrifugiere die Proben mit dem Rotor vorgekühlt auf 4 ° C, bei 1500 xg und 4 ° C für 4 min.
3. Ohne das Pellet zu stören, übertragen sorgfältig den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere bei 16.000 xg und 4 ° C für 1 min.
4. übertragen Sie vorsichtig den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Hinzufügen RNase A (20 mg / mL) auf eine Endkonzentration von 20 ug / ml (2 & mgr; l für 2 ml PICs) und Inkubieren der Inhalt bei RT für 30 min (kein rocking).
5. Hinzufügen , Saccharose (60% w / v in Puffer K ^{- / -)} bis zu einer Endkonzentration von 7% und gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren. Bereiten Sie Aliquoten (zB 200 & mgr; l) der PICs in Mikrozentrifugenröhrchen, flash-freeze in flüssigem Stickstoff, und in einem -80 ° C Gefrierschrank für die Langzeitlagerung.

5. In - vitro - Integration (IVI) Tests unter Verwendung von HIV-1 PICs

1. Bereiten Sie die Ziel-DNA in der IVI-Assay verwendet, indem ein 2,0 kb-Region von der phiX174 Plasmid-DNA mit PCR Amplifikation unter Verwendung von maßgeschneiderten Primern, phiX174-F und phiX174-R.
   1. Bauen Sie die PCR - Gemisch , wie in Tabelle 1 beschrieben. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler die thermischen Zyklusbedingungen unter Verwendung der in Tabelle 2 empfohlen. Gel-Reinigung des PCR-Produktes unter Verwendung eines Gel-Reinigungskits (nach vom Hersteller empfohlenen Protokoll), und speichern die gereinigten Ziel-DNA als Aliquots bei -80 ° C bis zur Verwendung.
2. In 600 ng der Ziel-DNA zu 200 - & #181 L aliquote Menge von PICs, gut mischen und für 45 Minuten bei 37 ° C inkubiert.
   Hinweis: IVI Reaktionen Ziel - DNA Weglassen oder einschließlich eines Integrase - Inhibitor (zB Raltegravir) sind Kontrollreaktionen empfohlen.
3. Beenden Sie die Reaktion durch Zugabe von IVI SDS, EDTA und Proteinase K bis zu Endkonzentrationen von 0,5%, 8 mM und 0,5 mg / ml. Mischen Sie die Reaktionsinhalt gründlich und Inkubation über Nacht bei 56 ° C.
4. Am nächsten Tag, reinigen die Gesamt-DNA aus dem IVI Reaktion durch Phenol / Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung. Führen Sie alle Zentrifugationsschritte bei 16.000 xg und RT.
5. Fügen Sie ein gleiches Volumen an Phenol zur entproteinierte Probe, mischen kräftig durch Verwirbelung und Zentrifuge für 2 min. Entfernen Sie vorsichtig die obere wässrige Phase und übertragen sie in ein frisches Röhrchen.
6. Wiederholen Sie Schritt 5.5. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen.
7. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 1: 1 Phenol: Chloroform-Mischung, mischen kräftig durch Verwirbelung und Zentrifuge for 2 min. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen.
8. Fügen Sie ein gleiches Volumen Chloroform, kräftig mit Verwirbelung und Zentrifuge für 2 min. Übertragen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen.
9. DNA auszufällen, fügen Glykogen auf eine Endkonzentration von 0,1 & mgr; g / & mgr; l, 3 M Natriumacetat bis zu einer Endkonzentration von 0,3 M und 2,5 Volumina 100% igem Ethanol (eiskaltem). Vortex mischen, Zentrifuge kurz den Inhalt zu sammeln, und legen Sie den Schlauch bei -80 ° CO / N.
10. Am nächsten Tag zentrifugieren der Probe für 30 min bei 16.000 xg und 4 ° C für 30 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören.
11. Hinzufügen 500 & mgr; l von 80% Ethanol (eiskaltem) zu dem Pellet und Zentrifuge bei 16.000 xg und 4 ° C für 10 min. Luft trocknen den DNA-Pellet bei RT und gründlich in 50 ul Nuklease-freies Wasser suspendieren. Speichern der DNA-Proben bei -20 ° C.

6. PCR Assays für die Quantifizierung von PIC Aktivität

HINWEIS: Die Kopienzahl von HIV-1-DNA der Ziel-DNA integriert in eine nested PCR Strategie quantifiziert wird, die zwei Sätze von Primern und 2 aufeinanderfolgende Runden der PCR verwendet.

1. Führen der ersten Runde konventionellen PCR unter Verwendung von Primern, die das virale LTR und die phiX174 DNA (LTR und phiX174 Primern, jeweils) Targeting die Übergänge der integrierten HIV-1-DNA zu amplifizieren.
   1. Bauen Sie die Erstrunden-PCR - Gemisch , wie in Tabelle 3 beschrieben. Bauen Sie einen Master-Mix aller Komponenten der Matrizen-DNA auszuschließen, verzichten 45-ul-Aliquots in separate PCR-Röhrchen, und mit 5 & mgr; l Template-DNA oder Nuklease-freies Wasser (Kontrolle).
   2. Führen Sie die PCR in einem Thermocycler die thermischen Zyklusbedingungen unter Verwendung der in der Tabelle empfohlen 4.
2. Führen der zweiten Runde qPCR unter Verwendung von Primern, die einen kurzen Bereich des viralen LTR (LTR-R und LTR-U-Primer) flankieren, um selektiv die integrierte vDNA Sequenzen aus dem ersten ro amplifizierenund PCR-Produkte. Um die integrierten vDNA Kopienzahlen bestimmen, um eine Standardkurve zu erzeugen um den Faktor 10 Reihenverdünnungen von bekannten Kopienzahlen (zB 10 ⁰ - 10 ⁸⁾ des HIV-1 molekularen Klon.
   1. Montieren Sie die zweite Runde qPCR Mischung , wie in Tabelle 5 beschrieben. Bauen Sie einen Master-Mix aller Komponenten der Matrizen-DNA auszuschließen, sorgfältig verzichtet werden 25 & mgr; l-Aliquots in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen in einer 96-Well-PCR-Reaktionsplatte, und fügen Sie dann 5 ul der ungereinigtem ersten Runde PCR-Produkte oder Nuklease-freies Wasser (steuern). Führen Sie alle qPCR Reaktionen in dreifacher Ausfertigung.
   2. Laden Sie die PCR - Platte in die Echtzeit - PCR - Instrument und führen qPCR mit den Zyklusbedingungen empfohlen in Tabelle 6.
   3. Analysieren Sie die Daten, die eine geeignete Software.

Ergebnisse

Isolierung von HIV-1 PICs

Ein Schema des Protokolls für die Isolierung von HIV-1 PICs von akut infizierten Sup-T1 - Zellen verwendet , ist in Abbildung 1 dargestellt. Dieses Protokoll wird von den Methoden von Engelman et al beschrieben abgeleitet. ^{19, 20.} HIV-1 PICs sind Nucleoprotein - Komplexe , die in infizierten Zellen zu...

Diskussion

Biochemische Analysen von retroviralen PICs haben kritische Einblicke in den Mechanismus der retroviralen DNA-Integration zur Verfügung gestellt. Die Messung der Integration Aktivität von retroviralen PICs kann durch die Bildung von Plaque-Assay, Southern-Blot-Analyse und verschachtelte qPCR erreicht werden. Die experimentelle Strategie der Plaque - Assay ist arbeitsaufwendig , und verwendet eine indirekte Methode ⁶ Integration zu ^{messen, 7,}

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fötales Rinderserum (FBS)	GIBCO/Invitrogen	10437-028
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (Hi-FBS)	GIBCO/Invitrogen	10438-026
Dulbecco" s modifizierter Eagle" s medium (DMEM)	GIBCO/Invitrogen	11995-065
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	GIBCO/Invitrogen	11875-093
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) (1x)	GIBCO/Invitrogen	20012-027
Trypsin-EDTA (0,25%)	GIBCO/Invitrogen	25200-056
Penicillin-Streptomycin-Lösung (100x)	Cellgro/Mediatech	30-002-CI
HEK293T Zellen (293T)	American Type Culture Collection (ATCC)	CRL-3216
HIV-1 proviraler molekularer Klon pNL4-3	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	114
PolyFect Transfektionsreagenz	Qiagen	301107
DNase 1	Calbiochem/Merckmillipore	260913
Sup-T1-Zellen	American Type Culture Collection (ATCC)	> CRL-1942
HEPES pH 7,2 - 7,5 < p>(gebrauchsfertige Lösung)	GIBCO/Invitrogen	15630-080
Kaliumchlorid (KCl)-Lösung	Sigma-Aldrich< /p>	60142
Magnesiumchlorid (MgCl2) Lösung	Sigma-Aldrich	M1028
Dithiothreitol (DTT)	Sigma-Aldrich	43815
Aprotinin	Sigma-Ald	A6106
Digitonin	Sigma-Aldrich	D141
RNase A	Invitrogen	12091-021
Saccharose	Sigma-Aldrich	S0389
phiX174 Replikative Form 1 DNA	Promega	D1531
PhiX174-F Grundierung: 5'-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3' PhiX174-R Grundierung: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen und/oder IDT-DNA
dNTP mix	Promega	U1515
Go Taq DNA Polymerase	Promega	M3005
Qiaquick Gel-Extraktionskit	Qiagen	28706
Reinstes destilliertes Wasser	Invitrogen	10977-015
Tris-EDTA (TE) Puffer (100x)	Sigma-Aldrich	T9285
Natriumdodecylsulfat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771
Ethylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz (EDTA)-Lösung, 0,5 M, pH 8,0	Sigma-Aldrich	E7889
Proteinase K (gebrauchsfertige Lösung 20 mg/ml)	Qiagen	19131
Phenol (äquilibriert mit 10  mM Tris HCl, pH  8.0 und 1  mM EDTA)	Sigma-Aldrich	P4557
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
Glykogen (5 mg/ml Lösung)	Ambion/Invitrogen	AM9510
Natriumacetat (3 M, pH 5,2)	Sigma-Aldrich	S7899
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Erste Runde LTR-Grundierung: 5'-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3' Erste Runde phiX174 Primer: 5'-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3'	Invitrogen und/oder IDT-DNA	---
Zweite Runde LTR-R Primer: 5'-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3' Zweite Runde LTR-U Fibel: 5'-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3' Taqman-Sonde der zweiten Runde:   5'-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3'	Invitrogen und/oder IDT-DNA	---
iQ Supermix	Bio-Rad	170-8862