Effiziente Sporulation von Saccharomyces cerevisiae In einer 96-Multiwell-Format

Zusammenfassung

Hier wird die Sporulation von Saccharomyces cerevisiae in einem 96er Multiwell-Format durchgeführt.

Zusammenfassung

In Zeiten von Ernährungsstress durchläuft Saccharomyces cerevisiae eine Gametogenese, die als Sporulation bekannt ist. Diploide Hefezellen, die an Stickstoff und Kohlenstoff hungern, leiten den Sporulationsprozess ein. Der Prozess der Sporulation umfasst die Meiose, gefolgt von der Sporenbildung, bei der die haploiden Kerne in umweltresistente Sporen verpackt werden. Wir haben Methoden für die effiziente Sporulation von knospenden Hefen in 96 Multiwell-Platten entwickelt, um den Durchsatz von Screening-Hefezellen auf Sporulationsphänotypen zu erhöhen. Diese Verfahren sind kompatibel mit dem Screening mit Hefe, die Plasmide enthält, die eine Nährstoffselektion erfordern, wenn geeignete Minimalmedien verwendet werden, oder mit dem Screening von Hefe mit genomischen Veränderungen, wenn ein reichhaltiges Präsporulationsschema verwendet wird. Wir sind der Meinung, dass bei dieser Methode die Belüftung während der Sporulation entscheidend für die Sporenbildung ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Belüftung zu gewährleisten, die mit dem 96-Multiwell-Plattenformat kompatibel sind. Obwohl diese Methoden nicht das typische ~80%-Sporulationsniveau erreichen, das in großvolumigen Kolben-basierten Experimenten erreicht werden kann, erreichen diese Methoden zuverlässig ein Sporulationsniveau von etwa 50-60% in kleinvolumigen Multiwell-Platten.

Einleitung

Sporulation in der Bäckerhefe wurde untersucht , Einblicke in viele Aspekte der Biologie zu schaffen, einschließlich der Kontrolle der Chromosomensegregation während der Meiose ^1, Mechanismen der genetischen Rekombination ^2, die Kontrolle der Entwicklung von Zelle ³ Signalisierung, Ernährungs - Management von Entwicklung ^4, die Transkriptions Regulierung der Entwicklung ⁵ und die Prüfung der Sporenbildung ^6. Sporenbildung beinhaltet eine neuartige Zellteilung Ereignis die Bildung neuer Membran Kompartimente innerhalb der Mutterzelle durch Abscheiden einer Schutzsporenwand ⁶ gefolgt beteiligt sind . Diese Studien , die sporulierendem Zellen oft nutzen die schnell sporulierendem Hefestamm SK1 zu untersuchen, die den Prozess der Sporulation in etwa 24 Stunden in einem relativ effiziente Art und Weise ^7,8 eingehen können. Obwohl die Optimierung der Sporulationsbedingungen für Hefe - Knospung haben ^9-13 beschrieben worden ist , diese Experiments geprüft Sporulation auf festen Medien oder in größerem Maßstab flüssige Kulturen, in denen die Sporenbildung durchgeführt wird Kulturröhrchen oder Kolben verwendet wird.

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur sporulierenden Hefe in einem 96-Multiwell-Platten-Format. Wir finden, dass für dieses Verfahren, Belüftung für synchrone und effiziente Sporulation kritisch ist, und haben Techniken entwickelt, um eine ausreichende Sporulation ein kleinvolumiger Multiwell-Format zu gewährleisten. In einer 96 Multi - Well - Plattenformat sporulierendem ermöglicht Zellen für eine Multi - Well - Plattenformat, wie zum Screening für eine hohe Kopien Suppressoren mit einem gekachelten Bibliothek ^14-16 optimierte Hochdurchsatztechniken und unter Verwendung von Reagenzien zu sehen sein.

Protokoll

1. Vorbereitung für Sporulation

. Anmerkung: Die Medien in diesem Protokoll beschrieben werden , hergestellt unter Verwendung Standardrezepturen und -verfahren ^13,17 Tabelle 1 gibt die Formulierung für 1 L der verschiedenen Medien in diesem Protokoll verwendet.

	Bactopepton	Hefeextrakt	Bacto Agar	Traubenzucker	KALIUMACETAT	Glycerol	ddH 2 O
YPG-Platten	20 g	10 g	20 g	-	-	30 ml	970 ml
YPD-Platten	20 g	10 g	20 g	20 g	-	-	1,000 ml
YPD Flüssigkeit	20 g	10 g	-	20 g	-	-	1,000 ml
YPA Flüssigkeit	20 g	10 g	-	-	20 g	-	1,000 ml
Sporulation Medien	-	-	-	-	10 g	-	1,000 ml

Tabelle 1:. Medienformulierungen Die Beträge werden für 1 l Medien gegeben. Einzelheiten über MedienZutaten können in der Materialtabelle.

1. Wenn alle sporulierendem Zellen die gleichen Genotyps sein, gehen Sie folgendermaßen vor:
   1. Thaw Hefestamm auf einem YPG (YPGlycerol) Platte verwendet werden. Wachsen Hefe für 12-16 h bei 30 ° C. Wichtig ist, dass SK1 Zellen auch sollte, so SK1 Stämme zur Sporulation balanciert nicht zu lange auf YPG-Platten belassen werden, oder sie können auf der Platte sporulieren.
      Hinweis: Ein frisch aufgetauten Belastung auf YPG gezüchtet wird bevorzugt, wie Verwendung von Glycerin als Kohlenstoffquelle oxidative Phosphorylierung benötigt, und wählt somit für Zellen, die funktionelle mitochondrialen DNA aufweisen. SK1 Zellen haben eine Tendenz, funktionelle Mitochondrien-DNA zu verlieren und petites. Funktionelle mitochondrialer DNA ist für die Sporenbildung benötigt.
   2. Streak Hefe aus der YPG Platte auf eine YPD (YPDextrose) Platte für einzelne Kolonien. Wachsen Hefe auf YPD-Platte 24-28 h bei 30 ° C.
   3. Nach etwa 36 bis 48 h Wachstum auf YPD festen Medien, starten Sie eine 25 ml YPD-Kultur eine einzige Kolonie mitvon der YPD Platte. Wachsen diese Kultur , bis die Zellen etwa OD ₆₀₀ = 4,0 bis 7,0 liegen. Führen Sie diesen Schritt bei 30 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln.
   4. Von der YPD - Kultur, eine entsprechende Menge an Zellen verwenden , um 1000 ml YPA (YPAcetate) Kultur beginnen , die OD ₆₀₀ = 0,1 für jede 96 - Well - Platte Bedarf in Abschnitt 2. wachsen Hefe in einem 30 ° C Schüttelinkubator ist (bei ​​220 Schütteln rpm) , bis die Kultur OD ₆₀₀ zwischen 1,3 bis 1,5 ist.
      Hinweis: Impfen 100 ml YPA Kultur für jede 96 Multiwellplatte in Abschnitt 2. Zum Beispiel zu sehen sein, wenn vier 96 Mikrotiterplatten Screening, 400 ml YPA Kultur benötigt. Beginnend mit 10% mehr Volumen in der YPA Kultur ist notwendig, gegen Verdunstungsvolumenverlust zu schützen. Typischerweise wird es zwischen 12 bis 16 Stunden dauern , Zellen , die die entsprechenden OD ₆₀₀ zu erreichen; die Zeit kann in Abhängigkeit vom Genotyp des Hefestamm variieren. YPA ist die presporulation Medien. Pregrowthin Acetat hilft Expression von Genen (wie IME1) induzieren für einen effizienten und synchronen Sporulation ⁶ benötigt.
   5. Spin bei 1.800 xg in einer Tischzentrifuge für 5 min Zellen in YPA gewachsen zu pelletieren. Waschen Sie die Zellen 1x mit 0,5 Volumen sterilen autoklaviert entsalztem Wasser. Spin wieder, und entsorgen Sie waschen. Die Zellen in 1x Volumen Sporulation Medien. Weiter zu Abschnitt 2.
2. Bei Verwendung von Zellen für die Sporulation , die von verschiedenen Genotypen sind, (dh transformiert mit verschiedenen Plasmiden oder verschiedene Mutationen enthalten, in der Regel erhalten , und als gefrorene Vorräte gespeichert), array Zellen der verschiedenen Genotypen in eine 96 - Multiwell - Format. Dann gehen Sie folgendermaßen vor:
   1. Verwenden Sie eine sterile 96 Zinke Frogger Zellen aus aufgetauten gefrorenen Bestände in 96 Multiwellplatte zu übertragen (s) auf YPG festen Medien. Wachsen Hefe über Nacht bei 30 ° C.
   2. Mit einem sterilen 96 Zinke Frogger, Transfer-Zellen von YPG festen Medien auf YPD feste Medien oder selektivefeste Medien (dh synthetische Minimalmedien Aminosäuren fehlen, wenn die Zellen Plasmide enthalten , die Auswahl benötigen). Hefe wachsen bei 30 ° C bis Kolonien für jeden Stamm gebildet werden, typischerweise 1 Tag auf YPD und 2 Tage, wenn selektiven Medien notwendig.
   3. Aliquot 1,2 ml YPD flüssigen Medien oder selektive flüssige Medien in jede Vertiefung einer 96 tief 2 ml Multiwellplatte. Transfer-Zellen aus festen Medien in flüssige Medien ein Frogger mit, Deckel mit einem Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten und wachsen über Nacht in 30 ° C Schüttler bei 220 Umdrehungen pro Minute schütteln.
      Hinweis: Zur Minimierung von Verschmutzung, Abdeckplatten mit den Kunststoffdeckel aus einem rechteckigen Petrischale. Halten Deckel anstelle ein Stück Klebeband, so dass die Luftzirkulation minimal eingeschränkt ist.
   4. Zentrifugenplatten bei 1.800 × g für 5 min, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen Sie Medien von Zellen; Add 500 ul YPA in jede Vertiefung und resuspendieren in der YPA pelletierten Zellen. Abdeckungmit Kunststoffdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten.
   5. Wachsen Zellen für 15 Stunden bei 30 ° C in einem Schüttelinkubator bei 220 rpm schütteln. Weiter zu Abschnitt 2.

2. sporulierendem Zellen in einer 96-Multiwell-Format

1. Fügen Sie entweder ein 3 mm sterilen festen Glasperle oder eine sterile 5 mm x 2 mm magnetischen Rührstab in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 1,3 ml Brunnen. (Siehe Repräsentative Ergebnisse unten für eine Diskussion darüber , ob eine Perle oder einen Rührstab zu verwenden.)
2. Wenn alle Zellen des gleichen Genotyps gescreent werden, um 2.2.1 gehen. Wenn Zellen von verschiedenen Genotypen gescreent werden, um 2.2.2 gehen.
   1. Nehmen Sie Zellen aus Schritt 1.1.5 und aliquoten 500 ul Zellen plus Medien in jede Vertiefung der 96 Multi-Well-Platte. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3.
   2. Spin-Zellen, die für 5 min in YPA von 1.2.4 bei 1.800 xg sind, eine Schwingbecherzentrifuge mit Adapter mit 96-Well-Platten aufzunehmen. Gießen vonf Medien aus Zellen. Hinzufügen 500 ul Sporulation Medium zu jeder Vertiefung gegeben und resuspendieren pelletierten Zellen in der Sporulation Medien. Abdeckung mit Plastikdeckel an Ort und Stelle durch ein Band gehalten. Gehen Sie zu 2.3.
3. Bei Verwendung einer Glasperle, Platz Proben in einem Schüttelinkubator bei 30 ° C und Schütteln bei 220 Umdrehungen pro Minute für die Sporenbildung. Wenn eine magnetische Rührstab verwenden, Ort Proben auf einer Rührplatte innerhalb einer 30 ° C-Inkubator für Sporulation.
   Hinweis: Die genaue Rührgeschwindigkeit für die magnetischen Rührstäbe nicht sehr wichtig ist, solange alle Balken bewegen sich energisch und die Kultur belüftet wird.
4. Zu überwachen, die Progression durch Sporulation werden Proben aus der Kultur sporulierenden zur Visualisierung, In 6 ul von Zellen aus der sporulierenden Kulturen auf 24 & mgr; l der Sporulation Medium in einer 96-Well-Deckplatte (1: 5-Verdünnung). Lassen Sie Zellen für 5 Minuten absetzen, bevor Zellen mit einem inversen Mikroskop zu untersuchen.
   Hinweis: In Wildtyp-SK1 Zellen, kompakt reifen Sporen von 3 bilden6 Stunden nach der Übertragung auf die Sporulation Medien. Progression durch Sporulation kann durch Mikroskopie unter Verwendung von fluoreszierenden Markern, wie beispielsweise ein Kernmarker (dh HTB2-mCherry ¹⁸⁾ zu untersuchen , die meiotische Teilung oder eine prospore Membranmarker (dh G20 ¹⁹⁾ zu untersuchen sporen Morphogenese überwacht werden. Alternativ kann die Bildung von refractile Sporen Nomarski DIC-Mikroskopie beginnend etwa 12 Stunden nach dem Transfer auf die Sporulation Medien gesehen werden.

Ergebnisse

Um dieses Protokoll Beurteilung Sporulation Effizienzen aus sporulierenden Zellen in Multi - Well - Platten erhalten (wie oben beschrieben) wurden im Vergleich zu Zellen sporuliert Verwendung größerer Volumen in den Flaschen (Tabelle 2). Die Verwendung von Multiwell-Platten nicht erreicht die hohe Effizienz gesehen, wenn in Flaschen sporulierenden, wobei ~ 80% Wirkungsgrad routinemäßig gesehen werden kann. Sporulierendem in Mikrotiterplatten mit der richtigen Belüftung (...

Diskussion

Hier präsentieren wir ein Protokoll für sporulierendem SK1 Hefe in einem 96 Multi-Well-Format. Belüftung ist der Schlüssel für die effiziente Sporulation, die die Verwendung von entweder einem Rührstab oder einer Glasperle in jeder Vertiefung erfordert. Wenn Zellen ohne entweder in einer 96-Mikrotiterplatte in einem Schüttelinkubator sporulierten sind eine Perle oder einem Rührstab, Sporulation nicht effizient Zellen. Nur ein geringer Anstieg der Sporulationseffizienz gesehen wird , wenn Zellen ohne entweder einen Wulst...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nunc 1,3 ml DeepWell Platten	ThermoScientific	260251	Für die Sporulation
Nunc 2,0 ml DeepWell Platten	ThermoScientific	278743	Für das Wachstum vor der Sporulation, Schritt 1.2.3
3 mm Glasperle	Fisher	11-312A	Für die Sporulation
5 mm x 2 mm Rührstab, Packung mit 12	Stück Fisher	14-511-82	Für die Sporulation
96 gut frogger	V& P Scientific	VP407	benötigt für Schritt 1.2
Bibliothekskopierer	V& P Scientific	VP381	wird für Schritt 1.2 benötigt; zur Verwendung mit dem rechteckigen
Petrischale	ThermoScientific	264728	wird für Schritt 1.2
benötigt Bacto Pepton	BD	211677	wird für das Medium
benötigt Hefeextrakt	BD	212750	wird für das Medium
Bacto Agar	BD	212750	wird für das Medium
Dextrose	benötigtFisher	D16-3	wird für Medien benötigt
Kaliumacetat	Fisher	P171-500	wird für Medien
Glycerin	Fisher	G33-500	wird für Medien
benötigt Schwarz 96 Well Glasbodenplatte	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	wird für Schritt 2.4 benötigt